產類胡蘿卜素海洋紅酵母菌株的篩選及工藝條件優化

摘 要：為獲得高產胡蘿卜的海洋紅酵母菌株，從福建省海域的各種海洋環境樣品中獲得了海洋酵母菌株228株，通過產類胡蘿卜素海洋紅酵母的篩選和鑒定，獲得目標菌株 Y37，進一步通過單因素試驗優化發酵培養基條件并搖瓶驗證。結果表明：菌株 Y37被鑒定為 Rhodotorula mucilaginosa 亞種，其發酵生產類胡蘿卜素的最佳碳源是甘露醇，最佳氮源為魚粉，培養基中最佳鹽濃度為3%。在最佳發酵條件下，Y37搖瓶發酵時的類胡蘿卜素產量達到了128 ug·L-1。因此，本研究從各種海洋生境中分離獲得了高產類胡蘿卜素潛力的海洋酵母菌種資源庫，為規模化制備類胡蘿卜素提供了新途徑。

關鍵詞：類胡蘿卜素；海洋紅酵母；碳源；氮源；鹽濃度

中圖分類號：TQ926.1" 文獻標志碼：A" 文章編號：0253?2301（2024）03?0015?06

DOI：10.13651/j.cnki.fjnykj.2024.03.003

Screening of the Marine Red Yeast Strains Producing Carotenoids and Optimization of the Process Conditions

HUANG Ji-hao， WANG Xin-rui， YANG Rong， CHEN Yi-ming， ZHANG Yan-ge， WANG Lu， CHEN Xiao-feng， YAO Guang-shan *

（College of Geography and Oceanography， Minjiang University / Fujian Research Center of Marine Organism and Pharmaceutical Engineering， Fuzhou， Fujian 350108， China）

Abstract： In order to obtain the marine red yeast strains with high yield of carotenoids， 228 strains of marine red yeast were obtained from various marine environmental samples in the sea areas of Fujian Province. Through the screening and identification of the carotenoid-producing marine red yeast， the target strain Y37 was obtained， and the fermentation medium conditions were further optimized by single factor test and verified by shake flask. The results showed that： the strain Y37 was identified as the subspecies of Rhodotorula mucilaginosa. The best carbon source for the fermentation and production of carotenoid was mannitol， the best nitrogen source was fish meal， and the best salt concentration in the culture medium was 3%. Under the optimal fermentation conditions， the yield of carotenoid reached 128 ug·L?1 in the shake-flask fermentation of strain Y37. Therefore， the microbial strains repository of marine yeast with the high-yielding carotenoid potential was isolated and obtained from various marine habitats in this study， which provided a new way for the large-scale preparation of carotenoids.

Key words： Carotenoids；Marine red yeast；Carbon source；Nitrogen source；Salt concentration

類胡蘿卜素是一類含四十個碳的脂溶性萜烯類化合物，廣泛存在于高等植物、藻類、真菌和細菌中。在水果中類胡蘿卜素是多種色素的主要成分，在藻類中類胡蘿卜素參與生長、發育及對環境刺激的應答[1]。在植物中類胡蘿卜素化合物還是兩個重要激素：脫落酸（ ABA ）和獨腳金內酯（ SLs ）生物合成的前體[1?2]。對人體而言，因自身不能合成，類胡蘿卜素是身體需要通過飲食補充的重要營養成分，它是體內維生素 A 的主要來源。此外，類胡蘿卜素不飽和度高，平均包含11個雙鍵，具有極強的抗氧化活性，屬于天然抗氧化劑，并且類胡蘿卜素還具有增強免疫、防止曬傷、延緩衰老和抗癌等活性[2]。作為營養補充劑或預防性藥物，類胡蘿卜素已被廣泛應用，比如，Lem 等[3]通過調查發現補充類胡蘿卜素提高了糖尿病視網膜病變患者中玉米黃質和葉黃質的含量，改善了患者的視力。類胡蘿卜素通過保護 DNA 穩定顯示了抗腫瘤活性[4]。預計到2026年，類胡蘿卜素全球每年的市場產值約為20億美元[5]。制備類胡蘿卜素的方法主要有生物法和化學法。化學法可以高效地合成類胡蘿卜素，但是研究發現化學合成的類胡蘿卜素，其生物活性明顯不如天然來源產物，且現有的有機合成路線能耗高、效率低、易產生有毒有害物質[6]。在生物法中，微生物能夠利用廉價底物發酵從而大規模生產類胡蘿卜素，容易實現工業化，是未來最有潛力的類胡蘿卜素生產方式[7]。

