貝萊斯芽孢桿菌TC-52的分離鑒定及其對水稻幼苗生長和立枯病的影響

李坤 洪秀杰 王欣悅 齊鵬宇 霍佳慧 于欣卉 商梓琳 畢少杰 王彥杰

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2024.10.017

摘要：為豐富可用于水稻育秧基質防治由尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）所引起的水稻立枯病的生防菌資源，從大豆根際土壤中分離得到1株對尖孢鐮刀菌有拮抗作用的細菌，對該菌株分泌的胞外酶與促生能力進行了測定，并進行菌種鑒定。同時，初步研究了該菌株的抑菌譜、對水稻幼苗的促生作用以及對水稻立枯病的防治效果。研究結果表明，菌株TC-52為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis），其對尖孢鐮刀菌抑菌率達到72.7%，其分泌的上清液和揮發性氣體都能抑制尖孢鐮刀菌的生長，并具有廣譜抑菌活性；該菌株能夠分泌蛋白酶、纖維素酶與幾丁質酶并具有固氮、產鐵載體與吲哚-3-乙酸（IAA）能力，其IAA產量達到21.70 μg/mL，耐受最低pH值達到4.0。與無菌水浸種處理相比，1.0×106 CFU/mL的菌懸液浸種，水稻胚根的生長量可提高19%；相較于未添加生防菌的育秧基質，在菌濃度為1.0×109 CFU/mL的育秧基質中種植水稻，主根長度增長了25%，側根數增加了29%，對水稻立枯病的防治效果>75%。可見，菌株TC-52在水稻育秧基質中具有促生與防病作用，有一定的開發和應用潛力。

關鍵詞：水稻立枯病；尖孢鐮刀菌；貝萊斯芽孢桿菌；生物防治

中圖分類號：S182；S435.111? 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）10-0129-08

收稿日期：2023-11-20

基金項目：黑龍江省大學生創新創業訓練計劃（編號：201910223008）；黑龍江八一農墾大學“揭榜掛帥”項目（編號：JB20220001）；資源化利用木糖渣等生產系列肥料的研發（編號：2021066）。

作者簡介：李? 坤（1997—），男，山東煙臺人，碩士研究生，從事農用微生物的篩選與應用研究。E-mail：1137021417@qq.com。

通信作者：王彥杰，博士，教授，從事農業廢棄物資源化研究。E-mail：wangyanjie1972@163.com。

自水稻旱育秧技術推廣以來，立枯病已成為水稻育苗期間的常見病害，每年發病率為10%～23%，嚴重者死苗率高達70%［1］。此外，由于氣溫波動和管理不善等因素，黑龍江省的水稻立枯病發病情況十分嚴重［2］。在實際工作中，插秧機會導致許多空穴，嚴重影響水稻的質量和產量。

水稻立枯病常分為生理性立枯病和病理性立枯病。生理性立枯病又稱水稻青枯病，是秧苗在不良環境下的吸水與蒸騰能力失調所致，會造成水稻葉片的嚴重失水，使得水稻葉片呈青灰色，根毛稀少［3］；病理性立枯病常分為3種不同的類型，即芽腐、基腐和黃枯，一般由鐮刀菌屬（Fusarium）、絲核菌屬（Rhizoctonia）、根霉菌屬（Rhizopus）、蠕孢菌屬（Helminthosporium）等病原菌侵染造成。尖孢鐮刀菌是黑龍江省水稻秧苗枯病的主要致病菌，占致病菌總量的48%左右［4］。

當前，為了預防和控制水稻立枯病，在水稻生產中通常采用化學藥劑進行拌種、浸種、包衣或者對苗床進行消毒處理。然而，長期以來過度依賴使用化學農藥必然會導致病原菌產生抗藥性，同時也對農田環境造成嚴重破壞，最終導致農產品質量和產量下降，甚至對食品安全形成威脅［5-6］。因此，這種做法不利于實現水稻立枯病的可持續防治。與之相反，生物防治具有環境友好、不易產生抗藥性等特點，正漸漸地成為水稻立枯病防治的發展趨勢。微生物菌劑也有望成為理想的可替代或部分替代化學農藥的產品之一。

