骨髓間充質干細胞分離培養體系的優化篩選

陳麗燕++鄧麗青++陳金花++鐘郁++劉佳

摘 要：為優化骨髓間充質干細胞的分離和培養方法，采用改良的骨髓沖洗法分離骨髓干細胞，細胞接種后，比較不同體積分數胎牛血清（5%，10%，20%）、不同的DMEM/F12、H-DMEM和L-DMEM培養基，進行細胞培養，比較細胞生命狀態。結果顯示不使用篩網細胞分離細胞，應用含體積分數為10%胎牛血清的DMEM/F12M培養基培養，能夠提高培養效率。

關鍵詞：間充質干細胞；骨髓；培養

中圖分類號：R329 文獻標識碼：A 文章編號：1671-2064（2017）19-0200-02

骨髓間充質干細胞（Bone marrow mesenchymalstem cells，BMSCs）是指存在于骨髓基質中的非造血組織的間充質干細胞，在體內分布于多種組織和器官，并具有多向分化潛能。它有著廣泛的來源，包括骨髓，骨骼肌，軟骨，骨，肌腱等[1]。故在干細胞研究領域中具有突出的優勢。本實驗對小鼠BMSCs的生物學性進行研究，旨在建立體外分離培養BMSCs的方法，培養出生長狀態良好，足夠數量的骨髓間充質干細胞是應用的前提，進一步為組織工程、細胞治療和基因治療研究提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗動物：6-8周齡SPF級昆明小鼠20只，體重30-40g （雌雄不拘），購自斯萊克景達公司，在本校標準化實驗動物中心常規飼養。

主要試劑：DMEM/F12（Biological Industries公司）、H-DMEM培養基及L-DMEM 培養基（Sangon Biotech公司）、胎牛血清（FBS）（Sigma公司）、胰酶（GENVIEW公司）。

1.2 細胞分離方式

小鼠脫頸處死，置于75%無水乙醇的燒杯中浸泡5min，在無菌條件下取后腿股骨，清除表面肌肉組織。刺穿股骨，分別用DMEM/F12、H-DMEM或L-DMDM培養液（含10% FBS）沖洗骨髓，200目篩網過濾后，用1ml注射器注入細胞培養瓶，37℃，CO2培養。常規培養3～4天后用PBS沖洗兩遍，全量換液去除非貼壁細胞。當細胞生長至約80%融合時，用0.25%胰酶和0.01%EDTA消化，計數，傳代。

1.3 細胞培養體系比較

（1）不同血清含量的比較：分離后的單個核細胞以1×106接種至6孔板中，用DMEM/F12培養液含5%，10%，20%FBS進行培養，比較細胞生長情況。

（2）不同類型培基比較：分離后的單個核細胞以1×106接種至6孔板中，用10%胎牛血清DMEM/F12、H-DMEM和L-DMEM分別培養，比較細胞貼壁與生長情況。

2 結果

2.1 細胞分離方式

使用篩網細胞殘留少，培養時細胞密度過低，難以存活，BMSCs數量少（圖1）；不使用篩網，可獲取更多細胞，能使BMSCs貼壁與伸展，存活率明顯高些（圖2）。

2.2 細胞培養情況

2.2.1 不同血清濃度

用DMEM/F12培養液含5%，10%，20%FBS進行培養時，最佳的血清濃度是10%，細胞增殖旺盛，形態均一，易于傳代。過高的血清濃度>15%時，會導致細胞出現分化的現象，傳代較難。過低的血清會<10%時，導致細胞的增殖速度下降，未能增值傳代。

2.2.2 不同類型培基

10%胎牛血清的DMEM/F12細胞培養按照1：1比例混合效果最佳，營養成分豐富，呈長棱形成纖維細胞樣的細胞。（圖3）10%胎牛血清的H-DMEM細胞培養，可見數個成纖維細胞樣，細胞輪廓增強，細胞折光性變弱，細胞胞質中出現空泡、脂滴和其他顆粒狀物質。（圖4）。含10%胎牛血清的L-DMEM培養，僅見個別成纖維細胞樣，細胞形態出現多樣性，貼壁細胞浮起。（圖5）

3 討論

間充質干細胞來源于中胚層，具有很強的自我復制能力和多向分化潛能，它分布于全身各結締組織，尤以骨髓中含量最多，但即使是在骨髓中，BMSCs的豐度也不高，每105-106個單核細胞中大約含一個BMSCs，并且隨著年齡的增長，BMSCs含量逐漸減少[1]。BMSCs具有支持造血，促進造血干細胞移植后造血功能恢復、預防和減輕移植后的移植物抗宿主病的潛能[2，4]。因此，建立一個體外適宜BMSCs生長培養體系是顯得至關重要。

MSCs的分離技術和方法主要有4種：貼壁法、流式細胞儀分離法、密度梯度離心法和免疫磁珠法。應用流式細胞儀分離法或免疫磁珠法，雖可以得到純度較高的細胞，但成本昂貴，在分離過程對細胞的活性影響較大，甚至導致細胞完全失去活性。使用percol1分離液梯度離心的方法，能有效地將紅細胞、白細胞，和間充質干細胞分離開來，同時操作簡單，快速，對細胞的活性影響較小，但要是血管中細胞量少，分離得到的單個核細胞數量更少，不利于細胞的生長。貼壁法是骨髓間充質干細胞最初的分離培養方法，至今仍是一種得到廣泛應用的經典途徑[3，5]。本實驗采用貼壁培養法，并經過體外貼壁培養一段時間，通過換液去除懸浮生長的造血細胞，從而獲得BMSCs。

在原代分離時，細胞分離方式中是否使用篩網對BMSCs的生長有一定影響，使用篩網細胞的密度過低，存活率難，BMSCs數量少；而無使用篩網細胞，能使BMSCs貼壁與伸展，存活率高，可獲取更多細胞。最佳的血清濃度是10%，生長最為旺盛：血清濃度<10%，不利于細胞生長；血清濃度>15%時，易引起細胞分化而影響增值。應用L-DMEM培基未能獲得可增殖傳代的間充質干細胞，H-DMEM培基獲得少量可增值傳代細胞，而DMEM/F12和得到了均一的、可傳代的間充質干細胞。

本實驗對其分離、培養條件進行優化，結果顯示不使用篩網細胞，應用含體積分數為10%胎牛血清的DMEM/F12M培養基培養，能夠提高培養效率。

參考文獻

[1]張怡，趙連三，唐紅，等.小鼠骨髓間充質干細胞的分離與培養[J].生物醫學工程學雜志，2004，21（5）：746-748，765.

[2]宋一雪，王軍，陳虎.間充質干細胞在造血干細胞移植中的應用[J].現代生物醫學進展，2009，9（5）：986-1000.

[3]裴瑛波.骨髓間充質干細胞分離培養和定向分化的研究現狀[J].中國組織工程研究與臨床康復，2009，13（14）：2775-2778.

[4]金建剛，馮凱，石炳毅，等.MSCs誘導移植物免疫耐受的研究進展[J].臨床血液學雜志，2009，22：58-60.

[5]宮曉潔，孫莉，黎靖宇.小鼠骨髓間充質干細胞的分離培養及形態學觀察[J].解剖學研究，2008，30（1）：54-56.endprint