自然界中存在一類酵母，它胞內能夠積累各種顏色的類胡蘿卜素化合物，這類酵母統稱為紅酵母。紅酵母由于色素產量高、生長速度快、易于培養等優點，成為類胡蘿卜素化合物的最有潛力的生產者。常見的紅酵母包括：解脂耶氏酵母 Yarrowial- ipolytica 、粘紅酵母 Rhodotorula glutinis 、圓紅冬孢酵母 Rhodosporidium toruloides 等。紅酵母是一種性能優良的產油酵母，不僅能夠積累大量的類胡蘿卜素，有報道發現其在特定條件下高密度發酵產量非常可觀。張志平等[8]利用光脅迫誘導粘紅酵母生產類胡蘿卜素，經過培養條件優化，類胡蘿卜素產量達到17.3 mg·L?1。Dias C 等[9]通過共培養策略在添加甘蔗糖蜜和尿素條件下顯著提高了圓紅冬孢酵母的生產能力，類胡蘿卜素產量達到10.47μg·L?1·h?1。相較于陸生微生物，海洋來源的酵母因具有更好的高壓、高鹽等耐受能力，被認為在活性天然產物和蛋白質合成方面具有諸多優勢，比如產率更高、發酵魯棒性更強等[10?11]。然而，有關海洋酵母生產類胡蘿卜素方面的研究較少，且主要研究集中在海洋酵母在水產養殖中的益生作用[12?13]。

因此，本研究從各種海洋生境中分離獲得了大量的酵母菌株資源，形成了一個包含5個屬、12種的海洋酵母菌種資源庫，通過產類胡蘿卜素海洋紅酵母的篩選，獲得目標菌株 Y37，進一步通過單因素試驗優化發酵培養基條件并搖瓶驗證，為規模化制備類胡蘿卜素提供了新途徑。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養條件

海洋酵母菌株加入30%甘油，置于?80℃冰箱，保藏于閩江學院地理與海洋學院海洋生物技術中心實驗室。酵母菌株的活化及培養均使用 mYPD 培養基（酵母提取物1%、蛋白胨2%、葡萄糖2%、海鹽3%）。酵母菌分離采用 WL 培養 基（酪蛋白酶解物0.5%、酵母提取物0.4%、葡萄糖5%、氯化鉀0.0425%、氯化鈣0.0125%、硫酸鎂0.0125%、氯化鐵0.00025%、硫酸錳0.0025%、氯化鈣0.125%、溴甲酚綠0.022%）

1.2 試劑

β-胡蘿卜素標準品購買自上海阿拉丁生化科技 股份有限公司，ITS 引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，培養基所含成分等購自生工生 物工程（上海）股份有限公司，無機鹽、緩沖液等 購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 菌株獲得

本研究涉及的樣品包括2020年取自漳江口紅樹林保護區的底泥、2022年取自連江鮑魚養殖區的底泥和海參糞便。所有樣品加入無菌水（體積比1%）后，取100 uL 涂布 WL 培養平板，置于28℃培養10 d ，挑取單菌落進行劃線純化2次。

1.4 產類胡蘿卜素菌株篩選

利用 mYPD 液體培養基對4株海洋紅酵母進行搖瓶發酵試驗，發酵條件為30℃ ， 轉速為150 r·min?1，接種量為5%，發酵時間為96 h 。對發酵液中類胡蘿卜素產量在0、24、48、72、96 h 進行取樣測定。通過比較類胡蘿卜素產量，獲得產量最高菌株作為目標菌株，進行后續研究。

1.5 產類胡蘿卜素菌株的鑒定

利用特異性引物 ITS1（ TCCGTAGGTGAA-CCTGCGC ）和 ITS4（ TCCTCCGCTTATTGATA- TGC ），以 Y37的菌液為模板，擴增其 ITS 序列。以 Y37的 ITS 序列為 Query ，對非冗余基因序列數據庫進行 BLAST 比對分析（默認參數）；下載序列相似度最高的前10條序列及釀酒酵母的 ITS 序列作為屬外參照，利用 MEGA6.0軟件構建系統發育樹。進化樹構建方法為 N-J 樹，比對模型為泊松分布，計算次數為2000。

