牛源多殺性巴氏桿菌的分離鑒定及耐藥性分析

摘要：為了鑒定萊陽(yáng)地區(qū)規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)中引起8月齡肉牛呼吸道病死亡的病原菌，并分析其耐藥性，指導(dǎo)臨床合理用藥。本試驗(yàn)于2023年4月采集萊陽(yáng)地區(qū)規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)中疑似感染多殺性巴氏桿菌的8月齡肉牛死亡的鼻拭子、肺臟、肝臟等病料組織樣品4份，采用細(xì)菌分離培養(yǎng)和PCR方法對(duì)采集的疑似感染多殺性巴氏桿菌的8月齡死亡肉牛的鼻拭子、肺臟、肝臟等組織樣品進(jìn)行多殺性巴氏桿菌分離鑒定，采用人工感染小鼠試驗(yàn)和K-B藥敏紙片法分別檢測(cè)分離多殺性巴氏桿菌的致病性對(duì)常用抗菌藥物耐藥性。結(jié)果顯示：從采集的死亡肉牛的鼻拭子、肺臟、肝臟等病料組織樣品分離到1株多殺性巴氏桿菌，并命名為L(zhǎng)YP-1株;人工感染小鼠致病試驗(yàn)顯示，LYP-1株致病性多殺性巴氏桿菌能引起小鼠死亡率為100%;分離的HS-1株對(duì)頭孢噻呋、頭孢噻肟、頭孢曲松等6種藥物敏感，對(duì)其他藥物產(chǎn)生不同程度的耐藥。本研究為該地區(qū)肉牛源多殺性巴氏桿菌病的防控及臨床合理用藥提供參考。

關(guān)鍵詞：肉牛;多殺性巴氏桿菌;致病性;耐藥性分析

牛呼吸系統(tǒng)疾病（BRD）成為肉牛養(yǎng)殖危害較大的疾病之一，該病又被稱為 “爛肺病或運(yùn)輸熱”，經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)，臨床中BRD引起肉牛的死亡率高達(dá)60%，給我國(guó)肉牛養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，危害著我國(guó)牛養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[1]。多殺性巴氏桿菌是引起B(yǎng)RD主要的病原菌之一，該菌引起牛的一種傳染性敗血性呼吸道疾病，臨床中主要以敗血型和肺炎型為主，其中以急性敗血癥為常見(jiàn)，該病可以感染不同階段的牛，尤其是對(duì)犢牛和育肥牛最易感，臨床中以敗血癥、呼吸困難、腹瀉等多種癥狀為常見(jiàn)，對(duì)不同階段牛的感染率和死亡率均較高，給養(yǎng)牛業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2-3]。相關(guān)研究表明，在不同類型的牛（奶牛、肉牛）養(yǎng)殖過(guò)程中多殺性巴氏桿菌可以通過(guò)不同的途徑感染不同階段的牛（犢牛、育成牛及成年牛），且經(jīng)常與溶血性曼氏桿菌病、支原體等多種呼吸疾病混合感染，可以加快牛的死亡，給臨床診斷和治療帶來(lái)一定的困難[4-5]。多殺性巴氏桿菌具有5種血清型，多殺性巴氏桿菌病已經(jīng)成為世界中多個(gè)國(guó)家和地區(qū)養(yǎng)牛場(chǎng)中普遍流行疾病之一，不同的國(guó)家與地區(qū)流行的多殺性巴氏桿菌的血清型具有差異性，在疫苗制備中存在一定的困難，沒(méi)有有效疫苗進(jìn)行預(yù)防[6]。在肉牛養(yǎng)殖過(guò)程中隨著臨床中抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，多殺性巴氏桿菌已經(jīng)產(chǎn)生嚴(yán)重耐藥性，給臨床中的治療帶來(lái)一定困難，同時(shí)抗菌藥物的不合理的使用嚴(yán)重危害著人們的健康[7]。

本研究于2023年4月采集萊陽(yáng)地區(qū)規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)中疑似感染多殺性巴氏桿菌的8月齡死亡肉牛的鼻拭子、肺臟、肝臟等病料組織樣品4份進(jìn)行多殺性巴氏桿菌分離鑒定，并進(jìn)行致病性和耐藥性檢測(cè)，以期為萊陽(yáng)地區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)中肉牛源多殺性巴氏桿菌病的防控及臨床合理用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料來(lái)源

