掌葉木V-ATP酶C亞基基因克隆及表達(dá)模式分析

徐健 李雪萍

【摘?? 要】?? 從珍稀瀕危植物掌葉木中克隆了一個(gè)V-ATP酶C亞基（HbVATP_C）基因，對(duì)其生物信息學(xué)特征進(jìn)行了分析，利用熒光定量技術(shù)檢測(cè)了該基因在不同組織和干旱及鹽脅迫下的表達(dá)模式。結(jié)果顯示，該基因開放閱讀框全長(zhǎng)1128 bp，編碼 375個(gè)氨基酸，蛋白分子量是42.57 kD，等電點(diǎn)為5.44，為親水性蛋白。HbVATP_C具有典型的V-ATP_C結(jié)構(gòu)域，與其他植物同源性較高。HbVATP_C在掌葉木根、莖和葉等不同組織中均有表達(dá)，在幼葉中表達(dá)水平顯著高于其他部位。干旱脅迫下，該基因表達(dá)水平均高于對(duì)照，鹽脅迫下變化不明顯，說(shuō)明該基因能響應(yīng)干旱脅迫。為進(jìn)一步研究該基因在掌葉木中的功能奠定了基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】?? 掌葉木；V-ATP酶C亞基；基因克隆；表達(dá)模式

Cloning and Expression Analysis of a V-ATPase_C Subunit Gene

from Handeliodendron Bodinieri

Xu Jian， Li Xueping*

（Henan University of Science & Technology， Luoyang 471023， China）

【Abstract】??? This study cloned a V-ATPase C subunit gene （HbVATP_C） from the rare and endangered plant Handeliodendron bodinieri， analyzed its bioinformatic characteristics， and used qPCR technology to detect the expression pattern of HbVATP_C in different tissues and under drought and salt stress. The results showed that the open reading frame of HbVATP_C is 1128 bp in length， encoding 375 amino acids. The protein has a molecular weight of 42.57 kD， with an isoelectric point of 5.44， and is a hydrophobic protein. HbVATP_C has a typical V-ATP_C domain structure and shows high homology with other plant homologs. HbVATP_C is expressed in various tissues such as roots， stems， and leaves of H. bodinieri. The expression level is significantly higher in young leaves compared to other tissues. The expression level of this gene is higher than that in the control of drought and salt stress， indicating that the gene can respond to environmental stresses. This study lays a foundation for further research on the function of? HbVATP_C in H. bodinieri.

【Key words】???? Handeliodendron bodinieri; V-ATPase-HbVATP_C? subunit; gene cloning; expression Pattern

〔中圖分類號(hào)〕 Q943????????????? ???? ????? ???〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕? A????? ???????????? 〔文章編號(hào)〕 1674 - 3229（2024）02- 0066 - 06

[收稿日期]?? 2024-03-25

[基金項(xiàng)目]?? 國(guó)家自然科學(xué)基金（31600530）

[作者簡(jiǎn)介]?? 徐健（1990- ），男，碩士，河南科技大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院助理實(shí)驗(yàn)師，研究方向：植物生物學(xué)。

[通訊作者]?? 李雪萍（1980- ），女，博士，河南科技大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院副教授，研究方向：園林植物發(fā)育生物學(xué)、園林植物種質(zhì)資源收集與瀕危植物保護(hù)。

0???? 引言

Handeliodendron bodinieri?（Lévl.） Rehd.是Sapindaceae科、Handeliodendron屬的單種，為中國(guó)特有的珍稀瀕危物種，被列為國(guó)家一類保護(hù)植物，主要分布在中國(guó)西南部廣西和貴州交界海拔500～900米的喀斯特林區(qū)［1］。掌葉木為落葉闊葉喬木，樹形優(yōu)美、材性優(yōu)良，是建筑和家具制造的好材料；葉片含有木脂素和類黃酮苷，具有藥用價(jià)值［2］；花果顏色鮮艷可作觀賞；種子脂肪含量高，有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與很好的低溫流動(dòng)性，兼具食用價(jià)值和工業(yè)價(jià)值，有望開發(fā)為高端食品和生物質(zhì)柴油［3-4］。囊泡型H+ATPase（V-ATPase）主要存在于真核生物液泡膜系統(tǒng)中，是一個(gè)由ATP驅(qū)動(dòng)的質(zhì)子泵，它利用ATP水解的能量轉(zhuǎn)化為電化學(xué)勢(shì)能，介導(dǎo)氫離子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)［5］，使液泡酸化并執(zhí)行重要的細(xì)胞功能。V-ATP酶是具有活性的多聚體復(fù)合酶，C亞基是其中一個(gè)重要的單元［6］，主要參與調(diào)控V-ATPase活性和微絲骨架的結(jié)合［7-8］，因此被廣泛關(guān)注。

