間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)降植烷誘導(dǎo)狼瘡小鼠肺泡出血的影響及可能機(jī)制

［摘要］ 目的： 探討間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）移植對(duì)降植烷誘導(dǎo)狼瘡小鼠肺泡出血的作用及可能機(jī)制。方法： 10周齡雌性C57BL/6（B6）小鼠20只腹腔注射0.5 mL降植烷，3只同周齡雌性B6小鼠腹腔注射PBS作為正常對(duì)照組。1周后將20只注射降植烷小鼠隨機(jī)分為MSC組和PBS組，分別給予尾靜脈注射1×106人臍帶來(lái)源的MSCs和PBS；觀察1周后，計(jì)算造模小鼠生存率并稱量小鼠體重，處死所有小鼠，取出肺臟，觀察肺臟大體及肺臟HE染色評(píng)估造模小鼠肺出血嚴(yán)重程度。酶消化法制備獲取3組小鼠肺臟單細(xì)胞懸液，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)3組小鼠肺部CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞，CD19+B淋巴細(xì)胞，CD11b+Gr1+中性粒細(xì)胞，F(xiàn)4/80+肺間質(zhì)巨噬細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)以及抗炎型CD206+肺間質(zhì)巨噬細(xì)胞的百分率。結(jié)果： MSC組小鼠生存率高于PBS組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.07）；體重明顯高于PBS組小鼠（Plt;0.01）；MSC組小鼠完全彌漫性肺泡出血（diffuse alveolar hemorrhage，DAH）及部分DAH的發(fā)生率低于PBS組。與PBS組相比，MSC組肺臟單細(xì)胞總數(shù)顯著減少（Plt;0.01），肺臟CD4+T細(xì)胞數(shù)量有下降趨勢(shì)，而CD8+T細(xì)胞及CD19+B細(xì)胞的數(shù)量則明顯下降（Plt;0.05），肺臟CD11b+Gr1+中性粒細(xì)胞及F4/80+巨噬細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)也均顯著降低（Plt;0.01和Plt;0.05）；此外，肺出血小鼠CD206+抗炎型巨噬細(xì)胞的百分率顯著降低（Plt;0.01），而MSC移植顯著提高CD206+抗炎型巨噬細(xì)胞的百分率（Plt;0.01）。結(jié)論： MSC移植可顯著降低狼瘡小鼠肺泡出血的發(fā)生率，其機(jī)制可能是對(duì)肺臟免疫細(xì)胞的調(diào)控及誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞CD206抗炎表型的產(chǎn)生。

［關(guān)鍵詞］ 間充質(zhì)干細(xì)胞；系統(tǒng)性紅斑狼瘡；肺泡出血；巨噬細(xì)胞；CD206

［中圖分類號(hào)］ R593.243

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

［文章編號(hào)］ 1671-7783（2024）03-0185-05

DOI： 10.13312/j.issn.1671-7783.y240008

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The effect and possible mechanism of mesenchymal stem cell transplantation on pristane induced pulmonary alveolar hemorrhage in lupus-prone mice

ZHANG Zhuoya1， CHEN Chen2， HUANG Saisai1， JIANG Bo1

（1. Department of Rheumatology and Immunology， 2. Department of Nutrition， Nanjing Drum Tower Hospital， Affiliated Hospital of Medical School， Nanjing University， Nanjing Jiangsu 210008， China）

