淫羊藿中山柰酚防治骨質疏松癥的機制的研究進展

郝慶飛 袁普衛 孟慶豪 趙怡凡 劉德玉 王占魁 余紅超

1.陜西中醫藥大學研究生院，陜西咸陽 712000；2.陜西中醫藥大學附屬醫院骨病科，陜西咸陽 712000

骨質疏松癥（osteoporosis，OP）是一種以骨量減少、隨著年齡增長而骨折風險增加的骨骼系統疾病。隨著人口老齡化發展，2018 年國家衛生健康委員會調查顯示，我國＞65 歲的患者OP 患病率高達32.0%，且每年穩定逐步上升[1]。嚴重影響患者生活水平，已成為世界首要的公共衛生問題之一。目前臨床上治療OP 采用雙膦酸鹽、激素代替療法和降鈣素等藥物治療。雖然療效顯著，但副作用大，嚴重降低患者生活質量[2]。祖國醫學中將OP 歸為“骨痿”，又名“腎痿”“骨痹”等。中醫認為OP 的病因病機大多因腎精虧虛所致。淫羊藿具有補腎壯陽、祛風除濕、強筋健骨等功效，可有效治療OP，且副作用小[3]。

山柰酚（kaempferol，KAE）是生物類黃酮，廣泛存在于水果、蔬菜和中草藥中。有研究發現，淫羊藿中活性成分KAE 能有效地促進成骨細胞（osteoblast，OB）分化，抑制破骨細胞（osteoclast，OC）分化，保護骨密度（bone mineral density，BMD），或許其可成為治療OP 的潛在藥物[4]。因此，本文對近年來KAE在細胞、炎癥因子、信號通路等方面對OP 的影響進行綜述，為臨床上OP 的治療提供新的思路。

1 KAE 防治OP 細胞水平的研究

1.1 KAE 對OB 的作用

OB 是骨修復的重要細胞，在骨修復過程中OB 大量增殖分化，作用到修復部位，再經信號傳導分泌骨基質，引起基質礦化，從而提高BMD[5]。堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）是由OB 分泌和合成的蛋白，是OB 成熟分化的主要標志。Xie等[6]研究證明，KAE 通過p53 抑制糖皮質激素受體，改善地塞米松在MC3T3-E1 細胞中的作用，且呈劑量依賴性地提高ALP 活性，提示KAE 可以通過調控激素水平來調節OB 的形成，提高BMD。戴燚等[7]發現，KAE 通過Wnt/β-catenin 信號通路促進β-catenin、Wnt 蛋白表達，提高細胞內ALP、前列腺素E2、一氧化氮的含量，同時調節骨保護素重組蛋白與核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）受體激活蛋白配體（receptor activator of NF-κB ligand，RANKL）的表達水平，從而防治OP。說明KAE可能通過提高ALP，從而提高骨鈣素水平，影響骨代謝。以上研究表明，KAE 可能通過調控下游因子和信號通路的表達提高ALP 的活性，提高骨鈣素水平，從而刺激成骨細胞分化，預防骨質疏松。因此更深入地研究KAE 對ALP 的調控機制具有重大臨床意義，還需要進一步探索討論。

1.2 KAE 對骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BMMSC）的影響

BMMSC 是一群非造血的骨髓基質細胞，可增加成骨細胞中骨基因的含量，促進骨的形成[8]。有研究發現，BMMSC 可以促進促分裂原活化的蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）信號通路中的相關蛋白的表達，從而抑制BMMSC 分化為成脂細胞來改善OP[9]。王文麗等[10]發現，KAE 呈劑量依賴性提高BMMSC 向成骨分化，同時發現ALP 的活性也呈濃度依賴性提高。說明KAE 可能通過ALP 的活性提高BMMSC 的分化對防治OP 有重大的臨床指導意義。崔琳娜[11]通過動物實驗發現，KAE 可通過哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物（mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1）信號通路提高RUNX 和Osterix 相關蛋白的表達，促進BMMSC 向成骨細胞轉化。表明mTORC1 信號通路參與KAE 誘導BMMSC 的成骨潛力。綜上所述，可推測KAE 能通過提高MAPK 和MTORC1 通路中相關蛋白的表達，提高ALP 活性，促進BMMSC 向成骨細胞分化，并抑制BMMSC 分化為成脂細胞，減少OB 凋亡，提高BMD 水平。MTORC1 和MAPK 可能會成為治療骨質疏松的潛在通路，但尚需實驗支撐。