1.6 單因素試驗

碳源優化試驗：以去除葡萄糖的 mYPD 培養基為基準培養基，分別以葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、海藻寡糖、甘油、山梨醇、甘露醇、淀粉為唯一碳源，添加濃度均為2%，在96h 進行取樣測定發酵液中類胡蘿卜素產量和生物量，研究碳源對海洋紅酵母 Y37生長和類胡蘿卜素合成的影響。

氮源優化試驗：以去除蛋白胨的 mYPD 培養基為基準培養基，分別以蛋白胨、硫酸銨、魚粉、硝酸銨、玉米漿、酪蛋白為唯一碳源，添加濃度均為1%，對發酵液中類胡蘿卜素產量和生物量在96h 進行取樣測定，研究氮源對海洋紅酵母 Y37產類胡蘿卜素的影響。

鹽濃度優化試驗：在 YPD 培養基中，分別添加0、1%、2%、3%、5%海鹽，對發酵液中類胡蘿卜素產量和生物量在96 h 進行取樣測定，研究鹽濃度對海洋紅酵母 Y37產類胡蘿卜素的影響。

1.7 發酵驗證

以甘露醇為唯一碳源，添加濃度2%，以魚粉為氮源，添加濃度為1%，海鹽添加濃度為3%，接種量為5%，發酵時間96 h ，發酵結束后，取樣測定類胡蘿卜素的濃度。

1.8 類胡蘿卜素和酵母生物量測定

類胡蘿卜素總量的測定采用紫外可見分光光度法[14]。首先，利用β-胡蘿卜素標準溶液繪制標準曲線。然后，吸取發酵液1 mL ，加入等體積的丙酮混勻，超聲提取3次后，利用酶標儀測定類胡蘿卜素總量和生物量，類胡蘿卜素測定波長和生物量的測定波長分別為450 nm 和600 nm 。類胡蘿卜素總量通過基于標準品制定的標準曲線（ y=0.0334x?0.00837）進行計算。

1.9 數據分析

數據使用 Excel2021軟件進行計算處理，數據以平均值±標準偏差作圖，使用 SPSS 軟件以 one-way ANOVA 方法進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 產類胡蘿卜素海洋紅酵母的篩選

2.1.1 菌標平板表型篩選 本課題組從福建省海域的各種海洋環境樣品中分類獲得了海洋酵母菌株共228株。通過對這些菌株進行平板表型篩選，發現海洋紅酵母4株，其中 YBF6和 YBF25分離自海參糞便，而 Y37和 Y55分離自章魚的分泌物（圖1），這4株紅酵母在 YPD 平板上均顯示出不同深度的紅色。其中，Y37紅色最深，其次是 YBF6和 YBF25，Y55顏色最淺。

2.1.2 產類胡蘿素菌株篩選結果 由圖2可知，4株海洋紅酵母菌能夠合成類胡蘿卜素，其中，菌株 Y37產量最高，發酵96h 時產量為59.48 ug·L?1。其次是菌株 YBF25和 Y55，產量分別為41.33、40.11 ug·L?1，產量最低的是菌株 YBF6，僅為29.14 ug·L?1。因此，選取菌株 Y37進行后續研究。

2.2 篩選出產類胡蘿卜素菌株的鑒定

觀察菌落形態，初步推測菌株 Y37屬于紅酵母屬。進一步進行分子生物學鑒定，設計合成了 ITS1和 ITS4引物對，擴增了 ITS 序列，長度為580 bp。通過 NCBI 比對分析，發現 Y37與 Rhodotorula mucilaginosa 序列一致性最高，100%（圖3A ）。并且，下載相似度大于98%的 ITS 序列及釀酒酵母 ITS 序列，構建了系統進化樹，發現菌株 Y37與 Rhodotorula mucilaginosa 聚類到同一亞簇（圖3B），基于以上結果，菌株 Y37被鑒定為 Rhodotorula mucilaginosaY37。