2023年4月采集萊陽(yáng)地區(qū)規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)中疑似感染多殺性巴氏桿菌的8月齡死亡肉牛的鼻拭子、肺臟、肝臟等病料組織樣品4份，其中鼻拭子2份、肺臟1份、肝臟1份。

1.2 細(xì)菌分離與培養(yǎng)

將采集萊陽(yáng)地區(qū)規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)中疑似感染多殺性巴氏桿菌的8月齡死亡肉牛的鼻拭子、肺臟、肝臟等病料組織樣品，在無(wú)菌的條件下分別接種于10%兔血巧克力瓊脂培養(yǎng)基和10%綿羊血鮮血培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)12～18 h后，挑取10%兔血巧克力瓊脂培養(yǎng)基和10%綿羊血鮮血培養(yǎng)基上單個(gè)的典型菌落進(jìn)行瑞氏染色后，在顯微鏡下觀察其分離菌株的形態(tài)學(xué)。

1.3 細(xì)菌生化特性鑒定

在無(wú)菌的條件下，挑取10%綿羊血鮮血培養(yǎng)基上單個(gè)的典型的菌落，接種于TSB液體養(yǎng)基中，在37 ℃恒溫條件下振蕩培養(yǎng)12～18 h后;按照革蘭氏陰性菌的生化試劑盒說(shuō)明書(shū)，用無(wú)菌的TSB液體養(yǎng)基調(diào)整菌液濃度為0.5個(gè)麥?zhǔn)蠞岫龋尤敫锾m氏陰性菌的生化試劑條中進(jìn)行生化培養(yǎng)與鑒定。

1.4 細(xì)菌PCR鑒定

參照參考文獻(xiàn)[3-4]報(bào)道的多殺性巴氏桿菌分離菌株鑒定引物，F(xiàn)1：5'- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG - 3';F2：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT -3'，引物大小為1 044 bp。引物序列在華大基因合成，采用水煮法提取LYP-1株的基因組DNA，以提取的基因組LYP-1株的DNA為模板用多殺性巴氏桿菌分離菌株鑒定引物進(jìn)行PCR鑒定。

1.5 致病性試驗(yàn)

在無(wú)菌的條件下，挑取10%綿羊血鮮血培養(yǎng)基上單個(gè)的典型菌落，接種于TSB液體養(yǎng)基中，在37 ℃恒溫條件下振蕩培養(yǎng)對(duì)數(shù)期，用菌落計(jì)數(shù)法對(duì)LYP-1株進(jìn)行計(jì)數(shù)，用TSB液體養(yǎng)基調(diào)整菌液濃度為108 cfu/mL，攻毒組通過(guò)腹腔注射攻毒方式攻毒5只昆明系小鼠，其注射劑量為0.25 mL（108 cfu/mL），對(duì)照組腹腔注射方式等量的TSB液體養(yǎng)基，在試驗(yàn)期間觀察小鼠發(fā)病情況，對(duì)死亡的小鼠進(jìn)行細(xì)菌學(xué)鑒定，試驗(yàn)期為7 d。

1.6 藥敏試驗(yàn)

分離菌株的藥敏試驗(yàn)參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）2013年推薦的標(biāo)準(zhǔn)藥敏試驗(yàn)法進(jìn)行操作，按照CLSI的標(biāo)準(zhǔn)判斷耐藥（R）、敏感（S）或中介（I）進(jìn)行耐藥性結(jié)果判斷。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)

疑似多殺性巴氏桿菌的LYP-1株通過(guò)在10%兔血巧克力瓊脂培養(yǎng)基和10%綿羊血鮮血培養(yǎng)基上及革蘭氏染色鏡檢觀察其形態(tài)學(xué)（圖1），其LYP-1株培養(yǎng)特性和形態(tài)學(xué)與《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》中報(bào)道的多殺性巴氏桿菌的培養(yǎng)特性和形態(tài)學(xué)基本上一致。

2.2 細(xì)菌生化鑒定結(jié)果

生化特性結(jié)果顯示，LYP-1株硝酸鹽還原酶、接觸酶、β-半乳糖苷試驗(yàn)為陽(yáng)性，氧化酶試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、脲酶試驗(yàn)、MR試驗(yàn)及VP試驗(yàn)為陰性，分解葡萄糖、果糖;不分解甘露醇。與《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》中報(bào)道的多殺性巴氏桿菌的生化特性基本一致，LYP-1株生化特性鑒定結(jié)果為多殺性巴氏桿菌。

