結核斑點試驗聯合血漿結核分枝桿菌游離DNA檢測在肺結核中的診斷價值

呂燕燕

【摘要】 目的 分析結核斑點試驗聯合血漿結核分枝桿菌游離DNA（circulating free DNA，cfDNA）檢測肺結核的效能。方法 選取2019年1月—2022年6月都昌縣第二人民醫院診治的80例疑似肺結核患者，對所有患者施以結核斑點試驗、血漿MTB-cfDNA檢測，以痰結核分歧桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）培養結果為“金標準”，統計對比不同檢查方法在肺結核中的診斷效能。結果 80例疑似肺結核患者經痰MTB培養檢查，共檢出73例肺結核，結核斑點試驗聯合血漿MTB-cfDNA檢測，共檢出70例，結核斑點試驗共檢出62例，血漿MTB-cfDNA檢測共檢出52例。結核斑點試驗聯合血漿MTB-cfDNA檢測肺結核的檢出靈敏度、準確度分別為94.52%、93.75%，高于結核斑點試驗的82.19%、81.25%，高于血漿MTB-cfDNA檢測的69.86%、71.25%，差異有統計學意義（P<0.05）。Kappa檢驗顯示，結核斑點試驗聯合血漿MTB-cfDNA檢測結果與“金標準”檢測結果的一致性較為理想（Kappa值=0.672，P<0.001）。結論 結核斑點試驗聯合血漿MTB-cfDNA檢測在肺結核的診斷中效果顯著，具有較高的疾病檢出精準度，可為臨床提供可靠的參考信息，臨床應用價值較高，值得大力推行。

【關鍵詞】 肺結核；結核分枝桿菌；結核斑點試驗；診斷效能；靈敏度；準確度

文章編號：1672-1721（2024）16-0067-03? ? ?文獻標志碼：A? ? ?中國圖書分類號：R446

肺結核是一種由結核分歧桿菌（MTB）感染而誘發的呼吸系統傳染病，臨床發生率處于較高水平。肺結核病灶主要在肺組織、器官、支氣管與胸膜處。在我國傳染類疾病中，肺結核發病與死亡數均高居第2位，對群眾身心健康造成威脅[1-2]。近些年，由于人們生活方式轉變，該病患病率呈逐年上升趨勢[3-4]。早期及時診斷肺結核，并指導臨床施行針對性的治療措施，對于保障患者身心健康和改善其預后至關重要。既往臨床多采用痰MTB培養對肺結核行診斷，但該方法檢測耗費時間較長，不適合大范圍開展早期篩查[5-6]。探索一種更為快速、有效的診斷措施成為臨床研究的重點。近些年，隨著醫學技術的快速發展，結核斑點試驗、血漿結核分枝桿菌游離DNA（cfDNA）等檢測手段在肺結核的檢查中廣泛使用，取得了一定效果，但臨床關于兩者聯合診斷肺結核的報道較為缺乏。基于此，本研究以80例疑似肺結核患者為研究對象，分析結核斑點試驗聯合血漿MTB-cfDNA檢測在肺結核中的鑒別效果，為臨床早診斷、早治療提供可靠的參考依據，報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年1月—2022年6月都昌縣第二人民醫院診治的80例疑似肺結核患者為研究對象。患者中男性43例，女性37例；年齡35～78歲，平均年齡（60.53±2.48）歲；基礎疾病，23例冠心病，26例糖尿病，18例高血壓；體質量指數18.3～27.1 kg/m2，平均體質量指數（25.26±0.49）kg/m2。本研究經醫院醫學倫理委員會審核批準。

納入標準：伴有咳嗽、咳痰持續2周以上；患者具有較高的依從性；患者對本試驗知悉，且自愿簽署知情同意書。

排除標準：存在惡性腫瘤者；意識障礙，難以正常交流者；合并精神疾病者；存有全身性感染者；合并免疫系統、凝血功能異常者；存在嚴重的腦器質性疾病者；存有嚴重的臟器損傷者；合并酒精、藥物依賴史者；存在血液系統疾病者；伴有嚴重心力衰竭者。