2.3 碳源對菌株 Y37產類胡蘿卜素產量的影響

由圖4可知，菌株 Y37以甘露醇為碳源，產類胡蘿卜素產量最高，發酵液中的濃度為70.86 ug·L?1，其次是海藻寡糖，產量為62.28 ug·L?1，這兩種碳源在誘導 Y37產類胡蘿卜素上均優于葡萄糖。對生物量測定結果發現：以葡萄糖為碳源時，菌株 Y37的生物量積累最快最高（圖4），表明甘露醇和海藻寡糖誘導菌株 Y37產生更高的類胡蘿卜素產量與生物量無關。因此，造成這一結果的原因可能是：褐藻寡糖和甘露醇因是海帶等海洋藻類的降解產物，兩者能夠被海洋紅酵母識別，并特異性誘導代謝吸收海洋紅酵母產生類胡蘿卜素。蔗糖等其他碳源發酵，類胡蘿卜素產量顯著降低。綜上，甘露醇是菌株 Y37發酵生產類胡蘿卜素的最佳碳源。

2.4 氮源對菌株 Y37類胡蘿卜素產量的影響

由圖5可知，菌株 Y37以魚粉為氮源，產類胡蘿卜素產量最高，發酵液中的濃度為102.65 ug·L?1，顯著優于蛋白胨（70 ug·L?1左右）。以玉米漿為氮源時菌株 Y37生長最快，但其類胡蘿卜素產量卻相對較低，顯著低于魚粉、蛋白胨或酪蛋白。綜上，魚粉是菌株 Y37發酵生產類胡蘿卜素的最佳氮源。

2.5 鹽濃度對菌株 Y37類胡蘿卜素產量的影響

由圖6可知，隨著鹽濃度的提高，菌株 Y37類胡蘿卜素的產量相應增加，并且酵母生物量也相應地增加，在海鹽濃度為3%時，菌株 Y37發酵液中的類胡蘿卜素產量最高，為74.67 ug·L?1，繼續提高鹽濃度，菌株 Y37的生長受到抑制，發酵液中類胡蘿卜素產量降低。綜上，3%鹽濃度是菌株 Y37發酵生產類胡蘿卜素的最佳條件，比濃度與天然海水的鹽濃度吻合，這表明菌株 Y37在海水自然環境下生長最快，類胡蘿卜素合成最高。

2.6 發酵試驗驗證

根據上述單因素試驗結果，菌株 Y37發酵生產類胡蘿卜素的優化條件：碳源為甘露醇（2%），氮源為魚粉（1%），鹽濃度為3%，選取優化后的發酵培養基進行驗證，發酵試驗重復3次，3次試驗結果類胡蘿卜素的平均產量達到150 ug·L?1。

3 討論與結論

海洋酵母因其長期生活在高鹽、高壓、低氧、高滲等極端環境下，逐漸形成了相較于陸生酵母更強的工業發酵性能，比如發酵周期短、發酵魯棒性更好等[10?11]。此外，從發酵方面看，海洋微生物可以用海水進行發酵，將大大節省了淡水資源，為綠色可持續生物經濟提供了新方向[10，15]。比如，本研究發現添加3%海鹽的培養基最適合菌株 Y37生長和類胡蘿卜素合成，這個濃度恰好是海水中海鹽濃度。

作為一類高度不飽和的四萜烯類化合物，類胡蘿卜素具有良好的抗氧化、抗炎、抗腫瘤活性，已經廣泛應用于食品、藥品、化妝品等領域，近年來，水產養殖等其他行業對類胡蘿卜素需求也不斷增加[16]，因此，提高類胡蘿卜素的產能、降低生產成本將是重點研究方向。相較于化學合成和植物提取法，利用酵母發酵生產類胡蘿卜素是更加經濟、高效、安全和環保。然而，目前發酵法也面臨著一些問題：產量水平低、代謝產物復雜等。因此，未來需要通過各種手段進行系統改造：包括從各種生境中篩選產量更高的酵母菌種；利用基因工程手段對類胡蘿卜素生物合成途徑進行優化；通過理性設計對關鍵限速酶進行改造以提高催化效率；尋找更廉價、易利用的發酵培養基底物等等[17?19]。根據報道及本研究結果，海洋酵母因能夠代謝更多底物、耐受更高的鹽濃度等在未來菌株開發方面顯示了潛力[20]。

本研究篩選獲得了1株高產類胡蘿卜素的紅酵母菌株 Y37，并通過單因素試驗對發酵培養基中的碳源、氮源及鹽濃度進行了優化，明確了最佳碳源為甘露醇，最佳氮源為魚粉，最佳鹽濃度為3%，在此條件下海洋紅酵母 Y37合成的類胡蘿卜素產量達到128 ug·L?1，為通過酵母發酵法大規模化生產類胡蘿卜素提供了理論依據和參考。

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（責任編輯：柯文輝）