液相色譜-質譜技術在骨關節炎局部組織樣本檢測中的應用進展

劉德仁 廖太陽 吳 鵬 茆 軍

南京中醫藥大學附屬醫院骨傷科，江蘇南京 210029

代謝組學是檢測小分子代謝物的先進分析技術，是篩選疾病生物標志物和了解代謝途徑的有效工具[1]。液相色譜-質譜（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）作為代謝組學中最常用的分析檢測技術，具備高通量定性和定量分析的優勢[2-3]。因其所需樣本量小、高靈敏度和可靠的定量分析等優點，被廣泛應用于描述代謝途徑的特征、疾病生物標志物的鑒定及藥代動力學的追蹤[4-7]。LC-MS 技術通過靶向或非靶向途徑確定代謝表型，深刻地闡述疾病的代謝特征[8]。但應用LC-MS 技術揭示骨關節炎（osteoarthritis，OA）發生、發展過程中代謝產物和代謝途徑的變化還處于基礎階段，且部分研究著重利用LC-MS 技術檢測血清或滑液中代謝物的特征[9-12]。盡管人們運用LC-MS 技術探究OA 生理、病理代謝過程的興趣愈加熱烈，但采用OA 中關節軟骨、滑膜和脂肪墊等局部組織作為LC-MS 檢測的樣本仍處于探索階段，并且關節軟骨、滑膜和脂肪墊等作為OA 病理過程中最直接、最根本的病理改變，更能反映出OA 發生、發展的本質。本文就LC-MS 技術在OA局部組織樣本檢測中的應用進展進行綜述。

1 LC-MS 研究及OA 通用的局部組織樣本

1.1 LC-MS 研究

當前，LC-MS、氣相色譜-質譜和磁共振波譜是代謝組學中常見的檢測技術，前兩者占已發表的代謝組學研究的極大部分[13]。LC-MS 技術把具備高分離能力的液相色譜系統作為分離系統，把具備高靈敏度和高選擇性的質譜系統作為檢測系統，結合二者的優勢來檢測樣本中代謝物和代謝途徑的作用[14]。

1.2 常用的局部組織樣本

OA 中發生病理改變的局部組織主要涉及關節軟骨、滑膜和脂肪墊。微環境變化會引發軟骨細胞代謝異常，軟骨細胞為了適應該環境，會從一種代謝途徑轉向另一種代謝途徑[15]。OA中關節軟骨代謝的整體改變能通過代謝組學檢測分析[16]。滑膜炎可能是OA 的初始病理改變，而滑膜在軟骨新陳代謝和物質交換中起到關鍵作用[17]。膝關節局部脂肪組織——髕下脂肪墊可與鄰近組織相互作用，能分泌各種細胞因子，可能在OA 中產生雙向效應[18]。OA 中針對脂肪墊的分析較少，脂肪墊信號強度的改變與OA 相關生物標志物存在關聯[19]。種種證據都指明OA 的發生和發展與關節軟骨、滑膜和脂肪墊的代謝改變有著極強的相關性，應用LC-MS 技術分析OA 局部組織樣本中代謝物和代謝途徑的改變，揭示OA 的潛在病理特征具有豐富前景。

2 LC-MS 技術在OA 局部組織樣本檢測中的應用

2.1 LC-MS 技術在關節軟骨檢測中的應用

關節軟骨在一定程度反映了關節生理學與病理學，常被選為檢測關節疾病的樣本。Southan 等[20]對小鼠和豬損傷后關節軟骨的LC-MS 非靶向代謝組學進行交叉分析發現，關節軟骨損傷后精氨酸和脯氨酸代謝及精氨酸生物合成途徑顯著富集，調節的還有糖酵解、糖異生和維生素B6代謝途徑。Fredrikson等[21]應用LC-MS 技術發現，包裹在微凝膠中的軟骨細胞在氨基酸合成和中樞能量代謝相關途徑明顯上調。這兩項研究著重提及關節軟骨受影響后主要涉及氨基酸代謝和能量代謝途徑的變化。并且值得注意的是，LC-MS 技術是多組學研究中的一環，Southan 等[20]綜合代謝組學和轉錄組學探究關節軟骨損傷機制；Anderson 等[22]綜合代謝組學和蛋白質組學研究馬體外OA 軟骨模型，確定一組OA 模型早期差異豐富的代謝物和蛋白質。這映射出將代謝組學與基因組學、蛋白質組學和轉錄組學等相結合更具說服力，多組學相結合是一種更全面、更科學的拓展OA 研究領域的方法[23-24]。此外，Fredrikson 等[21]將LC-MS 技術作為驗證單細胞軟骨微凝膠和組織工程的一環，應用LC-MS 技術說明單細胞軟骨微凝膠的代謝證據。可見，LC-MS 技術在關節軟骨中的應用不能僅限于檢測關節軟骨中差異代謝物和代謝途徑。