1.3 KAE 對OC 的作用

OC 是由巨噬細胞增殖分化而來的一種具有骨吸收功能的多核細胞，是主要的骨吸收細胞，在人體骨骼發育中的作用至關重要。OC 中含有參與骨吸收過程的水解酶-抗酒石酸鹽酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP），是OC 分化的主要標志。阿吾提·卡斯木[12]發現，KAE 可以呈劑量依賴性抑制TRAP 的活性，同時發現KAE 可以提高MAPK 信號通路使MC3T3-E1 細胞增加。因此KAE 可以通過調控下游因子促進OB 增殖抑制OC 分化，從而防治OP，但其最優劑量還不確定。Kim 等[13]通過TRAP 染色發現，KAE 能抑制小鼠巨噬細胞自噬并通過降解p62/SQSTM1 促進OC 分化，表明KAE 可能通過調控細胞自噬來抑制P62/SQSTM1 的表達，調控OC。說明p62/SQSTM1 蛋白可能作為KAE 治療OP 的靶點。Akbar 等[14]研究發現，KAE 可抑制RANKL/RANK 信號通路的激活與表達，抑制OC 的分化與成熟，調節骨代謝平衡。綜上所述，KAE對OC 的作用可能是通過抑制細胞自噬、誘導OC 凋亡、調控RAN KL/ RANK/MAPK 等下游信號通路預防骨質疏松。但關于OC 的自噬與凋亡機制十分復雜，仍需進一步研究。

2 KAE 通過調節炎癥細胞因子對OP 的影響

2.1 促炎性細胞因子Jun

Jun是一種促炎性細胞因子，與FOS 一起形成AP-1 的二聚體復合物，通過多種機制促進骨生長發育相關基因的轉錄和表達，從而調節骨代謝[15]。張泉龍等[16]發現，淫羊藿能夠能提高下丘腦FoxO1 蛋白的活性，抑制AP-1 活性，從而降低破骨細胞分化水平，并改善BMD、骨小梁參數。因此推斷淫羊藿抗OP 機制可能與AP-1 活性有關。Behl 等[17]發現KAE 通過抑制c-Jun N 末端激酶發揮抗氧化、抗炎作用，抑制OC 的形成。因此推斷KAE 通過下丘腦抑制Jun 的表達，減少炎癥反應，提高交感神經興奮，從內分泌途徑改善骨代謝，來抑制OC 的形成，從而抑制OP 的發生與進展。因此研究KAE 對炎癥因子的影響對抗OP 有重大意義，細胞抗氧化機制有可能成為防治OP的重要環節，但其具體機制還需進一步研究。

2.2 腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）

氧化應激反應可以刺激OC 的成熟和分化導致OP[18]。TNF-α 通過調節氧化應激反應，在OP 中起著維持骨量和重塑骨質的重要作用，TNF 還可通過激活NF-κB 通路、促進RANKL、抑制OC 分化和增加骨吸收來影響OP[19]。Palacz-Wrobel 等[20]通過細胞培養發現，30 μmol/L 的KAE 可降低TNF 的表達，并且通過增加抗炎細胞因子白細胞介素（interleukin，IL）-6 的分泌來降低炎癥強度。鑒于TNF 在OC 中的作用說明KAE 可能通過減輕炎癥反應來維持骨代謝平衡。Wang 等[21]利用網絡藥理學分析發現，淫羊藿等中草藥中KAE 等有效成分能降低大鼠血清中IL-6 和TNF-α 水平，使BMD 指數明顯提高，且實驗組中骨形態生成蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP-2）、Runt 相關轉錄因子2（Runt related transcription factor 2，Runx2）表達顯著升高，從而促進OB 活性。說明KAE 抗OP 的機制可能與BMP-2、Runx2 信號通路有關。綜上所述，KAE 能刺激BMP-2、Runx2 信號通路，降低IL-6 和TNF-α 表達，抑制炎癥反應來刺激OB 成熟，防止骨結構的破壞，維持骨代謝平衡。

2.3 IL 因子

IL-6、IL-8 等是參與骨關節病生理學的主要促炎性細胞因子。有研究發現，IL-8 可以通過刺激OB 的BMMSC 表達從而刺激成軟骨細胞成熟分化，其鈣化后再重塑成骨，增強BMP2 的骨誘導性，從而抑制OC 分化[22]。Lee 等[23]研究證明，KAE 可以調節IL-1β 水平，抑制RANKL 介導的細胞外調節蛋白酶和重組蛋白激酶磷酸化，以及c-Fos 和NFATc1 的表達，從而抑制OC 分化與成熟。綜上所述，KAE 可以通過抑制IL，發揮抗炎作用，刺激BMMSC 表達激活BMP2 信號通路，從而促進OB，抑制OC，預示IL 在防治OP 發生的治療中具有巨大的發展前景。

3 KAE 防治OP 相關通路的研究

3.1 核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路

NF-κB 信號通路在OC 的形成中起著非常重要的作用。NF-κB 信號通路受到RANKL 細胞因子和相關蛋白的嚴格調控，最終誘導OC 的形成和分化[24]。Zhu 等[25]通過研究發現，KAE 呈劑量依賴性提高骨標志物水平。同時發現KAE 通過NF-κB 信號通路來降低IL-10 的釋放和增加IL-6 的釋放來緩解炎癥，同時發現KAE 可以抑制BMMSC 的成脂分化。鑒于BMMSC 的作用，KAE 可以通過NF-κB 信號通路抑制OC。Li等[26]發現，有效成分KAE 可呈劑量依賴性抑制NF-κB 通路及下游因子TRAP 活性，從而抑制OC 的生成。綜上所述，KAE 可以抑制NF-κB 信號通路，減少炎癥反應，從而預防OP。NF-κB信號通路可能會作為抗OP 的重要靶點，但其機制復雜，還需要大量的研究證明。

