液體活檢在結(jié)直腸癌診療中的研究進(jìn)展

李佳華 曹晨曦 陳振偉

結(jié)直腸癌（CRC）是導(dǎo)致全球癌癥患者死亡的第二大癌癥［1］。針對于結(jié)直腸癌患者的治療主要包括內(nèi)鏡和手術(shù)切除、化學(xué)治療、靶向治療、放療和免疫治療等。30%～50%的患者對結(jié)直腸癌進(jìn)行根治性治療后出現(xiàn)復(fù)發(fā)［2］。結(jié)直腸癌的診斷主要依靠影像學(xué)檢查、腫瘤標(biāo)志物和組織活檢。但影像學(xué)檢查昂貴費(fèi)時且發(fā)現(xiàn)時較晚，傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物則具有滯后性且靈敏度和特異度均較低。病理活檢是診斷結(jié)直腸癌的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但具有侵入性、組織取樣受病灶位置所限的特點(diǎn)，單次活檢通常不能反映結(jié)直腸癌的異質(zhì)性，尤其是對于伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者。近年來，液體活檢逐漸興起，與組織活檢相比，液體活檢技術(shù)能更好反映腫瘤異質(zhì)性，便于重復(fù)檢測，還可以在分子水平上進(jìn)行全面的實(shí)時監(jiān)測，了解患者在疾病全過程中的腫瘤負(fù)荷和基因變化，也有利于后續(xù)治療方案的選擇和調(diào)整，具有廣泛的臨床應(yīng)用價值及應(yīng)用前景。

1 液體活檢的概念

“液體活檢”一詞是由PANTEL和ALIX-PANABIERES最先提出的，用以定義血液中反映腫瘤特定信息的標(biāo)志物［3］。液體活檢主要通過無創(chuàng)或微創(chuàng)的方式對患者的血液、糞便、尿液和腦脊液等體液進(jìn)行取樣，其檢測對象主要是循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell，CTC）、循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）、外泌體等。液體活檢克服了腫瘤異質(zhì)性，可以實(shí)時監(jiān)測腫瘤進(jìn)展、復(fù)發(fā)或治療反應(yīng)［4］。隨著檢測技術(shù)的逐漸成熟，液體活檢有望進(jìn)入一個新時代。

2 檢測對象及技術(shù)

2.1 循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC） CTC是指在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，從腫瘤原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶脫落并進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)的腫瘤細(xì)胞，能在DNA、RNA和蛋白質(zhì)水平上提供腫瘤相關(guān)信息［5］。然而，當(dāng)CTC脫離病灶后易發(fā)生表型變化，易受到機(jī)械因素、藥物因素和免疫系統(tǒng)的影響而被損傷破壞，僅有少數(shù)細(xì)胞可以存活，且大小、形態(tài)不一，難以被檢測和計(jì)數(shù)［6］。

目前CellSearch儀器是當(dāng)今用于富集和分析CTC的主要方法，已獲得美國食品和藥物管理局（FDA）的授權(quán)，可用于結(jié)直腸癌中的CTC檢測［7］。隨著技術(shù)的進(jìn)步，納米技術(shù)提高了檢測CTC的靈敏度和特異性。在此基礎(chǔ)上，有研究者構(gòu)建了一種具有特異性捕獲和非破壞性釋放癌細(xì)胞雙重功能的生物芯片，該芯片可以高效捕獲的CTC，且對細(xì)胞活力損傷?。?］。此外，一種可以快速檢測CTC的微流控系統(tǒng)應(yīng)運(yùn)而生。與CellSearch系統(tǒng)相比，該系統(tǒng)具有血量、時間和成本的優(yōu)勢，且對細(xì)胞活性無影響［9］。LEE等［10］回顧了基于納米技術(shù)的液體活檢的應(yīng)用，進(jìn)一步證明在腫瘤監(jiān)測和治療的臨床實(shí)踐方面具有可行性。

2.2 循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA） 細(xì)胞游離DNA（cfDNA）是細(xì)胞壞死和凋亡釋放到外周血中并游離于細(xì)胞外的高度片段化的DNA片段，可存在于人體的各種體液中，如血液、糞便、尿液、腦脊液和胸腔積液［11］。ctDNA是主要來源于腫瘤細(xì)胞死亡過程中釋放到人體血液循環(huán)中，且具有腫瘤特異性的分子特征、編碼腫瘤細(xì)胞的DNA片段，屬于cfDNA的一種類型，約占0.01%～5.00%［12］。雖然ctDNA具有2 h的半衰期，但其在進(jìn)入血液循環(huán)后會迅速被清除。

