ST11肺炎克雷伯菌QL5株攜帶的質粒pQL5-NDM-KPC的研究

馬超越,王 笑,劉真真,賈 楠,朱元祺*

(1.青島大學附屬醫院,山東 青島266003;2.棗莊市山亭區人民醫院,山東 棗莊277200)

在我國,腸桿菌目細菌對碳青霉烯類耐藥主要是產KPC(肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶)或NDM(新德里金屬β-內酰胺酶)酶[1-2]。前者由blaKPC基因編碼,而后者為blaNDM基因[2]。目前,在同一株菌中同時檢測到多個不同的碳青霉烯酶耐藥基因的報道逐漸增多,且不同的碳青霉烯酶基因往往位于不同的質粒上[2-3],但對這些不同的碳青霉烯酶耐藥基因位于同一個質粒上的報道較少。本文主要是對一株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌QL5臨床株攜帶的blaNDM-1和blaKPC-2基因位于同一個質粒上(命名為pQL5-NDM-KPC)進行研究,現報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗菌株耐碳青霉烯類的肺炎克雷伯菌QL5株分離自住院患兒。沙門菌H9812為分子量標記;疊氮鈉耐藥的大腸埃希菌J53AziR為質粒液相接合受體菌(E.coliJ53AziR)。以上菌株為本實驗室保存。

1.3 質粒的S1核酸酶切脈沖場凝膠電泳(S1-PFGE)實驗步驟參照相關文獻報道方法[4]。

1.4 質粒的液相接合試驗接合受體菌為大腸埃希菌J53AziR,供體菌為肺炎克雷伯菌QL5株,試驗步驟參照文獻進行[4]。

1.6 菌株的測序基于二代Illumina和三代Nanopore技術平臺測序,獲得菌株的染色體和質粒序列。然后,利用一系列軟件分析菌株的基因組和質粒的生物學信息,如MLST分型依據在線網站https://cge.cbs.dtu.dk/services/MLST/進行;注釋用Rast (2.0);耐藥基因用ResFinder(4.1);質粒分型用PlasmidFinder(2.1)。

2 結果

2.1 菌株的碳青霉烯酶檢測結果

圖1 肺炎克雷伯菌QL5株和丟失子(QL5ds株)的碳青霉烯酶檢測圖

2.2 質粒的液相接合試驗、穩定性試驗和S1核酸酶切脈沖場凝膠電泳結果

大腸埃希菌J53AziR與肺炎克雷伯菌QL5株進行液相接合,未獲得接合子。質粒的穩定性試驗顯示QL5株在傳代第五天丟失了blaNDM基因,只攜帶blaKPC基因,命名這個丟失子為肺炎克雷伯菌QL5ds株(該菌株的碳青霉烯酶檢測見圖1)。繼續傳代至第30天,仍然僅僅攜帶blaKPC基因。隨后,對肺炎克雷伯菌QL5株和丟失子(肺炎克雷伯菌QL5ds株)進行S1-PFGE,結果顯示兩個菌株攜帶的質粒數目不變,但QL5ds株攜帶最大的質粒略小于QL5株攜帶的那個質粒,S1-PFGE結果詳見圖2。

圖2 S1核酸酶切脈沖場凝膠電泳圖

2.3 肺炎克雷伯菌QL5株與丟失子(肺炎克雷伯菌QL5ds株)的測序和生信分析結果

基于Illumina和Nanopore測序平臺,獲得了肺炎克雷伯菌QL5株和QL5ds株(傳代第5天丟失了blaNDM基因)的基因組和質粒序列。生信分析顯示:①菌株的多位點序列分型(MLST)是ST11。②肺炎克雷伯菌QL5株和QL5ds株都攜帶了兩個質粒,其大小與S1核酸酶切脈沖場凝膠電泳圖相一致。③肺炎克雷伯菌QL5株攜帶了blaNDM-1和blaKPC-2基因,且這兩個碳青霉烯酶基因位于同一個IncC/IncFII(PHN7A8)/IncR雜合質粒上(該質粒被命名為pQL5-NDM-KPC,獲得的GenBank 序列號為OR253888)。④QL5ds株攜帶的大質粒(丟失了blaNDM-1基因,但blaKPC-2存在)被命名為pQL5ds-KPC;與pQL5-NDM-KPC相比較,pQL5ds-KPC是缺少了blaNDM-1基因所在的區域,即肺炎克雷伯菌QL5株經傳到第五代發生了片段丟失事件,而不是整個質粒的丟失;這個丟失片段長度為10 494 bp,其結構為dsbD-trpF-bleMBL-blaNDM-1-ΔISAba125-IS26-In27-ISCR1。⑤肺炎克雷伯菌QL5株除了攜帶blaNDM-1和blaKPC-2基因外,還攜帶多個不同種類的耐藥基因,如喹諾酮類和氨基糖苷類等耐藥基因,并與呈現的多重耐藥表型相符合。

