菜心VIGS沉默植株構建的教學實驗

鐘珉 覃鴻毅 柴喜榮 楊暹 康云艷

摘要 普通分子生物學實驗具有實踐性和操作性強等特點，病毒誘導基因沉默技術（VIGS）是操作簡單、實踐性和操作性強的前沿生物學技術。本研究在菜心VIGS沉默植株構建的教學實驗中，以種子真空侵染方法為基礎，通過優化侵染濃度、侵染時間和共培養時間，得到了操作簡單，侵染效率和植株成活率高，白化表型明顯的侵染體系。通過實驗教學可知，菌液OD600為0.80，侵染時間5 min，培養15 h的侵染效率最高，BcPDS基因的表達受到抑制，侵染優化后的菜心VIGS體系穩定且高效。該教學實驗的構建使學生的學習興趣得到了明顯提高，培養了學生創新思維能力和獨立工作能力，鍛煉了學生的動手能力，并具備一定的創新和科研能力。

關鍵詞 菜心；病毒誘導的基因沉默；技術改良；實驗教學；創新能力

中圖分類號 S63；G642.0? ?文獻標識碼 A

文章編號 1007-7731（2024）10-0102-05

病毒誘導基因沉默技術（VIGS）使病毒攜帶目的互補脫氧核糖核酸（cDNA），然后用其侵染植物，與植物自身RNA配對成為雜合雙鏈RNA（Double strand RNA，dsRNA），錯誤的dsRNA被切割形成小干擾RNA，再經過一系列過程形成RNA誘導的沉默復合體，最終降解靶基因RNA序列，沉默目的基因[1]。早期研究多圍繞本氏煙草、番茄等作物的RNA病毒進行研究，以煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）作為侵染載體，使其攜帶目標基因八氫番茄紅素脫氫酶（Phytoene desaturase，PDS）cDNA反義鏈，煙草葉片被侵染后出現光漂白現象。此后，科研人員根據植物病毒特性開發出越來越多的新病毒，誘導得到基因沉默載體，在諸多植物基因功能研究中發揮著重要作用[2-3]。此外，植物類胡蘿卜素合成中的關鍵酶PDS表達受到抑制易導致植物光保護作用缺失，出現光漂白現象，葉片白化，表型與對照有明顯差異。基于此，常選擇PDS沉默作為參照，研究侵染效率。因此，VIGS是基于植物對RNA病毒的防御機制，可抑制目標基因表達，用以表征植物基因功能的轉錄技術[4-6]。由于VIGS技術具有容易操作、周期短、低成本、不需要遺傳轉化和耗材成本低等優點，被廣泛用于植物基因功能研究中[7-9]。與小白菜、擬南芥等其他十字花科作物相比，菜心的基因鑒定、功能分析等研究進展速度較慢。因此，快速構建菜心基因功能高效鑒定體系十分重要。對常規遺傳轉化進行基因功能驗證須至F2或者F3代后才能開展，VIGS研究基因功能周期較短，侵染番茄或煙草后約20 d可觀察到明顯的白化表型。在菜心種子侵染VIGS體系中，14 d可觀察到白化表型并進行功能驗證。同時，由于菜心遺傳轉化體系不成熟，轉化效率低，轉化存在一定困難。

隨著分子生物學技術的發展和研究生培養方案的調整，研究生選修課程高級蔬菜栽培學開設了相關實驗課程，菜心VIGS沉默植株的構建是實驗內容之一。菜心屬于華南地區特色蔬菜，種子發芽后，采取傳統的子葉注射法創制沉默植株，易出現注射手法不熟練或注射時間難以控制等問題，可能使子葉脫落，幼苗死亡，無法獲得沉默植株[7-11]。

本研究在實驗課程中引入農桿菌真空滲透法，優化侵染濃度、侵染時間和共培養時間等實驗參數，形成規范的操作流程，整理成操作手冊，改善實驗操作結果，提高教學成果。目的在于調動學生參與具體實驗的積極性，促使學生理解并掌握VIGS技術原理和方法，加深學生對理論知識的理解，提高其實驗操作技能，為其利用VIGS技術開展基因功能驗證奠定基礎，培養和提升其科研能力和實踐能力。通過完整的實驗教學，讓學生充分參與實驗過程，提高操作技能，充分培養學生獨立工作和創新思維能力。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為“油青四九”菜心植株發芽的種子。試劑配方主要包括大腸桿菌DH5α、農桿菌GV3101、質粒提取試劑盒、DNA提取試劑盒、pTRV1質粒、pTRV2-BcPDS質粒、瓊脂糖、卡那霉素、氨芐青霉素、利福平、農桿菌侵染緩沖液和LB培養基等。農桿菌侵染緩沖液成分為10 mmol/L 2-嗎啉乙磺酸（MES）、10 mmol/L氯化鎂（MgCl2）和200 μmol/L乙酰丁香酮（AS）。實驗儀器有電子天平、搖床、移液槍、離心機、PCR儀器、培養箱和超凈工作臺等。