2.3 細(xì)菌PCR鑒定

疑似多殺性巴氏桿菌的LYP-1株用多殺性巴氏桿菌分離菌株的鑒定引物進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果顯示，LYP-1株擴(kuò)增出大約為1 044 bp的目條帶（圖2）從分子生物學(xué)水平LYP-1株被鑒定為多殺性巴氏桿菌。

2.4 致病性試驗(yàn)

在人工感染致病性試驗(yàn)期間，攻毒組的5只小鼠在攻毒后2～3 d出現(xiàn)不同的發(fā)病及死亡情況，直到6d攻毒組的小鼠全部死亡，死亡率為100%對(duì)照組小鼠健康存活。從剖檢的死亡小鼠體內(nèi)分離多殺性巴氏桿菌，LYP-1株為致病性多殺性巴氏桿菌。

2.5 耐藥性分析

結(jié)果由表1可知，分離的LYP-1株對(duì)頭孢噻呋、頭孢噻肟、頭孢曲松等6種藥物敏感，對(duì)阿莫西林、氨芐西林、磺胺間甲氧嘧啶等8種藥物耐藥。分離的LYP-1株對(duì)臨床中常用的藥物具有不同的耐藥性。

3 討論

近幾年，隨著我國(guó)養(yǎng)牛的發(fā)展，肉牛的養(yǎng)殖數(shù)量呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)，在肉牛的養(yǎng)殖過(guò)程中由于飼養(yǎng)管理不當(dāng)及相關(guān)的疾病的預(yù)防意識(shí)不強(qiáng)等因素，導(dǎo)致相關(guān)疾病（呼吸道、消化道等）流行與發(fā)生，其中由多殺性巴氏桿菌引起的呼吸道疾病，嚴(yán)重危害著我國(guó)養(yǎng)牛業(yè)發(fā)展[1-4]。多殺性巴氏桿菌廣泛存在于自然界及養(yǎng)殖環(huán)境中，可以通過(guò)多種途徑感染肉牛，尤其是免疫力下降時(shí)容易引發(fā)該病，成為養(yǎng)殖豬業(yè)中常見(jiàn)的細(xì)菌性疾病之一[5-7]。本試驗(yàn)從采集患呼吸道病死亡的肉牛的樣品中分離得到1株致病性多殺性巴氏桿菌（LYP-1株）， 通過(guò)藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離的LYP-1株對(duì)頭孢噻呋、頭孢噻肟、頭孢曲松等6種藥物敏感，對(duì)其他的藥物具有不同的耐藥性。因此，在臨床中防治肉牛多殺性巴氏桿菌時(shí)應(yīng)該進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，選擇敏感的藥敏進(jìn)行交替使用，應(yīng)該注意多殺性巴氏桿菌的疫苗免疫，同時(shí)應(yīng)該配合環(huán)境的消毒，提高其治療效果。

參考文獻(xiàn)：

[1] 胡人閣.牛莢膜A型多殺性巴氏桿菌recO基因缺失株的構(gòu)建與表型分析[D].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2021.

[2] 賈開(kāi)文，操義恒，王子杰，等.新疆牛源溶血性曼氏桿菌和多殺性巴氏桿菌的分離鑒定及耐藥性和毒力分析[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2023，45（2）：201-206.

[3] 李貴琴，尚遠(yuǎn)昊，程璐，等.3株牛源A型多殺性巴氏桿菌的分離鑒定及耐藥性分析[J].畜牧與獸醫(yī)， 2022，54（11）： 80-83.

[4] 高瑞，謝玉杰，繆西鵬，等.牛源多殺性巴氏桿菌和溶血性曼氏桿菌雙重PCR檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2022，42（10）：2009-2013+2030.

[5] 楊洋，謝黎卿，胡沛，等.牛源A型多殺性巴氏桿菌hyaD基因缺失株的構(gòu)建及其在小鼠上的交叉保護(hù)性分析[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2022，53（10）：3582-3597.

[6] 王羽. 抗牛源多殺性巴氏桿菌活性蛋白PA166的分離鑒定及其殺菌機(jī)制研究[D].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2022.

[7] 高尚，徐高原，周明光，等.2株牛源多殺性巴氏桿菌的分離鑒定及生物特性[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志， 2021，57（8）： 15-20+26.