肺炎克雷伯菌QL5株和QL5ds株基因組和質粒序列的長度、G+C含量、復制子類型和攜帶的耐藥基因詳見表1。

表1 肺炎克雷伯菌QL5株和QL5ds株的生信分析結果

3 討論

多β-內酰胺酶的產生可發生在所有產生β-內酰胺酶的革蘭氏陰性菌中,但在產生碳青霉烯酶的多重耐藥菌中尤其明顯[5]。本研究的肺炎克雷伯菌QL5株除了攜帶的blaNDM-1和blaKPC-2碳青霉烯酶基因位于同一個IncC/IncFII(PHN7A8)/IncR雜合質粒上外,還攜帶多個其他β-內酰胺類抗性基因,如blaCTX-M-65、blaTEM-1B、blaSHV-12、blaSHV-182和blaOXA-1基因。此外,QL5株還攜帶其他抗性耐藥基因,包括氨基糖苷類抗性基因[aac(6′)-Ib-cr、aadA2、aac(3)-IId]、磺胺抗性基因(sul1)、甲氧芐啶抗性基因(dfrA12)和大環內酯抗性基因[mph(A)]等,與呈現的多重耐藥表型相符合。

目前,更令人關注的是在同一細菌中多種碳青霉烯酶的共同產生,而且這些多種碳青霉烯酶的聯合出現會有地域上的差別。國外的研究表明[1,6-7],自2008年以來,KPC酶與另一種碳青霉烯酶在至少110株分離株中聯合出現,而OXA-48相關的碳青霉烯酶在130多株分離株的碳青霉烯酶組合中被發現。與其他碳青霉烯酶相比,KPC β-內酰胺酶更有可能與VIM 型金屬酶聯合產生(占比75%的分離株),且這些分離株主要來自美洲和希臘。僅有較少的分離株與NDM-1(7%)、IMP(6%)或OXA-48(6%)碳青霉烯酶共同產生KPC酶。這與國內的報道不同[2]。另外,與OXA-48型酶共產生最多的碳青霉烯酶是金屬酶。在這些分離株中,產生NDM型碳青霉烯酶占81%。同樣,當NDM型酶與其他碳青霉烯酶共產生時,90%的分離株中存在OXA-48型酶,其次是IMP(5%)和KPC(4%)[1,6-7]。

雖然許多共同產生碳青霉烯酶的細菌是肺炎克雷伯菌分離株(60%),但在其他腸道細菌中也有雙碳青霉烯酶產生的報道,包括弗氏檸檬酸桿菌(4.1%)、腸桿菌(3.7%)、產酸克雷伯菌(0.9%)和黏質沙雷菌(11.1%)[1,7-8]。另外,最近從在印度醫院就診的一位美國患者中還分離出同時攜帶NDM、VIM和OXA-48三個編碼基因的肺炎克雷伯菌[9]。目前,產碳青霉烯酶的細菌可同時攜帶多黏菌素耐藥基因,這使臨床對抗感染的治療面臨更多的困難[10]。

在抗生素選擇壓力下,細菌除了同時產生多種不同的碳青霉烯酶外,也可呈現同一基因的多個拷貝。在對肺炎克雷伯菌QL5株的序列分析中發現,blaNDM-1基因區域(10kb)存在大片段重復和重復片段數目的異質性,即在單個質粒(pQL5-KPC-NDM)中呈現了blaNDM-1基因的1～5個拷貝(單片段長度為10 494 bp),而blaNDM-1多拷貝與單個拷貝的質粒相比,就是10 494 bp片段(dsbD-trpF-blaMBL-blaNDM-1-ΔISAba125-IS26-In27-ISCR1)的重復復制。另外,質粒的穩定性試驗和生信分析顯示,肺炎克雷伯菌QL5株經傳代發生了片段丟失,不是整個質粒的丟失,而且這個丟失片段長度也為10 494 bp,其結構與前述的重復片段完全相同(也為dsbD-trpF-blaMBL-blaNDM-1-ΔISAba125-IS26-In27-ISCR1),即雜合質粒pQL5-KPC-NDM的形成和多樣性與移動元件ISCR1有關。

以上結果提示,通過片段序列的同源重組可實現質粒的異質性,這可能是質粒進化方式,也對產多碳青霉烯酶腸桿菌目細菌的耐藥機制研究有一定的意義。另外,經檢索,肺炎克雷伯菌QL5株攜帶的質粒pQL5-NDM-KPC屬于一個新型的IncC/IncFⅡpHN7A8/IncR雜合質粒(GenBank 序列號:OR253888),目前尚未見報道。