［Abstract］ Objective： To investigate the effect of mesenchymal stem cells （MSC） transplantation on pristane induced pulmonary alveolar hemorrhage in lupus mice and explore the possible mechanism. Methods： Twenty female C57BL/6 （B6） mice at 10 weeks of age were injected with 0.5 mL pristane intraperitoneally and 3 control B6 mice were injected with the same volume of PBS. After one week， mice injected with pristane were randomly divided into two groups and intravenously injected with 1×106human umbilical cord-derived MSCs or PBS， respectively. After another week of observation， the survival rate and body weight of the two groups were recorded and all mice were sacrificed. The appearance of the lungs was observed and hematoxylin and eosin （HE） staining was performed to assess the severity of pulmonary hemorrhage. Lung single-cell suspensions were prepared by enzymatic digestion. CD4+and CD8+T lymphocytes， CD19+B lymphocytes， CD11b+Gr1+neutrophils， F4/80+macrophages and CD206+macrophages in lungs were detected by flow cytometry. Results： The survival rate of mice in the MSC group was higher than that of the PBS group， but the difference was not statistically significant （P=0.07）， and the average body weight in MSC mice was significantly increased （Plt;0.01） than that in PBS group. The incidences of complete diffuse alveolar hemorrhage and partial diffuse alveolar hemorrhage in the MSC group were lower than that in the PBS group. Compared with the PBS mice， the total number of lung cells in the MSC group was significantly reduced （Plt;0.01） than that in the PBS group. The number of lung CD4+T cells in the MSC group showed a decreased tendency， while the numbers of CD8+T cells and CD19+B cells were significantly decreased （Plt;0.05） in the MSC group than that in the PBS group. The absolute numbers of CD11b+Gr1+neutrophils and F4/80+macrophages in lungs of MSC treated mice were also markedly reduced （Plt;0.01 and Plt;0.05）. In addition， the percentage of CD206+anti-inflammatory macrophages in lungs of pulmonary hemorrhage mice was significantly reduced （Plt;0.01）， while the percentage of CD206+anti-inflammatory macrophages was significantly increased by MSC transplantation （Plt;0.01）. Conclusion： MSC transplantation can significantly reduce the incidence of pulmonary hemorrhage in lupus-prone mice， which may attributed to the regulation of lung immune cells and the induction of CD206 anti-inflammatory macrophages by MSCs.

［Key words］ mesenchymal stem cell; systemic lupus erythematosus; alveolar hemorrhage; macrophage; CD206

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種可累及全身多個(gè)系統(tǒng)器官的自身免疫性疾病，肺臟也不例外［1］。彌漫性肺泡出血（diffuse alveolar hemorrhage，DAH）是SLE患者肺臟受累的一種表現(xiàn)，雖不常見(jiàn)，但病死率高。DAH的主要臨床表現(xiàn)為咯血、血紅蛋白進(jìn)行性下降、低氧血癥甚至呼吸衰竭，肺部CT可見(jiàn)彌漫性的肺泡浸潤(rùn)或?qū)嵶?，短期之?nèi)可危及生命。既往研究發(fā)現(xiàn)成年SLE患者DAH的發(fā)生率為0.5%～5.7%，而死亡率超過(guò)30.0%［2-3］。DAH是SLE患者最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，需要及時(shí)診斷及治療。傳統(tǒng)的治療方法包括大劑量糖皮質(zhì)激素沖擊、環(huán)聯(lián)酰胺、血漿置換以及生物制劑如利妥昔單抗等［1］。因?yàn)槿狈﹄S機(jī)對(duì)照研究，這些方法的療效尚不確切，且可能發(fā)生致死性感染。因此，亟需尋找治療DAH的新方法。

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一群具有多向分化能力和免疫調(diào)節(jié)作用的干細(xì)胞［4］?；谄鋸?qiáng)大的組織修復(fù)作用及免疫調(diào)節(jié)功能，自2007年至今，我們中心應(yīng)用MSCs治療包括SLE在內(nèi)的自身免疫性疾病患者已達(dá)數(shù)百例，取得良好療效，且未發(fā)現(xiàn)移植相關(guān)嚴(yán)重不良反應(yīng)，提示MSCs對(duì)自身免疫性疾病具有治療作用及安全性［5-6］。DAH疾病兇險(xiǎn)，一旦發(fā)生，救治難度大，因此，早期控制病情進(jìn)展尤為重要。本研究利用經(jīng)典的降植烷誘導(dǎo)狼瘡鼠肺泡出血模型，在模型小鼠發(fā)病前移植MSC，觀察MSC對(duì)其發(fā)生DAH的影響，并通過(guò)對(duì)肺臟免疫細(xì)胞的檢測(cè)探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

C57BL/6（B6）小鼠購(gòu)自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所，飼養(yǎng)于南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心無(wú)特定病原體（specific pathogen free，SPF）級(jí)動(dòng)物房，使用獨(dú)立送風(fēng)隔離籠，伴12 h調(diào)節(jié)光照模擬晝夜交替。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)和所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作均獲得南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)的審核批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑及儀器

降植烷、Ⅰ型膠原酶、DNA酶Ⅰ（美國(guó)Sigma公司）；PBS、蘇木素、伊紅（武漢博士德生物工程有限公司）；抗小鼠CD4-FITC、CD8-PE、CD19-APC、CD11b-PerCP-Cyanine5.5、Gr1-FITC、F4/80-FITC、CD206-APC等流式抗體（美國(guó)eBioscience公司）。Countstar細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，BD Calibur流式細(xì)胞儀。