目前有報道指出采用浸種或拌種的方式施用微生物菌劑，在防病方面取得了顯著的效果。例如，李敏等利用哈茨木霉分生孢子粉和多菌靈按照6 ∶4的比例拌種水稻，水稻立枯病防治效果達到了82%［7］；Limtong等利用附生酵母菌浸泡水稻種子，對水稻苗期出現的爛苗現象的防治效果達到100%［8］。另一部分報道則采用噴施的方式施用微生物菌劑，也達到了較好的防病效果。例如，李鑫杰等利用寡雄腐霉可濕性粉劑的6 000倍液分別于水稻秧苗的立針期和2葉期噴施，使得防病效果達到90%［9］；曹陽利用水稻內生菌枯草芽孢桿菌于2葉期噴施處理，使得防病效果達到74%［3］。當前報道較少采用拌土的方式施用微生物菌劑，可能是由于采用拌土的方式將微生物菌劑加入到水稻育秧基質會降低對水稻立枯病的防治效果，于文清等利用土地類芽孢桿菌來防治水稻立枯病，菌液浸種結合拌土處理，對立枯病防效達到了80%，浸種方式所產生的防治效果為74%，而拌土方式對水稻立枯病的防治效果僅有55%［10］。這可能是水稻育秧基質呈酸性，不利于生防菌株的定殖所造成，故而對病原菌的抑菌效果有所下降。

本研究欲篩選可以直接加入到水稻育秧基質中并對水稻立枯病有生防作用的菌株。以尖孢鐮刀菌為指示菌，通過采制性培養，從大豆根際土壤中篩選出對尖孢鐮刀菌具有較好拮抗效果的菌株，并對其促生效果進行研究。結合形態學觀察、生理生化鑒定及16S rRNA序列分析對其進行菌株鑒定，通過水稻催芽、盆栽試驗，對該菌株水稻立枯病的防治和促生效果進行評價，以期提供具有在育秧基質中發揮防治水稻立枯病潛力的菌株資源。

1? 材料與方法

1.1? 試驗材料

1.1.1? 土樣及病原菌

供試土壤樣品采集于黑龍江省安達市科技園區（地理位置46°24′N，125°21′E），屬于北溫帶大陸性半干旱季風氣候，海拔147～148 m，年平均日照時數為2 659 h，年平均氣溫為3.2 ℃，年際間氣溫差異不大。在常年種植大豆的田地中，用鐵鍬沿著大豆根部的生長方向盡量將植物根際完整取出，采用抖根法采集根際土壤，將附在根際上的土用毛刷全部刷下，裝入密封袋中做好標記，于4 ℃冰盒保存。所有操作均用無菌工具進行，帶回實驗室進行微生物分離和篩選。

供試病原菌：尖刀鐮孢菌（F. oxysporum）、立枯絲核菌（R. solani）、層出鐮刀菌（F. proliferatum）、串珠鐮刀菌（F. moniliforme）、禾谷鐮刀菌（F. graminearum）、大豆疫霉菌（Phytophthora sojae）、小麥全蝕病菌（Gaeumannomyces graminis）、核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）。

1.1.2? 供試培養基

LB培養基（pH值為5.0）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）（pH值為5.0）、幾丁質酶檢測培養基［11］、蛋白酶檢測培養基［12］、纖維素酶檢測培養基［12］、Ashby無氮培養基［13］、PKO無機磷培養基［14］、蒙金娜有機磷培養基［14］、鉀細菌篩選培養基［15］、CAS產鐵載體檢測培養基［16］。

1.1.3? 供試水稻種子

水稻品種為農豐1702，由黑龍江八一農墾大學農學院水稻課題組提供。

1.2? 試驗方法

1.2.1? 拮抗菌株的分離與純化

采用土壤稀釋涂布法進行分離，將所取土樣稱取10 g，配成10-4、10-5、10-6、10-7倍稀釋液，分別取100 μL涂布到LB固體培養基平板上，每個濃度梯度重復3次，于32 ℃避光培養24 h，挑取形態不同的細菌菌落于LB固體培養基上劃線純化，連續純化3次后，將所得的細菌單菌落，劃線至LB固體斜面培養基上，放入4 ℃冰箱保藏備用。