干旱和鹽脅迫是植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中嚴(yán)重的非生物脅迫因子，V-ATPase是維持細(xì)胞內(nèi)膜不同區(qū)塊pH差異以保證細(xì)胞正常完成生化功能重要因子［9］，研究其在逆境脅迫下的調(diào)控特性具有一定理論價(jià)值。本研究從掌葉木中克隆了一個(gè)液泡膜ATPase亞基基因HbVATP_C，對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析和進(jìn)化分析，并利用實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)檢測(cè)了該基因在干旱和鹽脅迫情況下的表達(dá)情況，為后續(xù)深入研究該基因功能提供前期基礎(chǔ)。

1???? 材料和方法

1.1?? 植物材料

本研究所用掌葉木種子由河南科技大學(xué)園林實(shí)驗(yàn)中心提供，種子處理方法參照前人研究［10］。種子萌發(fā)一周后，將幼苗移栽到草炭土中培養(yǎng)6周，期間用霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液澆灌。6周后取幼苗的根（主根和側(cè)根）、葉（幼嫩葉、成熟葉和葉柄）、莖（韌皮部和木質(zhì)部）等不同部位，用于分析目的基因在不同組織表達(dá)情況。分別選取長(zhǎng)勢(shì)一致的6周齡幼苗用20% PEG6000和200 mM NaCl澆灌進(jìn)行干旱和鹽脅迫處理，并分別于0 h、12 h、24 h、48 h和72 h收集葉片材料，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。所有材料取材后液氮速凍，置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2?? RNA提取、反轉(zhuǎn)錄與基因擴(kuò)增

將收集的植物材料研磨成粉末后分別稱取100 mg，利用植物總RNA提取試劑盒（北京天根生物有限公司）提取總RNA，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其質(zhì)量，然后利用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara）合成cDNA第一鏈。

基于前期研究的掌葉木轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（未發(fā)表）篩選V-ATP酶C亞基候選基因，獲取其cDNA基因全長(zhǎng)序列。利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)目的基因CDS（編碼序列）全長(zhǎng)克隆引物（HbVATP_C-f： 5-ATGGCATCTAGATACTGGGC-3和HbVATP_C-r：5

-TCAAACAAGATTGATTGTGAAG-3）。以未處理材料的根、莖和葉混合樣本cDNA 為模板，采用PrimeSTAR HS高保真聚合酶（Takara，R010Q）進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增體系25 μL，包含1 μL cDNA模板，12.5 μL PrimeSTAR HS，各0.5 μL正反向引物，10.5 μL ddH2O。PCR反應(yīng)條件：98 ℃ 預(yù)變性 1 min；98 ℃ 變性10 s，58 ℃ 退火15 s，72 ℃延伸45 s，30次循環(huán)；72 ℃ 延伸5 min；4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并拍照，對(duì)符合預(yù)期大小的片段進(jìn)行切膠純化回收，連接至pTOP克隆載體，轉(zhuǎn)化后挑取克隆搖菌，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序得到的序列與模板序列進(jìn)行比對(duì)，分析其相似性。

1.3?? 生物信息學(xué)分析

利用Expasy server （https：//www.expasy.org/）的ProtParam和 ProScale工具分析蛋白的分子量（Molecular weight）、等電點(diǎn)（Theoretical pI）、親水性平均系數(shù)（Grand average of hydropathicity，GRAVY）、不穩(wěn)定指數(shù)（Instability index）等。利用 SMART（http：//smart.embl-Heidelberg.de） 在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)該蛋白的功能結(jié)構(gòu)域。利用SOPMA工具［11］進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，SWISS models（https：//swissmodel. expasy. org/）進(jìn)行蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)［12］。

1.4?? 同源性分析

利用植物基因組網(wǎng)站Phytozome（V13）（https：//phytozome-next.jgi.doe.gov/）BLASTP工具（登陸日期：2024年2月25日），基于目標(biāo)基因蛋白序列在苔蘚（Physcomitrium patens）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）和玉米（Zea mays）等不同進(jìn)化地位的物種基因組中進(jìn)行同源序列檢索并下載相應(yīng)序列，使用 MEGA6軟件［13］進(jìn)行序列相似性比對(duì)，并使用鄰接法（neighbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)樹，分析掌葉木V-ATP酶C亞基基因的系統(tǒng)進(jìn)化地位。