1.3 狼瘡DAH模型鼠的建立及MSC移植

20只B6雌性小鼠于8～10周齡腹腔注射0.5 mL降植烷，3只同周齡雌性B6小鼠腹腔注射PBS作為正常對(duì)照組。1周后20只注射降植烷的造模小鼠隨機(jī)分為MSC組與PBS組，MSC組小鼠通過(guò)尾靜脈注射1×106MSC，PBS組通過(guò)尾靜脈注射等體積的PBS。移植后觀察1周，統(tǒng)計(jì)兩組小鼠生存率及體重，并在造模后第14天處死所有小鼠。

1.4 HE染色觀察模型小鼠肺組織病理

留取小鼠肺臟，觀察評(píng)估肺泡出血的程度并拍照。PBS組和MSC組各留取3只小鼠肺臟4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，然后進(jìn)行HE染色，顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 肺臟單細(xì)胞懸液制備

取3組小鼠分離肺組織，剪碎后加入含Ⅰ型膠原酶及DNA酶Ⅰ的組織消化液，置于37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱1 h，消化結(jié)束后將組織懸液轉(zhuǎn)移至過(guò)濾網(wǎng)，用注射器的內(nèi)芯研磨組織塊至濾網(wǎng)不再剩余紅色組織，收集細(xì)胞并裂解紅細(xì)胞后加入適量PBS重懸備用。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肺臟免疫細(xì)胞

細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)定對(duì)照組、PBS組和MSC組小鼠肺臟單細(xì)胞的數(shù)量；肺臟單細(xì)胞懸液分別用相應(yīng)熒光抗體標(biāo)記后，上機(jī)流式細(xì)胞儀檢測(cè)并計(jì)算CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞、CD19+B淋巴細(xì)胞、CD11b+Gr1+中性粒細(xì)胞、F4/80+肺間質(zhì)巨噬細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)以及抗炎型CD206+肺間質(zhì)巨噬細(xì)胞的百分率。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用GraphPad Prism 9.5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和繪圖。兩組生存曲線比較采用Log-Rank法；定量數(shù)據(jù)以x±s表示，兩組均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，三組間的比較采用單因素方差分析，組間比較采用Tukey檢驗(yàn)。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PBS組和MSC組小鼠生存率分析

PBS組小鼠在降植烷注射后第12天和第13天分別出現(xiàn)1只和2只小鼠死亡；而MSC組小鼠直至第14天觀察終點(diǎn)未出現(xiàn)小鼠死亡（圖1）。兩組生存曲線比較，MSC組小鼠生存率高于PBS組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.34，P=0.07）。

2.2 PBS組和MSC組小鼠體重比較

PBS組小鼠在降植烷注射1周后開(kāi)始出現(xiàn)體重下降，在第14天時(shí)體重顯著低于造模前（t=4.93，Plt;0.01）及造模后第7天（t=4.96，Plt;0.01）；MSC組小鼠體重?zé)o明顯下降。在觀察終點(diǎn)，MSC組小鼠體重顯著高于PBS組（t=3.72，Plt;0.01）。

2.3 DAH模型小鼠肺出血大體病理及HE染色結(jié)果

對(duì)DAH模型小鼠肺臟大體及顯微鏡下觀察可見(jiàn)（圖3A），無(wú)DAH發(fā)生的小鼠肺臟為粉白色，HE染色肺泡結(jié)構(gòu)完整，血管和支氣管周圍無(wú)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡腔無(wú)紅細(xì)胞填充；發(fā)生部分DAH的小鼠肺臟為暗紅粉白相間，部分充血，顯微鏡下肺泡結(jié)構(gòu)不完整，血管和支氣管周圍可見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡腔被紅細(xì)胞部分填充；而完全DAH整肺為暗紅色，充血明顯，HE染色鏡下觀察可見(jiàn)肺泡結(jié)構(gòu)模糊不清，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)在血管及支氣管周圍，紅細(xì)胞幾乎填滿支氣管及肺泡腔。

PBS組小鼠有60%發(fā)生完全DAH，20%發(fā)生部分DAH，20%無(wú)DAH；而MSC組小鼠僅20%發(fā)生完全DAH，10%發(fā)生部分DAH，70%無(wú)DAH（圖3B）。