1.2 VIGS沉默植株教學方案構建

1.2.1 實驗原理? VIGS利用攜帶目的基因片段的病毒侵染植物后，隨著病毒的復制和轉錄而特異性的誘導序列同源基因mRNA降解，從而引起植物內源基因沉默、表型或生理指標變化。

1.2.2 實驗方法? （1）菜心植株總RNA和cDNA的提取。按照RNA提取試劑盒操作步驟提取總RNA。依據HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit（Vazyme）試劑盒操作步驟進行反轉錄操作獲得cDNA。提取菜心總RNA時，要嚴格按照操作手冊進行，應注意于低溫環境下迅速研磨，防止樣品中RNA降解；選擇種子活力較好的菜心種子；農桿菌OD600值為0.80左右；現配現用侵染緩沖液；及時更換注射器和手套，防止交叉污染。

（2）pTRV2-BcPDS載體構建及農桿菌轉化。根據菜心BcPDS的全長cDNA序列，用引物設計軟件設計特異性引物（F：GCAAAATACAGGTCATGTAT；R：CTATCTCCAGACAATGAAGAGA）。PCR擴增得到249 bp大小的PDS基因片段，將上述基因片段重組連接到pTRV2載體上，轉入感受態細胞DH5α中，提取質粒。然后將測序正確的重組質粒（pTRV2-BcPDS）通過電擊法轉入農桿菌感受態GV3101細胞中。

（3）農桿菌侵染。取菜心種子50粒，用有效氯1%的次氯酸鈉消毒液對種子消毒后，置于帶有干凈濾紙的培養皿中發芽；將得到的pTRV1和pTRV2單克隆培養液以1∶1比例混合，pTRV1與pTRV2-BcPDS單克隆培養液以1∶1比例混合，分別按照1∶100比例轉接到相同的LB培養基上，在三角瓶中繼續培養農桿菌菌液，至OD600值在0.04～1.20范圍內，并調整至兩個三角瓶菌液OD600值相同。將等量的發芽菜心分別放入藍口瓶中，在對照組中加入5 mL含pTRV1和pTRV2的轉化菌液，處理組中加入5 mL含pTRV1和pTRV2-BcPDS的轉化菌液，使種子完全浸泡在轉化菌液中；用真空泵對藍口瓶抽真空，每次抽60 s，每次間隔2 min，操作3次；最后在28 ℃下暗培養24 h。觀察侵染濃度對白化表型率和成活率的影響，確定最佳侵染濃度，觀察侵染時間對白化表型率的影響，確定最佳侵染時間。培養結束后，移栽至土壤中繼續生長14 d后觀察表型，提取RNA，使用熒光定量方法檢測沉默菜心中BcPDS基因的表達情況。具體技術路線如圖1所示。

1.3 實驗教學效果評價

從菜心育苗、PCR擴增、載體構建、酶切、質粒提取和轉化、農桿菌制備和侵染等整個實驗流程來評價實驗教學效果，綜合評價學生學習效果。

2 結果與分析

VIGS技術常被用于煙草、番茄、辣椒、玉米、矮牽牛和草莓等作物的基因功能驗證。實踐中，在菜心中采用常規方法進行基因功能驗證易導致幼苗死亡、不穩定以及難以獲得沉默植株等。本研究根據多年實驗教學經驗，采用真空滲透法進行VIGS沉默基因，對主要實驗步驟進行優化。OD600指溶液在600 nm波長處的吸光值，吸光值正比于溶液中吸光物質的濃度，因此，本研究以OD600具體值表征菌液侵染濃度。

2.1 侵染濃度對白化表型率和成活率的影響

合適的農桿菌侵染濃度是獲得沉默植株的基礎，農桿菌侵染濃度會影響侵染后菜心的白化表型率和存活率，濃度過高或過低都會直接影響侵染效果。因此，本實驗選取OD600值0.05～1.60作為侵染濃度變化范圍進行篩選。結果表明，OD600為0.40或0.80時，菜心植株存活率差異無統計學意義（P>0.05）；OD600為0.80時，侵染后菜心植株的白化表型率高于OD600濃度為0.40時的侵染結果；OD600為0.80或1.20時，植株白化表型率在0.60%左右，OD600達到1.60時，侵染后的植株存活率明顯降低（圖2）。因此，菌液OD600 為0.80時為最佳的侵染濃度。

