谷胱甘肽還原酶影響結腸癌代謝及預后:一項基于蛋白組學與微陣列芯片分析的研究

吳 懼,常耀元,李子群,尹家俊,王禹堯

(大連大學附屬中山醫院 肝膽外科·大連市腫瘤生物醫療和基因檢測重點實驗室,遼寧 大連116001)

結直腸癌(CRC)是世界上最常見的三大癌癥之一,在死亡率方面排名前兩位,據統計2020年全球有1 931 590例新發病例和935 173例死亡病例[1-2]。近幾年,隨著醫學診療技術的發展,腫瘤分子靶點和生物治療逐漸成為臨床治療的有力手段[3]。在過去的幾十年里,靶向癌癥代謝受到了廣泛關注,因為腫瘤代謝在腫瘤的發生發展中起著關鍵作用,包括葡萄糖代謝、核酸代謝、酶代謝、蛋白質代謝等[4]。GSR基因編碼谷胱甘肽(GSH)還原酶,位于8p12,在氧化還原穩態和細胞抵抗氧化應激中起關鍵作用[5]。谷胱甘肽是一種主要的細胞內抗氧化劑,在維持細胞內氧化還原穩態、信號轉導、異生物代謝和硫醇平衡方面起著至關重要的作用[6-7]。本研究旨在探討GSR對結腸惡性腫瘤代謝、臨床特征以及預后的影響,報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

收集5例結腸癌患者病理標本(每例患者分別取結腸癌組織和對應的正常結腸上皮組織),對樣本采用DIA(Data independent acquisition)質譜技術進行差異蛋白分析。收集120例結腸癌患者(60例結腸癌+60例結腸癌合并肝轉移癌)原發灶病理標本用以制作組織微陣列芯片。所有患者術前未行新輔助化療。本研究已獲得大連大學附屬中山醫院倫理委員會批準,并獲得所有患者或家屬的知情同意。

1.2 生物信息分析

1.2.1蛋白組學分析 根據可信蛋白選擇兩個標準計算樣本間差異。Foldchange(FC)用于評估樣本間蛋白表達水平的倍數變化。采用t檢驗計算樣本間差異的P值。差值過濾條件為|log2(FC)|=1且P<0.05。基于R語言對數據和樣本進行無監督層次聚類。

1.2.2KEGG富集分析 獲取DAVID數據庫中的差異表達蛋白,對差異蛋白進行KEGG富集分析,描述其功能。

1.2.3蛋白-蛋白相互作用網絡(PPI)分析和相關性分析 使用String分析工具進行PPI分析,并使用CytoHubba插件篩選出連接節點數最多的前10個蛋白。使用Timer網絡分析工具進行相關性分析。

1.2.4生存分析 使用網絡分析工具GEPIA2進行生存分析。

1.2.5臨床特征相關性分析 臨床特征相關性分析采用UALCAN網絡分析工具。

1.3 免疫組織化學染色

免疫組織化學染色采用DAB免疫組織化學染色試劑盒(zgb-bio,#ZLI-9018)。用GSR抗體(SAB,#31078,稀釋度:1∶100)孵育過夜,用蘇木精復染。所有染色結果由本中心的專業病理醫師觀察和分析。

1.4 統計分析

數據采用GraphPad Prism 8軟件進行統計學分析。組間差異蛋白的比較采用Student’sT檢驗。相關性分析采用Spearman相關分析方法。Kaplan-Meier生存分析采用logrank檢驗。免疫組織化學染色結果采用ImageJ軟件進行分析,P<0.05被認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 差異蛋白的篩選與KEGG通路分析

蛋白組學差異分析結果共獲得1 536個差異蛋白,其中977個顯著上調,559個顯著下調(圖1)。排除結腸癌組織和正常結腸上皮組織中未檢測到的蛋白,共鑒定出1 209個差異表達蛋白(P<0.05)。

圖1 差異蛋白篩選

對差異表達蛋白進行KEGG富集分析(圖2),1 209個差異蛋白中有144個蛋白顯著富集于代謝通路,結果具有統計學意義(P<0.05)。

圖2 KEGG功能富集分析

2.2 PPI網絡構建及關鍵蛋白的獲取

通過Cytoscape軟件進行蛋白-蛋白相互作用網絡分析,CytoHubba插件統計節點之間的連接數,篩選出代謝通路富集的144個蛋白中連接節點數最多的前10個蛋白:ADH1A、ADH1B、ADH1C、ADH5、ALDH18A1、ALDH3A1、GSTA1、GSTA2、HPGDS、GSR(圖3)。通過Timer數據庫進行相關性分析,發現部分蛋白之間相關性有統計學意義,見圖4。

圖3 PPI網絡分析

2.3 關鍵蛋白的生存分析

使用GEPIA2數據庫進行生存分析顯示,GSR低表達降低了結腸癌患者總生存期(P=0.0 017,HR=0.45),而ADH1A、ADH1B、ADH1C、ADH5、ALDH18A1、ALDH3A1、GSTA1、GSTA2、HPGDS不影響結腸癌患者總生存期(圖5)。