1.2.2? 拮抗菌株的初篩

將在斜面保藏的拮抗菌株于LB固體培養基上進行劃線活化后，挑取單菌落接種于LB液體培養基中，于32 ℃、150 r/min振蕩培養20 h，制成發酵培養液，并放置于4 ℃條件下貯存，用于對峙培養。在無菌工作臺中，用打孔器在已活化好的尖孢鐮刀菌平板上取5 mm菌餅接于PDA平板中央，接種后在距離病原菌菌餅2.5 cm處呈“十”字形滴加3 μL分離菌株發酵液，以接種等量LB液體培養基的處理作對照，每個處理重復3次。30 ℃培養7 d后，通過測量比較抑菌圈大小，計算抑菌率。抑菌率（V）計算公式如下：

V=（DCK-Dd）/DCK×100%。

其中：Dd為處理平板上病原菌菌落直徑，cm；DCK為對照平板上病原菌菌落直徑，cm。

1.2.3? 拮抗菌株的復篩

拮抗菌株上清液的抑菌效果測定：在無菌工作臺中，用打孔器在已活化好的尖孢鐮刀菌平板上取5 mm菌餅接于PDA平板中央，培養3 d后，在距離病原菌菌餅2.5 cm處呈“十”字形放置牛津杯，將拮抗菌株發酵培養液 10 000 r/min 離心10 min，取上清液經過0.22 μL濾膜過濾，得到無菌上清液，取無菌上清液50 μL加入牛津杯中，以向牛津杯中加入等量LB液體培養基的處理作對照，每個處理重復3次，于30 ℃恒溫培養箱中培養7 d。

拮抗菌株揮發性物質的抑菌效果測定：采用平板倒扣法［17］，在無菌工作臺中，吸取拮抗菌株發酵培養液10 μL均勻涂布于LB平板上，用打孔器在已活化好的尖孢鐮刀菌平板上取5 mm菌餅接于PDA平板中央，并將接種病原菌的PDA平板倒扣于含發酵培養液的LB平板上，密封。以在LB平板上涂布了等量的LB培養基為對照，于30 ℃恒溫培養箱中培養7 d，計算抑菌率。

1.2.4? 拮抗菌株幾丁質酶、蛋白酶與纖維素酶活性測定

將保藏的拮抗菌株劃線接種于LB固體培養基上并于32 ℃生長活化24 h后，用無菌接種環挑取單菌落分別點接于幾丁質酶、蛋白酶與纖維素酶檢測培養基上，每個處理重復3次，于32 ℃恒溫培養箱中培養3 d，其中纖維素檢測培養基需用1 mg/mL的剛果紅溶液將整個培養皿浸沒染色30 min，再用1 mol/L的氯化鈉溶液洗滌，觀察3個檢測培養基的透明圈。根據HC值判斷酶活性大小，酶活性與HC值呈正相關，HC值計算公式如下：

HC=D/d×100%。

其中：D為胞外酶檢測培養基上透明圈直徑，cm；d為胞外酶檢測培養基上菌落直徑，cm。

1.2.5? 拮抗菌株的促生性研究

參照余涵霞等的方法［13］，通過菌株能否在無氮培養基上生長判斷菌株有無固氮能力。參照代志等的方法［14］，通過菌株在PKO無機磷和蒙金娜有機磷培養基上有無透明圈判斷菌株有無溶磷活性。參照吳紅艷等的方法［15］，通過菌株解鉀培養基上有無透明圈判斷菌株有無解鉀活性。參照李冬瑩的方法［16］，通過菌株CAS產鐵載體培養基上有無透明圈判斷菌株有無產鐵載體能力。參照張昊鑫等的方法［18］判斷菌株是否能分泌吲哚乙酸（IAA）。參照Glickmann等的方法［19］對菌株產IAA能力進行定量檢測。

1.2.6? 拮抗菌株的生物學相關特性測定

1.2.6.1? 生長pH值范圍測定

將LB液體培養基的pH值分別調整為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13，取1 mL發酵液接種于不同pH值的LB液體培養基中，32 ℃、150 r/min培養30 h后取樣，測定樣本的D600 nm，每組重復3次。