目前檢測ctDNA的技術(shù)包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)和二代測序（NGS）技術(shù)。PCR技術(shù)包括等位基因特異性突變擴(kuò)增系統(tǒng)PCR（ARMS）、肽核酸鉗制PCR、數(shù)字PCR（dPCR）和微珠乳化擴(kuò)增技術(shù)等［13］。NGS與PCR技術(shù)不同，NGS可以檢測大量突變基因，其能同時對上百萬個DNA模板的序列進(jìn)行測序，并且能夠快速分析多個基因組靶點(diǎn)和突變［14］。在最近的一項(xiàng)薈萃分析中，比較dPCR、ARMS和NGS對結(jié)直腸癌患者cfDNA中KRAS突變的診斷準(zhǔn)確性，二代測序總體上有更高的準(zhǔn)確性［15］。

2.3 外泌體 外泌體是一種超微膜性囊泡，具有脂質(zhì)雙膜，可由淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞以及腫瘤細(xì)胞分泌，廣泛存在于各種體液中，如血液、尿液、唾液、腹腔積液等［16］。外泌體可攜帶多種生物活性物質(zhì)，包括蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)等物質(zhì)，這些物質(zhì)參與外泌體的抗原提呈、膜轉(zhuǎn)運(yùn)和融合，同時也參與較多生理、病理過程［17］。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中，腫瘤細(xì)胞來源的外泌體可促進(jìn)腫瘤微環(huán)境形成，同時增強(qiáng)腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移能力［18］。

目前外泌體的提取方法主要基于物理學(xué)（密度和大?。┖蜕飳W(xué)特性等，常用的有離心法（差速離心法、超速離心法、密度梯度離心法）、尺寸排阻色譜法、免疫親和捕獲法和沉淀法等［16］。除分離方法外，外泌體檢測方法還包括掃描電鏡（SEM）、透射電鏡（TEM）、原子力顯微鏡（AFM）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、蛋白質(zhì)印跡法（WB）、表面等離子體共振法（SPR）、動態(tài)光散射法（DLS）、納米顆粒跟蹤分析法（NTA）等［17-18］。

3 臨床應(yīng)用

3.1 早期診斷 早期診斷結(jié)直腸癌可指導(dǎo)臨床及時改變治療策略，延長生存周期。目前結(jié)直腸癌的診斷方法主要依靠影像學(xué)檢查、傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物和組織活檢，但上述方法具有各自的局限性，需要一種能夠早期診斷結(jié)直腸癌并實(shí)時監(jiān)測腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或治療效應(yīng)的方法。有研究者通過CellMax仿生平臺檢測循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）對結(jié)直腸癌進(jìn)行早期篩查，與結(jié)腸鏡檢查相比，在檢測結(jié)直腸癌方面表現(xiàn)出高靈敏度和特異性，進(jìn)一步表明CTC對結(jié)直腸癌早期診斷具有重要價值［19］。此外，特定基因的異常甲基化對結(jié)直腸癌的早期診斷有重大意義。cfDNA中的甲基化Septin9基因位于染色體17q25.3，廣泛存在于人體細(xì)胞中，與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。有研究者通過回顧性分析結(jié)腸癌、癌前病變患者及健康對照者Septin9基因甲基化、糞便隱血試驗(yàn)（fecal occult blood test，F(xiàn)OBT）及癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）的ROC曲線，發(fā)現(xiàn)Septin9甲基化、FOBT、CEA以及聯(lián)合三者檢測的AUC為 0.8129，0.7381，0.7744，0.9127，Septin9甲基化對于CRC患者的診斷效能相對于FOBT和CEA較高，且Septin9聯(lián)合FOBT、CEA的診斷效能最高［20］。在外泌體方面，ZHENG等［21］通過比較不同臨床分期的結(jié)直腸癌患者的miRNA水平發(fā)現(xiàn)miRNA－19a－3p可用于早期檢測結(jié)直腸癌。此外，結(jié)直腸癌患者血液循環(huán)中miR-27a，miR-130a，miR-23a和miR-301a的表達(dá)明顯增加，miR-23b，miR-99b-5p和miR-150-5p水平則顯著下調(diào)，可作為結(jié)直腸癌早期檢測和預(yù)后的無創(chuàng)指標(biāo)［22］。