3.2 雌激素受體（estrogen receptor，ER）信號通路

ER 主要是刺激成骨細胞分泌膠原酶，促進骨重建，抑制OC活性，減少骨吸收[27]。Guo 等[28]發現，50 μmol/L 濃度KAE 可呈濃度依賴性提高ER 轉錄活性來促進OB 分化與成熟。同時發現，經KAE 誘導大鼠OB 的ALP 活性增加。鑒于ALP 在OB 中的作用，可以得出KAE 通過刺激ER 信號傳導作用，使得成骨分化，但其最優劑量還需進一步完善。Sharma 等[29]發現，KAE通過刺激ER 信號傳導激活Wnt/β-catenin 信號通路，發現OB細胞中ALP、Runx2 等活性增強。說明KAE 可作用于ER，促進OB 的分化，減少骨量，抑制OC，使得OB、OC 達到動態平衡，從而抑制OP。因此，KAE 可以成為雌激素代替療法的中藥治療藥物，但其涉及的信號通路較多，其具體機制有待進一步研究。

3.3 KAE 參與激活發生蛋白BMP/Smads 信號通路

骨形態轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）和BMP2 對促進骨折愈合和骨再生發揮著巨大的作用，在臨床上可用于治療OP 患者[30]。有研究發現在TGF-β 通路中，Smad 受體與TGF-β 結合，促進Smad 的C 端磷酸化，形成復合物并轉位到細胞核中，從而促進OB，抑制OC；在BMP 信號傳導過程中，磷酸化的R-Smad 受體可調節Runx2 的表達，再經過BMP-Smad 信號傳導從而參與OB 分化和骨形成[31]。說明Smads 參與TGF-β 和BMP 通路的調節，同時刺激成骨細胞分化，因此研究TGF-β 通路和BMP2 通路對預防OP 有指導意義。Kim 等[32]發現，KAE 處理后的MC3T3-E1 細胞呈劑量依賴性增長，并發現ALP、Runx2、BMP-2 的活性也顯著增加。說明KAE 可以通過Runx2、BMP-2 信號通路，增加ALP 活性，促進OB 分化。綜上所述，KAE 可以通過BMP/TGF-β 信號傳導，使OB 和OC 達到動態平衡，從而治療OP。因此，在研究防治OP的藥物機制時，通過抑制OC 的同時促進OB 將會是未來研究的熱點。

3.4 轉錄因子Runx2 相關通路

Runx2 是一種刺激成骨作用的基本轉錄因子，有研究發現，通過轉錄激活劑刺激Runx2 的活性來調節BMMSC 的OB和成脂細胞分化[33]。趙晶[34]研究發現，采用KAE 干預小鼠BMMSC 后，Runx2和Osterix 的蛋白水平明顯上升，同時ALP活性提高。說明KAE 可以提高Runx2水平，促進成骨，抑制OP。Qiu 等[35]通過KAE 作用于BMMSC 細胞，發現KAE 可通過激活Wnt/β-catenin 信號通路，提高Runx2、osterix/Sp-7、β-catenin 等相關蛋白的表達，增加成骨形成。證明KAE 可以通過刺激轉錄激活劑誘導Runx2來調節BMMSC 的成骨分化和成脂分化來預防OP。綜上所述，Runx2是調控Wnt/β-catenin信號通路的重要轉錄因子，鑒于Runx2在BMMSC 中的作用，Runx2可能通過BMD 發揮作用，在開發治療骨質疏松的新藥研究中具有巨大潛力，有待更深入的研究。

4 小結和展望

隨著中國老齡化進程越發加快的社會態勢，現代臨床治療OP 的策略雖然起效快，但亦存在副作用大，價格高等弊端。為減輕社會壓力，中醫藥防治OP 已經成為開發新藥的必然選擇。KAE 作為抗OP 的天然藥物比人工合成藥物具有明顯優勢：①不良反應小，可以通過一些膳食來補充。②來源方便，易于獲得。③花費少，患者易于接受。由此可見未來中醫藥防治OP將會成為大趨勢。

本文探討KAE 分別通過調節TNF、IL、Jun 等炎癥因子和影響BMP2、Runx2、NF-κB、MAPK、RANKL/RANK、ER 等相關信號通路促進OB 分化、抑制OC 分化來防治OP。目前對于KAE 的研究僅限于體內外研究，臨床研究較少。因此，還需要大量臨床研究作為依據證明KAE 對OB 和OC 的影響。最后KAE 作為具有巨大潛力防治OP 的有效成分，其治療OP 的作用靶點尚不明確、具體作用機制及保證效果的用藥劑量相關研究還不夠全面。因此還需要進行大量的臨床試驗進行驗證，為防治OP 提供更為安全有效的臨床方案。

利益沖突聲明：本文所有作者均聲明不存在利益沖突。