1.2 方法

標本采集。患者入院后，于次日清晨采集全部患者的晨起空腹10 mL靜脈血，置于無菌試管內，留存待檢，分別用于血漿MTB-cfDNA檢測與結核斑點試驗。在標本采集時，需嚴格遵照無菌操作原則。

血漿MTB-cfDNA檢測。5 mL血液標本經3 000 r/min離心處理10 min獲取上層清液，采集2 mL上層清液轉換至新離心管后；用12 000 r/min離心處理10 min，采集2 mL上清液到新試管中；行MTB的cfDNA提取，提取后再留存待檢；以熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）開展測定，反應序列為95 ℃ 2 min預變性，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s擴增反應，60 ℃下進行熒光信號收集，共反復進行40個循環，50 ℃ 30s冷卻；獲得擴增產物后經由3%瓊脂糖凝膠電泳檢測，進行核酸序列測定。

結核斑點試驗。將采集的血樣經肝素抗凝后取5 mL放入Ficoll淋巴細胞分離液，經過離心處理之后對外周血單個單核細胞予以分離，以細胞培養基重懸細胞，培養板每組條孔加入細胞培養基（50 μL）作為空白對照，植物血凝素（50 μL）作為陽性對照，刺激源為MTB特異性ESAT-6（50 μL）、LCEF-10抗原（50 μL）；之后于每孔分別加入LPBMC懸液（100 μL）；以上操作完畢后把培養板放在37 ℃條件下培養16～20 h，培養完畢后經蒸餾水對培養板進行洗滌，加入二抗體并在2～80 ℃環境下孵育1 h；孵育完畢后對培養板再次洗滌并加入50 μL顯色液，在室溫下放置7 min后洗滌，待干燥后計數斑點。

血漿MTB-cfDNA檢測判斷標準。紫外燈下檢查，在254 bp有清晰的擴增條帶，則判定為結核桿菌DNA陽性。

結核斑點試驗判斷標準。陰性對照斑點數>5，抗原A、B斑點與陰性對照組斑點數相比處于更高水平，超出陰性對照組斑點數的2倍。

所有的檢測操作均由醫院2名高年資的檢驗師醫師共同檢測，討論得出最終檢出結果，以保障檢測結果的精準性。

1.3 觀察指標

比較不同檢查方法檢查肺結核的診斷效能。以痰MTB培養結果為“金標準”，統計對比結核斑點試驗、血漿MTB-cfDNA檢測、結核斑點試驗聯合血漿MTB-cfDNA檢測肺結核的檢出情況。

1.4 統計學分析

采用SPSS 20.0統計學軟件分析數據，計量資料以x±s表示，采用t檢驗，計數資料以百分比表示，采用χ2檢驗；一致性采用Kappa檢驗（Kappa值>0.75提示一致性極好，Kappa值為0.40～0.75提示一致性較為理想，Kappa值<0.40提示一致性差）；P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

80例疑似肺結核患者，經痰MTB培養檢查共檢出73例肺結核，結核斑點試驗聯合血漿MTB-cfDNA檢測共檢出70例，結核斑點試驗共檢出62例，血漿MTB-cfDNA檢測共檢出52例，見表1。

結核斑點試驗聯合血漿MTB-cfDNA檢測肺結核的檢出靈敏度、準確度高于結核斑點試驗、血漿MTB-cfDNA檢測，差異有統計學意義（P<0.05）；3種檢查方法的特異度、陽性預測值、陰性預測值比較，差異無統計學意義（P>0.05），見表2。