3.2 指導(dǎo)治療 與組織活檢相比，液體活檢技術(shù)是一種非侵入性實(shí)時活檢方法，可在分子水平上進(jìn)行全面的實(shí)時監(jiān)測，了解患者在疾病全過程中的腫瘤負(fù)荷和基因變化，也有利于治療方案的及時調(diào)整，避免無效治療和過度治療。有研究共納入455例Ⅱ期結(jié)腸癌患者，隨機(jī)分組，302例為ctDNA指導(dǎo)的管理組，153例為標(biāo)準(zhǔn)管理組，中位隨訪時間為37個月。ctDNA指導(dǎo)組中接受輔助化療的患者百分比低于標(biāo)準(zhǔn)管理組（15%：28%；RR：1.82；95%CI：1.25～2.65）。ctDNA指導(dǎo)管理組的2年無復(fù)發(fā)生存率（recurrence-free survival，RFS）不低于標(biāo)準(zhǔn)管理組（93.5%VS.92.4%；絕對差異1.1%；95%CI：-4.1～-6.2）。接受輔助化療的ctDNA陽性患者的3年RFS為86.4%，而未接受輔助化療的ctDNA陰性患者為92.5%（HR：1.83；95%CI：0.79～4.27）。ctDNA對于Ⅱ期結(jié)腸癌的輔助化療有一定的指導(dǎo)作用，在不影響患者RFS的前提下，減少輔助化療的使用，使治療更精準(zhǔn)和個體化。此外，CTC的表型特征可用于評估腫瘤治療相關(guān)標(biāo)志物，如PD-L1。RAIMOND等［23］在治療前和治療開始后4周和8周對結(jié)直腸癌患者縱向采集血樣，應(yīng)用多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)測定CTC水平，結(jié)果顯示CTC的PD-L1的表達(dá)情況可作為一種非侵入性實(shí)時活檢方法用以預(yù)測瑞戈非尼對轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者的療效。

3.3 判斷預(yù)后 液體活檢可預(yù)測腫瘤患者的預(yù)后。一項(xiàng)薈萃分析納入3,129例結(jié)直腸癌患者，結(jié)果顯示CTC陽性預(yù)示疾病的快速進(jìn)展和較高的不良存活率。進(jìn)一步亞組分析表明，CTC陽性患者的無進(jìn)展生存期（progression-free survival，PFS）和總生存期（overall survival，OS）也較短［24］。國內(nèi)一項(xiàng)前瞻性隊(duì)列研究納入149例結(jié)直腸癌患者，通過比較患者的CTC計(jì)數(shù)和臨床病理特征后發(fā)現(xiàn)，隨著腫瘤分期的增加，CTC的數(shù)量也增加，CTC計(jì)數(shù)與T分期、N分期和M分期均具有顯著相關(guān)性。亞組分析的結(jié)果表明，CTC陽性組隨著T分期的遞增，生存曲線和風(fēng)險評估曲線的變化加快，進(jìn)一步表明CTC可能與腫瘤的組織胚胎學(xué)位置、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和浸潤深度有關(guān)。監(jiān)測CTC對評估臨床分期和預(yù)后具有重要價值。此外，ctDNA在結(jié)直腸癌預(yù)后方面也有一定的預(yù)測作用。KOBAYASH等對因孤立性可切除的結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者完成首次肝切除前，進(jìn)行ctDNA分析，其中80%患者體液中ctDNA陽性。ctDNA陰性患者中，在39.0個月的中位隨訪期內(nèi)，僅1例復(fù)發(fā)，無一例死亡。ctDNA陽性患者的RFS明顯短于ctDNA陰性患者（HR：7.6；P=0.02）。ctDNA陽性患者的OS也短于ctDNA陰性患者，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.14）［25］。除CTC、ctDNA外，外泌體也可以反映預(yù)后情況。外泌體CPNE3蛋白，是一種鈣依賴性的膜結(jié)合蛋白，參與細(xì)胞信號傳導(dǎo)及膜泡運(yùn)輸。通過研究發(fā)現(xiàn)CRC患者外泌體CPNE3水平高于健康對照組（P＜0.001），晚期CRC患者血漿外泌體CPNE3水平升高更為顯著（P＜0.001），有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的CRC患者血漿外泌體CPNE3水平明顯高于無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的CRC患者（P＜0.001），水平較低的結(jié)直腸癌患者無病生存期（DFS）和總生存期（OS）明顯優(yōu)于外泌體CPNE3水平較高的患者（P=0.033）。這些結(jié)果表明，CRC患者外泌體CPNE3水平升高，尤其在TNM分期較晚或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者中更加突出。除此之外，外泌體長非編碼RNA（LncRNA）在結(jié)直腸癌預(yù)后方面的研究也越來越多。LncRNA是長度＞200個核苷酸的不編碼蛋白質(zhì)的RNA，在多種癌癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，可以用作不同類型腫瘤中的潛在生物標(biāo)志物。國內(nèi)有研究者通過構(gòu)建基于鐵死亡相關(guān)lncRNA的結(jié)直腸癌預(yù)后風(fēng)險評分公式和綜合預(yù)后模型，結(jié)果顯示構(gòu)建的風(fēng)險評分公式優(yōu)于傳統(tǒng)腫瘤分期，風(fēng)險評分高的CRC患者預(yù)后更差，免疫細(xì)胞浸潤、基質(zhì)評分、PD-L2表達(dá)水平較高，對氟尿嘧啶的耐藥性較低［26］。因此，通過液體活檢有利于CRC患者的預(yù)后評估及治療決策。