2.4 3組小鼠肺臟單細(xì)胞總數(shù)比較

與正常對(duì)照小鼠相比，PBS組小鼠肺臟單細(xì)胞總數(shù)顯著增加（q=8.28，Plt;0.01）；而MSC組小鼠肺臟單細(xì)胞總數(shù)較PBS組顯著下降（q=8.28，Plt;0.01），見(jiàn)圖4。

2.5 3組小鼠肺臟T、B淋巴細(xì)胞數(shù)量比較

如圖5所示，肺臟CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)PBS組小鼠較正常對(duì)照組小鼠升高，MSC組小鼠較PBS組降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。肺臟CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)PBS組小鼠較正常對(duì)照組小鼠顯著升高（q=5.23，Plt;0.01），MSC組小鼠較PBS組顯著降低（q=3.82，Plt;0.05）。此外，MSC組小鼠肺臟CD19+B細(xì)胞的數(shù)量較PBS組顯著減少（q=5.08，Plt;0.05）。

2.6 3組小鼠肺臟中性粒細(xì)胞與巨噬細(xì)胞數(shù)量比較

如圖6所示，PBS組小鼠肺臟CD11b+Gr1+中性粒細(xì)胞及F4/80+巨噬細(xì)胞較正常對(duì)照組小鼠明顯增多（q=8.34，Plt;0.01和q=4.55，Plt;0.05），而MSC組小鼠肺臟CD11b+Gr1+中性粒細(xì)胞及F4/80+巨噬細(xì)胞與PBS組相比則顯著降低（q=8.81，Plt;0.01和q=4.93，Plt;0.05）。與正常對(duì)照組小鼠相比，PBS組小鼠F4/80+巨噬細(xì)胞中CD206+的百分率顯著降低（q=6.71，Plt;0.01），MSC組F4/80+巨噬細(xì)胞中CD206+的百分率較PBS組則顯著升高（q=5.39，Plt;0.01）。

3 討論

DAH是SLE患者危及生命的并發(fā)癥，死亡率高。我國(guó)的一項(xiàng)大型SLE-DAH隊(duì)列研究發(fā)現(xiàn)DAH更傾向于發(fā)生在SLE的早期病程中，有五分之一的患者以DAH為SLE的最初發(fā)病表現(xiàn)；DAH更是導(dǎo)致SLE患者生存率降低的獨(dú)立因素［7］。研究發(fā)現(xiàn)MSC移植能夠顯著提高狼瘡小鼠模型的生存率［8-9］，而接受MSC的難治性SLE患者5年生存率達(dá)84%［5］。早在2010年及2012年本中心就報(bào)道了MSC成功治療4例對(duì)傳統(tǒng)治療（大劑量激素、丙種球蛋白、環(huán)磷酰胺等）無(wú)效的SLE-DAH患者，發(fā)現(xiàn)MSC移植顯著減輕患者咳嗽、呼吸困難、貧血等臨床癥狀，改善患者氧合及肺部影像學(xué)表現(xiàn)［10-11］。本研究也表明MSC能改善SLE-DAH小鼠的生存率，降低DAH的發(fā)生率及嚴(yán)重程度，提示MSC移植為治療SLE-DAH的潛在新方法。但MSC移植治療對(duì)SLE-DAH患者生存率的影響及確切的療效則需要將來(lái)大樣本臨床研究進(jìn)一步確定。