1.2.6.2? 形態學及生理生化鑒定

將篩選出的拮抗菌株在LB培養基上劃線接種，32 ℃培養24 h，觀察篩選出的拮抗細菌單個菌落的形態、大小、顏色、干濕、光滑或粗糙等。根據《伯杰細菌鑒定手冊》《常見細菌系統鑒定手冊》的方法，對拮抗細菌進行硫化氫試驗、明膠液化試驗、苯丙氨酸脫氫酶試驗、淀粉水解試驗、Voges-Proskauer試驗、硝酸鹽還原試驗、甲基紅試驗、吲哚試驗、接觸酶試驗、酪素水解試驗，并進行革蘭氏染色［20-21］。

1.2.6.3? 分子生物學鑒定

拮抗菌株DNA的提取：挑取單菌落菌株接種于LB液體培養基中，于32 ℃、150 r/min 培養18 h后得到發酵培養液，按照天根生化細菌基因組DNA提取試劑盒要求進行拮抗菌株DNA的提取。

16S rRNA序列分析：采用通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′，經過PCR擴增后，送至進行序列分析，結果在EzBioCloud數據庫中比對后，選取相似性較高的菌株序列，利用MEGA 11.0軟件中的Neighbor-Joining（重復抽樣1 000次）進行系統發育樹的構建。

1.2.7? 拮抗菌株抑菌譜系測定

采用濾紙片法對拮抗細菌進行篩選［22］。在無菌工作臺中，用打孔器在已活化好的尖孢鐮刀菌平板上取5 mm菌餅接于PDA平板中央，在距離病原菌2.5 cm處呈“十”字形放置無菌濾紙片并滴加3 μL拮抗菌株發酵液，并且以接種LB液體培養基的處理為對照，每個處理重復3次。

1.2.8? 拮抗菌株對水稻幼苗的促生性研究

1.2.8.1? 水稻種子的消毒處理

在小燒杯中加入純水，將種子浸沒并保持30 min。剔除空秕粒后，用75%的乙醇表面消毒5 min，1% NaClO浸泡5 min，再用無菌水清洗3～5次，裝入燒杯中加入無菌水浸沒水稻種子。

1.2.8.2? 菌懸液的制備方法

將拮抗菌株劃線接種于LB固體培養基上，32 ℃活化16 h后，挑取單菌落接種于LB液體培養基中，于32 ℃、150 r/min振蕩培養24 h，制成發酵培養液。將所制成的發酵培養液8 000 r/min離心5 min后，棄去上清液，向菌體中加入無菌蒸餾水，重復該操作3次，制成菌懸液。

1.2.8.3? 不同菌濃度對水稻種子發芽的影響

在無菌工作臺中，將培養皿底部鋪上2層無菌濾紙，每個培養皿中裝30粒水稻種子，分別設置4個處理：CK（5 mL無菌蒸餾水浸潤）；T1（5 mL 1.0×106 CFU/mL菌懸液浸潤）；T2（5 mL 1.0×107 CFU/mL菌懸液浸潤）；T3（5 mL 1.0×108 CFU/mL菌懸液浸潤），每組進行重復6次，并放置在30 ℃恒溫培養箱中暗處理。催芽期間逐日記載發芽粒數，以籽粒幼根達籽粒長，幼芽至少達籽粒長的1/2為發芽標準，于第5天計算發芽勢，第7天計算測定胚芽長度與胚根長度，第10天計算發芽率，并計算發芽指數（GI）。試驗進行過程中，及時向培養皿中補充蒸餾水使濾紙始終保持濕潤狀態，計算公式如下：

X=M1/M×100%；

Y=M2/M×100%；

GI=∑（DG/Dt）。

式中：X為發芽勢；Y為發芽率；GI為發芽指數；M1為第5天正常發芽籽粒數；M2為第10天正常發芽籽粒數；M為組試籽粒數；Dt為對應DG的發芽天數；DG為發芽試驗終期內每天的發芽數。

1.2.8.4? 不同菌濃度對水稻幼苗期生長的影響

本試驗共設置4個處理：CK（1 L育秧基質+10 mL無菌蒸餾水）；T1（1 L育秧基質+10 mL 1.0×108 CFU/mL 菌懸液）；T2（1 L育秧基質+10 mL 1.0×109 CFU/mL菌懸液）；T3（1 L育秧基質+10 mL 1.0×1010 CFU/mL菌懸液），試驗在105 mm×105 mm×58 mm方盤中進行，每盤播種100粒經消毒后的水稻種子，每個處理重復3次，方盤放置于 25 ℃、光—暗周期為14 h—10 h的溫室中生長，21 d 后，對水稻幼苗的株出苗率、莖長、根長以及側根數進行考察。