3.4 復(fù)發(fā)監(jiān)測 對于術(shù)后或輔助治療后的結(jié)直腸癌患者，ctDNA能否取代傳統(tǒng)檢查方法（如結(jié)腸鏡檢查、CT檢查等）進(jìn)行復(fù)發(fā)監(jiān)測，已經(jīng)引起越來越多的注意。有研究者利用多標(biāo)記DNA甲基化液體活檢技術(shù)對結(jié)直腸癌患者進(jìn)行監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)70%的結(jié)直腸癌患者在復(fù)發(fā)前可檢測到ctDNA，且比CT檢查提前8個月［27］。HENRIKSEN等［28］對168例Ⅲ期結(jié)直腸癌患者進(jìn)行多中心隊(duì)列研究，結(jié)果表明結(jié)直腸癌治療后每3個月進(jìn)行一次ctDNA分析，與CT檢查相比，發(fā)現(xiàn)CRC復(fù)發(fā)的中位提前時間為9.8個月。此外，在一項(xiàng)前瞻性多中心隊(duì)列研究中，研究者對Ⅰ～Ⅲ期結(jié)直腸癌患者血漿ctDNA進(jìn)行分析，在術(shù)后30 d，ctDNA陽性患者復(fù)發(fā)的可能性是ctDNA陰性患者的7倍。同樣，ctDNA陽性患者在輔助化療（assessing adjuvant chemotherapy，ACT）后可能復(fù)發(fā)。常規(guī)治療后，ctDNA陽性患者在監(jiān)測期間復(fù)發(fā)的可能性是ctDNA陰性患者的＞40倍（HR：43.5；95%CI：9.8～193.5；P＜0.001）。因此，ctDNA可用于結(jié)直腸癌的危險度分級、指導(dǎo)輔助化療和早期復(fù)發(fā)的監(jiān)測。

4 小結(jié)與展望

目前結(jié)直腸癌診斷的金標(biāo)準(zhǔn)仍是組織活檢，但組織活檢具有侵入性，且有組織取樣受病灶部位限制、單次活檢不能反映出所有病灶的異質(zhì)性等不足之處。液體活檢為結(jié)直腸癌臨床診療開辟了一條新途徑。與傳統(tǒng)檢測方法相比，液體活檢從患者血液和其他體液提取生物標(biāo)志物，具有微創(chuàng)或無創(chuàng)、可重復(fù)、可動態(tài)監(jiān)測等優(yōu)勢。通過液體活檢，可以在分子水平上進(jìn)行全面的實(shí)時監(jiān)測，了解患者在疾病全過程中的腫瘤負(fù)荷和基因變化，也有利于后續(xù)治療方案的調(diào)整，具有廣闊的應(yīng)用前景。

雖然液體活檢對于結(jié)直腸癌診療方面表現(xiàn)一定的優(yōu)越性，但液體活檢的普及仍面臨不少挑戰(zhàn)：（1）液體活檢的檢測技術(shù)尚不成熟，從結(jié)直腸癌患者收集的CTC和ctDNA水平通常較低。同時存在信息不完整、基因錯配等現(xiàn)象以及檢測成本較高，因此需要對檢測技術(shù)進(jìn)一步優(yōu)化。（2）缺乏臨床驗(yàn)證和統(tǒng)一標(biāo)志，需要大量多中心、更具前瞻性的長期臨床研究進(jìn)一步明確。（3）腫瘤誘導(dǎo)血小板（TEP）和細(xì)胞微粒等其他腫瘤標(biāo)志物尚待進(jìn)一步研究。相信隨著技術(shù)的進(jìn)步，液體活檢將在臨床診療中廣泛應(yīng)用。