1.5?? 表達(dá)分析

根據(jù)測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)HbVATP_C基因的熒光定量引物（RT-HbVATP_C-f： 5-AGCTAAACAGAGGGG

AAA-3， RT-HbVATP_C-r： 5-GAAGACACCGCCCA

GTATC-3），以Actin為內(nèi)參基因（RT-Actin-f： 5

-CGATGAATCTGGGCCAGCTAT-3，RT-Actin-r： 5

-TAAACCGGAGCTGACCAAACT-3）。以脅迫后12 h、24 h、 48 h、72 h掌葉木葉片材料cDNA為模板，0 h材料為對(duì)照，利用2×M5 HiPer SYBR Premix EsTaq熒光定量試劑盒（北京聚合美，MF787）進(jìn)行表達(dá)量檢測(cè)。每個(gè)樣品3次生物學(xué)重復(fù)。反應(yīng)體系和程序參照說(shuō)明書進(jìn)行，根據(jù)2-ΔΔCt法計(jì)算掌葉木HbVATP_C基因在干旱脅迫后的相對(duì)表達(dá)變化。

2???? 結(jié)果與分析

2.1?? HbVATP_C基因克隆

以掌葉木未處理葉片樣品的cDNA為模板，利用基因全長(zhǎng)克隆引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，電泳分析結(jié)果顯示擴(kuò)增條帶約為 1100 bp（圖1），測(cè)序結(jié)果顯示該基因全長(zhǎng)1128 bp，編碼 375個(gè)氨基酸，將其命名為HbVATP_C。

2.2?? HbVATP_C生物信息學(xué)分析

使用ExPASy在線工具對(duì)HbVATP_C蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析，結(jié)果顯示，HbVATP_C蛋白的分子量是42.57 kD，等電點(diǎn)為5.44，為酸性蛋白。不穩(wěn)定指數(shù)（instability index）是51.17（＞40），屬于不穩(wěn)定蛋白。親水性平均系數(shù)（Grand average of hydropathicity，GRAVY）是-0.307，說(shuō)明該蛋白為親水性蛋白（圖2-A）。信號(hào)肽主要由疏水性氨基酸組成，運(yùn)用SignalP4.1 server進(jìn)行HbVATP_C信號(hào)肽分析，發(fā)現(xiàn)該序列不存在信號(hào)肽，TMHMM Serverv 2.0預(yù)測(cè)結(jié)果表明HbVATP_C無(wú)跨膜區(qū)（圖未顯示）。蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析顯示（圖2-C），HbVATP_C蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中，α螺旋（Alpha helix）區(qū)域占比最高，為全部氨基酸的58.67%（220個(gè)）；48個(gè)氨基酸參與形成延伸鏈（Extended strand），占比的12.8%；β轉(zhuǎn)角（β turn）占4.27%；不規(guī)則卷曲（Random coil）共計(jì)91個(gè)，占比24.27%。基于同源建模的SWISS model預(yù)測(cè)顯示（圖2-B）HbVATP_C蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)與模板（V-type proton ATPase subunit C，SMTL ID： 7uw9.1.2）之間的序列同源性為 88.27%，且以α螺旋和不規(guī)則卷曲為主要結(jié)構(gòu)。利用NCBI網(wǎng)站保守結(jié)構(gòu)域分析工具（Conserved Domain Search）分析HbVATP_C蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示，該蛋白具有V-ATP_C保守結(jié)構(gòu)域（圖2-D），表明該蛋白屬于V-ATP類蛋白家族成員。

2.3?? HbVATP_C序列相似性分析和系統(tǒng)發(fā)育樹分析

選取苔蘚植物、單子葉植物和雙子葉植物等不同進(jìn)化水平的12種代表性物種，利用同源檢索方法下載選定物種中的同源基因的氨基酸序列并進(jìn)行多重序列比對(duì)，結(jié)果如圖3所示。掌葉木HbVATP_C蛋白與其他物種VATP-C具有較高的一致性，整體相似度為85.52%，說(shuō)明這些蛋白在進(jìn)化上非常保守，暗示它們?cè)谥参镞M(jìn)化過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。其中，與桃（Prunus persica）Prupe.3G312200.1.p、棉花（Gossypium hirsutum）Gohir.D11G067700.1.p、楊樹Populus trichocarpa）Potri.017G061100.1和葡萄（Vitis vinifera）VIT_214s0068g01280.2的相似度分別為87.77%、87.2%、86.97%、86.13%，說(shuō)明它們可能執(zhí)行相似的功能。利用MEGA6.0軟件將上述同源蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建和遺傳距離分析，結(jié)果如圖4所示。13個(gè)參試物種VATP-C基因編碼蛋白經(jīng)聚類可分為兩大分支，小立碗蘚（Physcomitrium patens）、玉米（Zea mays）和水稻（Oryza sativa）被分為一類，掌葉木和其他物種被聚在另外一個(gè)分支，說(shuō)明它們親緣關(guān)系較近，與苔蘚植物和單子葉植物水稻、玉米等同源性較遠(yuǎn)。