DAH的發(fā)病機(jī)制目前尚不完全清楚，主要的病理機(jī)制可能是B細(xì)胞產(chǎn)生的自身抗體與自身抗原結(jié)合形成免疫復(fù)合物，導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和凋亡，招募中性粒細(xì)胞形成中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)（neutrophil extracellular traps，NETs）及單核巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，導(dǎo)致毛細(xì)血管和肺泡基底膜的破壞，最終大量的紅細(xì)胞進(jìn)入肺泡腔。除了免疫細(xì)胞，補(bǔ)體系統(tǒng)的激活及炎癥因子也參與了SLE-DAH的發(fā)?。?］。對(duì)SLE-DAH發(fā)病機(jī)制的研究主要基于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。B6小鼠在降植烷注射10 d后即可發(fā)生肺泡出血，注射后14 d達(dá)發(fā)病高峰，在注射3～6個(gè)月后可出現(xiàn)球蛋白升高、自身抗體、關(guān)節(jié)炎以及腎小球腎炎等狼瘡樣癥狀，與SLE的臨床表現(xiàn)極為相似，因此，降植烷誘導(dǎo)的肺泡出血模型是公認(rèn)的研究SLE-DAH的模型［12-13］。Barker等［14］發(fā)現(xiàn)，Ｂ細(xì)胞Igμ-/-小鼠在注射降植烷后，肺出血發(fā)生率顯著降低；Zhuang等［15］研究發(fā)現(xiàn)，B細(xì)胞缺陷的小鼠注射降植烷后不發(fā)生肺泡出血，表明B細(xì)胞在SLE-DAH發(fā)病中的重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)清除NETs可減輕SLE-DAH肺臟損傷并提高生存率，提示中性粒細(xì)胞也參與其發(fā)病［16］。而利用脂質(zhì)體清除小鼠巨噬細(xì)胞后，其發(fā)生肺泡出血的百分率也顯著下降［15］；有趣的是，并不是所有的巨噬細(xì)胞都參與致病作用，Shi等［17］發(fā)現(xiàn)給小鼠腹腔注射CD206+巨噬細(xì)胞可顯著降低DAH發(fā)生率并改善病情。與既往研究相似，本研究中降植烷誘導(dǎo)SLE-DAH模型小鼠肺臟CD8+T細(xì)胞、CD19+B細(xì)胞、CD11b+Gr1+中性粒細(xì)胞及F4/80+巨噬細(xì)胞的數(shù)量與正常對(duì)照鼠相比均顯著增多，而CD206+巨噬細(xì)胞的相對(duì)數(shù)量則顯著下降，這表明SLE-DAH發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，多種免疫細(xì)胞均參與其發(fā)病過(guò)程。

MSC對(duì)多種免疫細(xì)胞均有調(diào)節(jié)作用，這是其治療SLE的機(jī)制之一［18］。研究發(fā)現(xiàn)MSC可抑制SLE患者效應(yīng)性T細(xì)胞的增殖，促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的產(chǎn)生；MSC能通過(guò)分泌趨化因子配體2（CCL2）抑制B細(xì)胞分化為漿細(xì)胞；MSC還可上調(diào)狼瘡患者及狼瘡鼠腎臟巨噬細(xì)胞CD206的表達(dá)，并增強(qiáng)其吞噬功能［19］。本研究結(jié)果顯示MSC治療后DAH小鼠CD8+T細(xì)胞、CD19+B細(xì)胞、CD11b+Gr1+中性粒細(xì)胞及F4/80+巨噬細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量均顯著降低，且MSC移植顯著提高肺臟巨噬細(xì)胞CD206的表達(dá)。肺臟是MSC靜脈輸注至受體后最先到達(dá)的內(nèi)臟器官，而SLE-DAH小鼠肺臟有大量免疫細(xì)胞浸潤(rùn)，因此，我們推測(cè)MSC通過(guò)調(diào)控肺臟免疫細(xì)胞改善DAH病情。但MSC如何調(diào)控DAH小鼠肺臟免疫細(xì)胞尚不清楚。Chen等［20］發(fā)現(xiàn)來(lái)源于MSC的外泌體能夠改善DAH小鼠肺臟損傷并上調(diào)抗炎型M2巨噬細(xì)胞的水平。這提示MSC移植入受體后或許能通過(guò)分泌外泌體調(diào)控免疫細(xì)胞從而發(fā)揮治療作用。

綜上所述，MSC移植可顯著降低狼瘡小鼠肺泡出血的發(fā)生率及嚴(yán)重程度，提高其生存率，其機(jī)制可能是對(duì)肺臟免疫細(xì)胞的調(diào)控及上調(diào)巨噬細(xì)胞CD206的表達(dá)。本研究為應(yīng)用MSC治療SLE-DAH患者提供了理論基礎(chǔ)，但MSC對(duì)SLE-DAH患者的確切療效及具體機(jī)制則需要更多的臨床及基礎(chǔ)研究。

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［收稿日期］ 2024-01-16" ［編輯］ 何承志

［基金項(xiàng)目］國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81901644）；南京市衛(wèi)生科技發(fā)展專項(xiàng)資金項(xiàng)目（YKK19051）

［作者簡(jiǎn)介］張卓亞（1989—），男，主治醫(yī)師；姜波（通訊作者），主任醫(yī)師，E-mail： Bogermany@163.com