1.2.9? 拮抗菌株盆栽防效測定

本試驗共設置5個處理：CK1（1 L育秧基質+10 mL無菌蒸餾水）；CK2（1 L育秧基質+10 mL無菌蒸餾水+10 mL濃度為1.0×105個/mL的尖孢鐮刀菌分生孢子懸浮液）；T1（1 L育秧基質+10 mL稀釋600倍的霉靈+10 mL濃度為1.0×105個/mL的尖孢鐮刀菌分生孢子懸浮液）；T2（1 L育秧基質+10 mL 1.0×108 CFU/mL 菌懸液+10 mL濃度為1.0×105個/mL的尖孢鐮刀菌分生孢子懸浮液）；T3（1 L育秧基質+10 mL 1.0×109 CFU/mL菌懸液+10 mL濃度為1.0×105個/mL的尖孢鐮刀菌分生孢子懸浮液）。試驗在105 mm×105 mm×58 mm方盤中進行，每盤播種100粒經消毒后的水稻種子，并噴施10 mL濃度為1.0×105個/mL的尖孢鐮刀菌分生孢子懸浮液，每個處理重復3次，方盤放置于25 ℃、光—暗周期為14 h—10 h溫室中生長，6 d后調查出苗率，15 d后計算發病率與防治效果。

發病率=發病株數/總株數×100%；

防治效果=（對照發病率-處理發病率）/對照發病率×100%。

1.2.10? 數據統計與分析

試驗數據采用Excel 2010、SPSS 25、Origin 2018、MEGA 11.0統計軟件進行處理分析和構建系統發育樹。

2? 結果與分析

2.1? 拮抗菌株的分離與篩選

采用稀釋涂布平板法在pH值為5.0的LB固體培養基上共篩選出102株菌，分離出5株對尖孢鐮刀菌有較好拮抗效果的菌株（圖1），其中TC-52菌株對尖孢鐮刀菌抑菌率達（72.7±1.4）%。后又對上述5種菌進行復篩，TC-52菌株的抑菌效果最好，其上清液抑菌直徑達到（27.29±1.57） mm，揮發性物質的抑菌率達（33.7±2.0）%。

2.2? 拮抗菌株抑菌胞外酶活性測定

菌株TC-52在纖維素酶檢測培養基（圖2-

A）、蛋白酶檢測培養基（圖2-B）與幾丁質酶檢測培養基（圖2-C）上均產生透明圈，其中蛋白酶的活性最強，HC值為3.13±0.04，纖維素酶與蛋白酶的活性較弱，HC值依次為1.61±0.06、1.14±0.03。

2.3? 拮抗菌株的促生性研究

菌株無法在PKO無機磷培養基和蒙金娜有機磷培養基上生長，初步判斷菌株不具備溶磷能力；菌株可以在解鉀培養基上生長，卻不產生透明圈，初步判斷菌株不具備解鉀能力；菌株在固氮培養基上生長（圖3-A），初步判斷菌株具有固氮能力；菌株在CAS產鐵載體培養基上生長，并產生透明圈（圖3-B），可以初步判斷該菌株具有產鐵載體的能力。將菌株發酵液與比色液混合后暗孵育30 min，混合液呈現紅色（圖3-C），初步表明菌株能夠分泌IAA。對菌株產IAA能力進行測定，標準曲線為y=0.011 8x+0.011 9，決定系數r2為0.994 5，表明試驗數據和擬合函數吻合度較高，方程可用，確定菌株TC-52分泌IAA的量為21.70 μg/mL。

2.4? 拮抗菌株的生物學相關特性

2.4.1? 生長pH值范圍測定

將菌株接種在不同pH值的培養基中，其生長情況見圖4，菌株在最適pH值為5.0～8.0時沒有明顯差異，當pH值＜5.0或＞8.0時，菌株的生長受到明顯的抑制，當pH值＜4.0或＞9.0時，菌株幾乎不能生長，因此，可以推斷菌株可以適應pH值為5.0左右的育秧基質的環境。