2.4?? HbVATP_C基因表達(dá)模式分析

利用熒光定量PCR分析HbVATP_C基因在掌葉木幼苗根（主根和側(cè)根）、葉（幼嫩葉、成熟葉和葉柄）、莖（韌皮部和木質(zhì)部）等部位的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果表明，HbVATP_C在各部位均有表達(dá)，但在葉片中表達(dá)量明顯高于其他部位，幼嫩葉片中表達(dá)量最高（圖5）。為了探究HbVATP_C基因?qū)Ω珊岛望}脅迫的響應(yīng)，對(duì)掌葉木在干旱、鹽脅迫條件下的表達(dá)響應(yīng)模式進(jìn)行分析。結(jié)果如圖6-A所示，干旱處理后，HbVATP_C表達(dá)量顯著提高，在12小時(shí)時(shí)表達(dá)量上調(diào)到2.6倍，48小時(shí)后達(dá)到最高值4.7倍。在鹽脅迫條件下，HbVATP_C表達(dá)量變化趨勢(shì)不明顯，在12小時(shí)達(dá)到對(duì)照組的1.6倍（圖6-B）。

3???? 結(jié)論與討論

V-ATP酶分布廣泛且結(jié)構(gòu)復(fù)雜，首次被發(fā)現(xiàn)是在酵母液泡膜上，是一種運(yùn)輸質(zhì)子的ATP酶，對(duì)細(xì)胞的生理功能有重要作用，參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、細(xì)胞內(nèi)酸化調(diào)節(jié)和物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)［14-15］以及多種信號(hào)傳導(dǎo)的過(guò)程［16］。目前，編碼V型 ATP酶復(fù)合體的12個(gè)基因均已被識(shí)別［17］，其中C亞基主要參與調(diào)控V型ATP酶活性和微絲骨架的結(jié)合，一直是關(guān)注熱點(diǎn)。

本研究基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得掌葉木HbVATP_C基因，編碼375個(gè)氨基酸，蛋白的分子量是42.57 kD，等電點(diǎn)為5.44。HbVATP-C無(wú)信號(hào)肽，為親水性蛋白。該蛋白屬于不穩(wěn)定蛋白，二級(jí)結(jié)構(gòu)原件包括α螺旋（58.67%）、延伸鏈（12.8%）和β轉(zhuǎn)角（4.27%），不規(guī)則卷曲（24.27%），α螺旋和不規(guī)則卷曲是二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要元件。該蛋白在植物中具有較高的保守性，序列比對(duì)顯示該蛋白與桃、棉花、楊樹和葡萄同源蛋白的相似度非常高，系統(tǒng)發(fā)育樹也顯示它們具有較近的親緣關(guān)系。

為對(duì)HbVATP_C的表達(dá)情況進(jìn)行確定分析，利用熒光定量技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，該基因在掌葉木的主根、側(cè)根、韌皮部、木質(zhì)部、葉、葉柄等不同部位均有表達(dá)，但在嫩葉中表達(dá)量最高，說(shuō)明該基因具有時(shí)空表達(dá)差異性。V-ATP_C對(duì)逆境脅迫響應(yīng)靈敏，在脅迫發(fā)生后，其轉(zhuǎn)錄水平迅速提高［18］，說(shuō)明V-ATP酶C亞基可能在逆境脅迫中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫后的12小時(shí)，HbVATP_C表達(dá)水平即提升為對(duì)照組的2倍以上，并在48小時(shí)內(nèi)保持高水平表達(dá)；在鹽脅迫下，HbVATP_C表達(dá)水平也有適當(dāng)上調(diào)，12小時(shí)后，轉(zhuǎn)錄水平提高到對(duì)照組的1.6倍。這些結(jié)果初步說(shuō)明，HbVATP_C基因可能參與掌葉木應(yīng)答干旱和鹽脅迫，但其參與的途徑和方式有待進(jìn)一步研究。

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