Kappa檢驗顯示，結核斑點試驗聯合血漿MTB-

cfDNA檢測結果與“金標準”檢測結果的一致性較為理想（Kappa值=0.672，P<0.001）。

3 討論

肺結核具有較高的患病率，是威脅人類健康的傳染性疾病。糖尿病患者、塵肺患者、免疫抑制劑使用者等均為肺結核的易感人群。肺結核主要傳播途徑為經呼吸道飛沫傳播。當肺結核患者咳嗽、打噴嚏、大笑與唱歌時，可將含有MTB的微滴從呼吸道播散到空氣中并停留數小時，若被他人吸收將會引起感染。肺結核活動性感染者在1年內可引起超過20例新發感染，傳染性極強，而20%的感染患者患病早期癥狀缺乏特異性[7-8]。患者在患病初期無明顯特征，診斷比較困難，誤診率較高，易錯過最優良的治療時機，加重傳染現象，增加社會壓力[9]。因此，對肺結核做到早診斷、早治療至關重要。

痰MTB培養為目前臨床診斷肺結核的“金標準”，

但藥敏試驗耗時較長，得到準確結果至少需4周，且操作較為復雜，重復性差，在實際應用中受限[10]，需尋求更為快速有效的診斷措施。cfDNA屬于一類廣泛存在于生物體液中無細胞形態的胞外DNA片段，此游離DNA片段的測定目前已在產婦的產前診斷與腫瘤等病癥的鑒別診斷內取得顯著成效。因PCR技術問世，血漿MTB-cfDNA被大范圍使用，尤其是熒光定量PCR在臨床推行，能夠以體外擴增法測定血漿MTB內存有的cfDNA，從而迅速、精準測定MTB，早期診斷出肺結核。如果實驗室中血液收集、保存和運送等環節操作不當，會導致不穩定的cfDNA出現降解，而被降解的DNA分泌同樣會對檢測結果構成較多干擾，導致血漿MTB-cfDNA檢測存在一定的漏診、誤診風險。結核斑點試驗運用酶聯免疫吸附技術原理，由單細胞水平對細胞因子開展測定，為細胞免疫學措施之一。患者感染結核后，機體中會長時間存在抗原特異性的記憶性T細胞。結核斑點試驗依照此類淋巴細胞遭受刺激釋放的干擾素對感染進行判斷，故具有較高的靈敏度。結核斑點試驗具有檢測標本易于獲取的特點，在臨床應用中較為便捷。結核斑點試驗不受病例排菌類別、排菌量與是否排菌等因素的干擾，能夠明顯減少肺結核漏診的情況[11-12]。需注意的是，細胞環境、機體內環境等因素均可能對該方法檢測結果造成一定的影響，故臨床多考慮行聯合檢測。本研究結果顯示，80例疑似肺結核患者中，經痰MTB培養檢查共檢出73例，結核斑點試驗聯合血漿MTB-cfDNA檢測共檢出70例，結核斑點試驗共檢出62例，血漿MTB-cfDNA檢測共檢出52例。結核斑點試驗聯合血漿MTB-cfDNA檢測肺結核的檢出靈敏度、準確度分別為94.52%、93.75%，高于結核斑點試驗的82.19%、81.25%，高于血漿MTB-cfDNA檢測的69.86%、71.25%。Kappa檢驗顯示，結核斑點試驗聯合血漿MTB-cfDNA檢測結果與“金標準”檢測結果的一致性較為理想。上述研究結果表明，結核斑點試驗聯合血漿MTB-cfDNA檢測肺結核具有較高的診斷效能，可提高疾病的早期檢出精準率。聯合檢測可起到優勢互補功效，從不同層面對疑似肺結核患者機體內MTB檢測，可最大程度減少漏診、誤診情況發生。

綜上所述，結核斑點試驗聯合血漿MTB-cfDNA檢測在肺結核診斷中效能顯著，具有較高的檢出準確度，臨床應用價值較高，值得大力推行。各醫療機構檢驗室可在自身條件允許的情況下，積極行結核斑點試驗與血漿MTB-cfDNA聯合檢測，提高疾病檢出精準性，為臨床提供更多的參考，進而施行更規范且個體化的治療措施，保障患者獲得優良的預后。

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