2.2 侵染時間對白化表型率的影響

為確定侵染時間對轉化效率的影響，分析OD600為0.80條件下，不同侵染時間對白化表型率的影響。由實驗可知，當侵染5 min時白化表型率最高，為0.57%（圖3）。因此，最佳侵染時間為5 min。

2.3 共培養時間對白化表型率和存活率的影響

在OD600為0.80，侵染5 min時，將共培養時間分別設置為0、5、10、15、20和25 h。分析發現，白化表型率隨著共培養時間增加呈降低的整體趨勢，共培養15 h時存活率最高，達到0.32%（圖4）。

2.4 侵染對BcPDS基因表達量的影響分析

在染菌種為GV3101，侵染菌液OD600為0.80，侵染5 min，共培養15 h的條件下，提取樣品RNA進行實時定量PCR檢測。檢測發現，與侵染后培養0 d相比，培養7 d后葉和根中的BcPDS基因表達量大幅下降（圖5）。

2.5 表型觀察

侵染后培養約8 d，侵染pTRV2-BcPDS的菜心植株上位葉片出現光漂白現象。白化首先出現在新葉處，呈現白色斑點狀，然后從新葉向老葉擴散，部分葉片和植株14 d后幾乎完全白化。侵染pTRV2-BcPDS的菜心植株15 d后葉片大面積白化，但侵染TRV：00的菜心植株沒有出現明顯變化（圖6），表明BcPDS基因的表達受到抑制，被成功沉默，實驗體系成熟高效。

2.6 實驗教學效果分析

相較于其他實驗，VIGS實驗全流程具有明顯的探究性、設計性和綜合性的特征，具有連續性和系統性，是一個完整的實驗和科研過程。在教學過程中，學生能夠積極主動地參與到實驗的各個步驟中，從菜心育苗直至侵染等環節，學生成為實驗的主導者，能夠認真主動地完成各個實驗。此外，VIGS實驗各個步驟之間緊密相扣，相輔相成，前面的實驗成功與否直接影響后續實驗的成敗，能夠幫助學生構建完整的實驗體系。另外，當發現沉默植株出現白化現象，學生會感到非常自豪、激動和興奮，更加覺得實驗有趣、科學和神奇，這種完成實驗的成就感較強，充分調動了學生的學習積極性和興趣。總的來說，學生可從該實驗中得到了多方面的鍛煉，視野和思路得到了擴展，理論知識也得到了進一步豐富。

2.7 實驗注意事項

提取菜心RNA時要低溫快速操作，防止RNA降解；挑選菜心幼苗要注意在合適的苗齡（10～15 d的幼苗）注射農桿菌懸浮液；調節農桿菌懸浮液到合適的濃度，不易過高或過低；侵染緩沖液要現配現用，4 ℃保存，增加農桿菌的滲透性；要避免交叉污染，及時更換注射器和一次性手套等實驗耗材。

3 結論與討論

VIGS技術具有簡單高效等優點，十分適用于基因功能研究。近年來，研究人員利用BSMV載體進行小白菜基因沉默，建立了高效沉默玉米基因的VIGS體系等，為單子葉、雙子葉等植物基因功能研究提供了高效且多樣化的途徑。TRV病毒株系具有感染癥狀輕且沉默效率高等優點，是目前應用較為廣泛的VIGS載體。部分生物學課程在實驗教學中開展了少量的VIGS實驗[11]，而VIGS實驗在園藝方向上的研究生培養及實驗教學中有待進一步增加。因此，本研究利用菜心種子，以TRV為載體，從VIGS侵染因素入手，構建易操作的菜心種子VIGS體系，對遺傳轉化難、轉化時間久的菜心進行基因功能研究，對菜心種子VIGS體系的相關參數進行優化。實驗表明，菌液OD600為0.80，侵染5 min，共培養15 h時侵染效率最高，BcPDS基因的表達受到抑制，侵染優化后的菜心VIGS體系穩定且高效。利用該體系能夠對菜心候選基因功能進行快速初步驗證，為基因功能分析和菜心育種奠定基礎，也能讓學生進一步掌握基礎分子生物學實驗操作，加深其對利用分子生物學實驗技術解決生物學問題的理解。

將該實驗引入實驗教學中，能幫助剛進入研究生階段深造的學生理解和掌握分子生物學的一些基本原理、分子實驗操作流程和操作注意事項。新方法可以幫助學生更好地理解PCR擴增、載體構建、酶切、質粒提取和轉化、農桿菌制備和侵染等一系列基礎分子實驗。此外，VIGS實驗與其他傳統小實驗相比，具有較高的探究性、設計性和綜合性，是一個連續、系統的操作過程，能夠鍛煉學生綜合素質，拓寬其學習思路。

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（責編：張 蓓）