圖5 Kaplan-Meier生存分析

2.4 GSR與臨床信息相關性分析

利用UALCAN數據庫,分析GSR表達與結腸癌患者臨床信息的相關性(圖6)。與正常結腸上皮組織相比,GSR在結腸癌組織中的表達降低,其中GSR在Ⅰ期結腸癌中表達最高、在Ⅳ期結腸癌中表達最低,GSR在N1期和N2期的表達較N0期降低,發生TP53突變的結腸癌中GSR的表達下調,差異均具有統計學意義(P<0.05)。

圖6 GSR對臨床特征的影響

2.5 GSR免疫組織化學分析

使用組織微陣列芯片進行免疫組織化學染色(圖7)。微陣列染色結果顯示,正常結腸上皮組織(N)中GSR染色強度最高;合并肝轉移的結腸癌組織(CRLM)中GSR染色強度最低;未合并肝轉移的結腸癌組織(CRC)中GSR染色強度介于N和CRLM之間,3組間差異均具有統計學意義(P<0.05)。

圖7 微陣列芯片染色結果

3 討論

結腸癌仍然是醫學界的難題,也是癌癥相關死亡的主要原因。隨著腫瘤分子靶點和生物治療的不斷發展,特別是對腫瘤代謝認識的不斷加深,為結腸癌的治療提供了新的信心和方向[8-9]。2017年的一項研究發現,二氯乙酸通過減少糖酵解抑制結腸癌細胞的增殖,這項發現進一步凸顯了代謝因素在結腸癌發展中的重要性[10]。本研究蛋白組學結果發現,在結腸癌的1 209個差異表達蛋白中,有144個顯著富集于KEGG代謝通路,蛋白相互作用網絡及相關性分析發現,ADH家族、ALDH家族、GSTA家族、GSR和HPGDS蛋白在代謝通路中發揮關鍵作用。這些結果支持了代謝因素在結腸癌中的重要作用。通過生存分析發現,GSR高表達的結腸癌患者較低表達的結腸癌患者預后更好。2019年的一項研究中,GSR缺陷型肺癌被確定為硫氧還蛋白/硫氧還蛋白還原酶(TXNRD)抑制劑的可能靶點[11]。因此,GSR可能參與了結腸癌細胞代謝的重要步驟。

近年來,研究發現腫瘤細胞可以通過代謝影響免疫細胞的浸潤,進而影響免疫治療的療效和耐藥性。通過調控腫瘤的代謝,進而改變腫瘤的免疫微環境,為臨床腫瘤患者的免疫治療提供了新的思路與方向[12-19]。2020年MONSERRAT-MESQUIDA M 等[20]的一項關于代謝綜合征(MetS)的研究發現,MetS以氧化應激為特征,會導致炎癥、血管功能受損以及動脈粥樣硬化,并觀察到MetS人群中GSR的活性和蛋白水平較高,而體內的循環白細胞、中性粒細胞、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞和單核細胞較低。這可能是因為高抗氧化應激的防御能力使免疫細胞處于一種預激活狀態,進而形成促炎狀態,而腫瘤微環境中浸潤炎癥細胞的豐度與免疫檢查點抑制劑(ICIs)的療效密切相關,考慮GSR可以作為一種免疫刺激劑,促進結腸癌細胞的免疫浸潤,進而提高臨床免疫治療的療效。有研究證明,趨化因子參與了結腸癌發生發展的過程,從而導致癌細胞的遷移、黏附和趨化[21]。2019年的一項研究發現[22],長期接受阿霉素化療的患者,體內GSR以及其他抗氧化應激因子水平升高,同時IL-6、IL-8以及CXCL-1水平下降。在結腸癌中,GSR水平的升高,可能會導致某些趨化因子的活性或水平降低,當GSR表達降低,對趨化因子的抑制作用被解除,進而導致結腸癌細胞的轉移。本研究組織微陣列芯片免疫組化結果顯示,GSR在合并肝轉移的結腸癌組織中的表達顯著低于未合并肝轉移的結腸癌組織,這可能是因為GSR的下調導致趨化因子的活性與水平增加,進而促進了結腸癌肝轉移的發生。生存分析顯示,GSR在結腸癌中作為腫瘤抑制因子顯著改善患者預后,同時發現,GSR與結腸癌患者的N分期、總分期和TP53突變相關,因此考慮GSR可能在結腸癌中作為一種抑癌因子發揮保護作用,當GSR表達下調,這種保護作用被破壞,進而促進惡性腫瘤的發生發展。其具體機制將在未來進一步設計實驗來探索。

綜上,GSR在結腸癌代謝通路中發揮關鍵作用,并且其表達可能影響結腸惡性腫瘤的代謝、腫瘤分期、TP53突變以及結腸癌患者預后。