2.2 LC-MS 技術在滑膜檢測中的應用

Kim 等[25]對OA 和類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）患者的滑膜行LC-MS 檢測發現，相比于RA 滑膜，OA 滑膜主要有脯氨酸、谷氨酸和天冬氨酸等13 種代謝物上調；相比于OA滑膜，RA 滑膜主要有煙酰胺、溶血磷脂酰膽堿（20∶4）、腺嘌呤和單磷酸腺苷等13 種代謝物上調。Li 等[26]檢測不同濃度枸杞水提物對OA 模型大鼠滑膜代謝物的影響，鑒定出13 種差異代謝物。近年來，對OA 中滑膜炎和滑膜纖維化的研究眾多，但LC-MS 技術中選取滑膜作為樣本還需要豐富[27]。研究表明，高速泳動族蛋白B1 和金屬蛋白酶等可來源于滑膜，會促進炎癥和關節基質降解[28]。可見滑膜作為局部組織樣本能有效反映OA 病理發生、發展中代謝改變，選取滑膜作為局部組織樣本應用于LC-MS 研究有著很大的研究前景。

2.3 LC-MS 技術在脂肪墊檢測中的應用

當前，LC-MS 技術選取脂肪墊作為檢測樣本的研究較少。Nieminen 等[29]對非炎癥性創傷對照、OA 和RA 患者的髕下脂肪墊行LC-MS 非靶向分析，檢測到13 種差異代謝物，主要涉及硫酸睪酮、硫酸雄酮、磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰膽堿（18∶0）、精氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和胍乙酸，分別與雄激素、膽汁酸和脂質代謝途徑相關。可以看出，LC-MS 技術檢測脂肪墊差異代謝物可用于OA 與RA 的鑒別，脂質代謝途徑在OA與RA 患者中差異顯著；雄激素、膽汁酸代謝是OA 與RA 鑒別的前瞻性代謝通路。此外，OA 和RA 患者在髕骨下脂肪墊的脂肪酸特征也存在明顯差異[30]。但臨床采用脂肪墊作為LC-MS局部組織樣本面臨侵入性操作問題。因此，OA 局部組織樣本的采集是患者在接受手術過程中進行，部分是從患者遺體中采樣，例如Carlson 等[31]收集人死后滑液樣本。從OA 早期患者中收集局部組織樣本面臨創傷和患者拒絕等因素，但使用動物模型不能完全復制真實的人類生物環境，從OA 早期患者收集局部組織樣本用作LC-MS 研究仍面臨困難。

綜上，OA 中關節軟骨、滑膜和脂肪墊等局部組織代謝紊亂主要是精氨酸、脯氨酸、谷氨酸和溶血磷脂膽堿等代謝物，涉及氨基酸、脂質代謝等代謝途徑。精氨酸、脯氨酸和谷氨酸是膠原蛋白的重要組成成分，OA 誘導的纖維化與其含量升高相關[32]。溶血磷脂酰膽堿是一種與疼痛相關的脂質，與OA 患者的慢性疼痛相關[33]；研究還發現，膝關節內注射溶血磷脂酰膽堿會產生持續數天的繼發性機械痛覺[34]。

3 小結與展望

綜上所述，LC-MS 技術在OA 局部組織樣本檢測的應用正在豐富，OA 的發生、發展涉及代謝物和代謝途徑變化，精氨酸、脯氨酸、谷氨酸和溶血磷脂酰膽堿等代謝物及氨基酸、脂質代謝等多種代謝途徑可作為OA 潛在的治療靶點。但仍需要注意的是，LC-MS 技術所能鑒定出的代謝物數量受限，難以全面闡述機體代謝的全貌，需要克服LC-MS 自身技術局限性，加強樣本處理、分析的規范性，盡最大可能保證實驗結果的準確性、可信性。必要時，可多組學綜合分析。并且，要對LC-MS 技術已識別的OA 局部組織代謝物進行有針對性的研究，不能僅停留在發現差異代謝產物上，需要關聯調控這些代謝物的上游蛋白和基因，通過追蹤檢測、整體分析來了解其在OA 病理、生理中怎樣發揮作用；需要進一步的研究來量化和驗證這些發現，考慮更大的研究規模，以及更規范、嚴謹的實驗設計。相信LC-MS 技術在OA 局部組織樣本的應用研究在不久的將來必定有所突破創新。

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