2.4.2? 形態學及生理生化鑒定

在LB平板上，TC-52 菌落呈不規則圓形，邊緣透明，不整齊，中心不透明，整體呈現灰白色，呈革蘭氏陽性，如圖5所示，菌株的生理生化試驗結果見表1。

2.4.3? 分子生物學鑒定

測序獲得菌株TC-52的16S rRNA序列大小為1 060 bp，通過16S rRNA序列鑒定并與同源序列比對分析，對拮抗菌株的分類地位進行確定，推斷菌株TC-52屬于貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis），且在已鑒定到種的該屬細菌中，

菌株TC-52與B. velezensis CR-502親緣關系最為接近，同源性最高（一致性99.14%），確定 TC-52 號菌株為貝萊斯芽孢桿菌（圖6）。

2.5 ?拮抗菌株抑菌譜系的鑒定

菌株TC-52對病原菌的抑制效果見表2，其中，菌株TC-52對禾谷鐮刀菌的抑菌效果最為明顯，抑菌率高達66.77%，對大豆疫霉菌的抑菌效果較差，僅有43.95%，對核盤菌幾乎沒有拮抗效果，對立枯絲核菌、 串珠鐮刀菌、層出鐮刀菌、小麥全蝕病菌抑菌率均在50%～70%之間。菌株TC-52具有較廣的抑菌譜系。

2.6? 拮抗菌株對水稻種子發芽的影響

將農豐1702水稻種子經消毒處理后浸潤在不同濃度的TC-52菌懸液中，種子萌發情況見表3。相較于CK，不同濃度菌懸液對水稻種子的發芽率、發芽勢、發芽指數以及胚芽長無明顯影響；但T1與T2處理卻能顯著促進胚根的生長，分別增加了19%與13%；而T3處理對水稻種子的胚根生長產生了一定的抑制效果。由此可見，拮抗菌株浸種濃度不超過1.0×108 CFU/mL時對水稻種子無毒害作用。

2.7? 拮抗菌株對水稻幼苗生長的影響

在含有不同菌濃度的育秧基質中種植農豐1702水稻種子，幼苗生長狀況見表4。相較于CK處理，T1、T2處理分別使得水稻幼苗根長顯著增加了16%與25%，側根數分別顯著增加了20%與29%，其中，T2處理還會使得水稻幼苗的平均莖長增加1 cm，而當菌濃度增加至T3處理時，水稻出苗率顯著降低，水稻幼苗的生長受到抑制。由此可見，適宜的菌懸液濃度可以顯著促進水稻幼苗根與莖的生長。

2.8? 盆栽防效測定

將尖孢鐮刀菌的分生孢子懸浮液分別噴灑到添加等量無菌水、霉靈與不同濃度的TC-52菌株的育秧基質中，對其出苗率、發病率等指標進行測定，結果見圖7，相較于處理組CK1，處理組CK2的出苗率降低了9.67%。相較于處理組CK2，T1、T2、T3處理組出苗率分別提升了9.00%、4.34%與9.34%，發病率分別降低了64.66%、37.00%、65.33%，由此可見，噴施化學殺菌劑與菌懸液均可以一定程度防治水稻立枯病，改善因病原菌的侵染所導致的出苗率低的問題。相較于菌濃度較低的T2組，菌濃度較高的T3組在防治效果上更加明顯，且與施加化學殺菌劑的T1組防治效果均>75%，由此可見，一定濃度的TC-52菌株拌入水稻育秧基質中對水稻立枯病有較好的防病效果。

3? 討論與結論

酸堿度合適的育苗基質不僅有利于水稻生長，同時有利于預防一些水稻病蟲害，水稻的最適生長pH為5.0左右，因此，篩選可以在該pH環境中長勢較好的生防菌株就變得尤為重要。李晉等發現了一株暹羅芽孢桿菌，其可耐受pH值為4.0，在酸性土壤中對西瓜枯萎病的防治效果達到67%［23］；Zhao等研究發現，假單胞菌CLP-6在pH值為5.5時釋放的揮發性有機化合物對煙草白性枯萎病的防治效果為78.91%［24］。本研究所篩選的菌株，根據菌體特征、16S rRNA序列分析及生理生化試驗，鑒定為貝萊斯芽孢桿菌，在水稻育秧基質中的防效達到75.41%，這是對于耐酸水稻立枯病拮抗菌株的首次報道。該菌株既具芽孢桿菌（Bacillus）繁殖速度快、因可以產生內生孢子而具有較強的抵御外界有害因子能力的特點［25］，又可以在pH值為5.0左右的環境中正常繁殖生長，耐受pH值達到4.0。

尖孢鐮刀菌是常見的植物致病菌，其細胞壁成分主要由糖蛋白、幾丁質與纖維素等物質構成［26］，真菌細胞壁在細胞分裂、生長、維持菌絲形態和適應環境中起著重要作用，因此破壞了病原菌細胞壁的完整性，將會極大程度地抑制病原菌生長，降低植物的發病率［27］。在本研究中，貝萊斯芽孢桿菌TC-52具有產纖維素酶、蛋白酶以及幾丁質酶3種抑菌胞外酶的能力，3種酶互相協作，通過分解真菌的細胞壁，進而抑制病原菌的生長，降低植物的發病率，這與Wang等的報道結果［28］一致，芽孢桿菌的抑菌特性還可以通過分泌抗生素來直接抑制病原菌的生長［29-31］。本研究中，貝萊斯芽孢桿菌 TC-52 的上清液與揮發性抑菌活性物質可以進一步抑制尖孢鐮刀菌的生長，使得對尖孢鐮刀菌抑菌率達到72.7%，同時該菌株對立枯絲核菌（R. solani）、層出鐮刀菌（F. proliferatum）等6種常見菌株均有明顯的抑制效果。但是該菌株是否產生其他抗生素以及揮發性抑菌物質的具體成分尚不可知，需后續進一步研究分析。

菌株的促生特性也是生防菌的機制之一［32］，菌株能利用植物根系分泌的色氨酸合成IAA，直接促進植物細胞伸長和細胞分裂，高雅新等發現，具有產IAA能力的哈茨木霉M95對黃瓜幼苗生長具有顯著的促進作用［33］；王東亞等還發現，具有產IAA能力的菌株在浸染條件下可以顯著增加水稻種子的萌發率、根和芽長及生物量［34］。本研究中貝萊斯芽孢桿菌TC-52具有產IAA能力，其IAA產量達到21.70 μg/mL，相較于浸潤在無菌水中，將水稻種子浸潤在1.0×106 CFU/mL菌懸液中，胚根的生長增加了19%。菌株的促生性還表現在可以通過固氮、溶磷、解鉀等能力提高土壤速效、緩效養分含量，提高微生物的生物活性，進一步促進植物的生長，以增加對病原菌的抗性［35-36］，本研究中貝萊斯芽孢桿菌TC-52具有固氮能力，進一步促進了水稻的生長，減少了病害的侵染，將貝萊斯芽孢桿菌TC-52拌入水稻育秧基質中時，可以明顯促進水稻幼苗根系的生長，對主根長度的增長達到25%，對側根數的增長達到29%。此外，貝萊斯芽孢桿菌 TC-52 具有產鐵載體能力，可以特異地螯合Fe3+，在低鐵環境中與病原菌競爭鐵元素，抑制病原菌生長，也可以將難溶的鐵轉化為易溶的鐵供植物吸收，促進植物生長［11，37-38］。

綜上所述，貝萊斯芽孢桿菌TC-52可以適應酸性環境，對尖孢鐮刀菌有較好的抑制效果，拌入水稻育秧基質中可以明顯改善水稻立枯病的發病情況，同時對水稻幼苗的生長有明顯的促進作用，表現出了良好的應用前景，但關于該菌株代謝產物的分離純化、大田應用效果等方面還需進一步的研究。

本研究從大豆根際土壤中篩選得到了1株對尖孢鐮刀菌具有明顯拮抗作用的菌株TC-52，根據菌體特征、16S rRNA序列分析及生理生化試驗，初步鑒定該菌株為貝萊斯芽孢桿菌，該菌株可以通過分泌纖維素酶、蛋白酶以及幾丁質酶3種抑菌胞外酶以及揮發性抑菌活性物質來抑制尖孢鐮刀菌以及其他病原菌的生長，具有較廣的抑菌譜，同時該菌株具有固氮、產鐵載體與產IAA能力，有較好的防病效果和一定的促生能力。

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