我國沿海5個地區冬季養殖仿刺參體表微生物多樣性比較分析

潘美利 黨慧鳳 黃宇希 王曉航 黎睿君 丁君

摘 要：為探究仿刺參（Apostichopus japonicus）體表微生物在仿刺參疾病發生與環境交互中的作用，采用Illumina HiSeq高通量測序技術對來自大連、營口、唐山、威海、寧德等5個沿海地區的養殖仿刺參體表微生物進行了多樣性分析。結果顯示，地域差異對仿刺參體表微生物組成影響明顯，其中福建省寧德市霞浦縣（ND）養殖仿刺參的體表微生物組成與其他4個地區差異最明顯。在門水平上，各地區的最優勢菌門均為變形菌門（Proteobacteria），其中ND組相對豐富度（76.16%）最低；在目和科水平上，ND組的最優勢微生物分別屬于柄桿菌目（Caulobacterales）和生絲單胞菌科（Hyphomonadaceae），所占比例分別為14.48%、14.34%；在屬水平上，ND組仿刺參體表微生物中不動桿菌屬（Acinetobacter）、副球菌屬（Paracoccus）、毛螺菌屬（Lachnospira）等所占的比例與其他各組存在顯著差異（P＜0.05）；山東省威海市乳山市（WH）養殖仿刺參體表微生物多樣性在屬水平上的相對豐富度最高，該組副球菌屬所占比例與其他地區均存在顯著差異（P＜0.05）。研究結果可為進一步開展仿刺參體表微生物多樣性與環境適應進化研究以及養殖仿刺參病害防治提供參考。

關鍵詞：仿刺參；冬季；體表微生物；多樣性差異

仿刺參（Apostichopus japonicus）又稱刺參，隸屬于棘皮動物門（Echinodermata）、海參綱（Holothuroidea）、刺參科（Stichopodidae）、仿刺參屬（Apostichopus），是我國海參的代表物種之一，也是我國重要的棘皮動物養殖品種，其產地從北部的渤海灣和遼東半島到南部的南沙群島均有分布［1-2］。仿刺參富含7種必需氨基酸和大量抗衰老的酸性黏多糖，被認為是最好的海參品種之一［3-4］。為滿足人們的消費需求，我國自20世紀50年代開始開展刺參增養殖技術研究［5］，其養殖在20世紀80年代迅速發展，仿刺參也逐漸成為我國最重要的水產養殖品種之一［6］。我國仿刺參的大規模養殖地區以遼東半島和山東半島為主，其次是河北和福建的沿海地區。根據農業農村部的數據統計，2022年中國仿刺參養殖產量達到248 508 t［7］。

隨著仿刺參養殖規模和范圍的不斷擴大，仿刺參養殖過程中病害頻頻發生，對其養殖業造成了嚴重經濟損失，其中以腐皮綜合征、幼參爛胃病、體泡綜合征（BVS）等疾病尤為嚴重［8-9］。Becker等［10］發現，引起仿刺參表皮潰爛病的病原有弧菌屬（Vibrio sp.）、擬桿菌屬（Bacteroides sp.）和α-變形菌門（α-Proteobacterium）等。王印庚等［11］認為，引起養殖刺參腐皮綜合征的主要病原菌為弧菌和假單胞菌。張春云等［12］利用形態學、生理生化實驗和16s rRNA分子生物學鑒定方法，發現養殖刺參腐皮綜合征的致病菌是燦爛弧菌（Vibrio splendidus）。這些疾病的發病部位大多在仿刺參體表，因此，研究仿刺參體表微生物的多樣性對于預防和控制養殖仿刺參疾病至關重要。

本研究對來自中國沿海5個養殖地區的冬季養殖仿刺參體表的微生物多樣性進行了分析，以期為進一步開展仿刺參體表微生物多樣性與環境適應進化研究以及仿刺參疾病防治提供參考。

1 材料和方法

1.1 取樣

2021年11月—2022年1月，分別在我國沿海5個大型半開放仿刺參養殖基地采集仿刺參樣品，采樣點具體信息見表1。各基地單個養殖池塘面積約為6.67 hm2，水深2～3 m，養殖水來自近海海域利用納潮納入的海水。全年不投喂飼料，不投放益生菌，保證仿刺參自然生長。

從5個地區的養殖基地各隨機采集10頭仿刺參樣品，樣品平均濕體質量在55～60 g/頭（排水后體質量為35～40 g/頭）。將仿刺參從養殖基地的養殖池中撈起后立即放入加有養殖海水的無菌密封袋中，采用冰袋低溫運輸，24 h內空運至大連市海珍品疾病防控重點實驗室。

1.2 仿刺參樣品準備

從各采樣點的仿刺參樣品中分別隨機選取3頭作為3個平行樣。在超凈工作臺上，使用滅菌的手術刀取仿刺參背部中間的表皮0.2 g放入滅菌的小燒杯中，用無菌海水濯洗2～3次，裝入滅菌的2 mL離心管中；在無菌條件下，使用勻漿器將離心管中的仿刺參表皮充分研磨成勻漿，將裝有勻漿的2 mL離心管放入液氮中速凍；使用干冰送交北京諾禾致源科技股份有限公司進行擴增子高通量測序分析。

1.3 仿刺參體表微生物基因組提取及檢測

采用CTAB法提取仿刺參體表細菌基因組DNA［13］。取適量樣本DNA于離心管中，用無菌水將樣本稀釋至1 ng/μL，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度。

1.4 PCR擴增與純化

分別以DL、YK、WH、TS、ND 5個地區的仿刺參體表DNA為模版，用16s rDNA-V4通用引物（上游序列為515F：5-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3，下游序列為806R：5-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3）［14］對16s rDNA-V4的基因進行PCR擴増。取5 μL的PCR產物于2％的瓊脂糖凝膠中電泳檢測，檢測條件為5 V/cm，25 min，并用Qiagen Gel Extraction Kit（QIAGEN，Germany）凝膠回收試劑盒回收16S rDNA-V4區的片段。

1.5 文庫構建和上機測序

測序所得的原始數據經過FLASH 1.2.7軟件拼接［15］，拼接得到的原始序列數據（raw tags）利用Qiime V1.9.1進行質量過濾［16］，得到高質量的標簽數據（clean tags），通過UCHIME Algorithm去除嵌合體［17］，得到最終的有效數據（effective tags）。利用Uparse 7.0.1001軟件［18］對所有樣本的全部有效數據進行聚類，以97%的一致性（identity）將序列聚類成為操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs），同時選取OTUs中出現頻次最高的序列作為代表序列。用Mothur軟件和SILVA［19］的SSUrRNA數據庫［18］對OTUs代表序列進行物種注釋分析（設定閾值為0.8～1.0）。此過程委托北京諾禾致源科技股份有限公司完成。

2 結果和分析

2.1 序列拼接組裝與OTU聚類分析

基于Illumina HiSeq測序平臺測序構建PCR-free文庫，然后進行雙末端（paired-end）測序。通過對讀長（reads）拼接，平均每個樣品測得88 391條tags，經過質控，平均得到81 547條有效數據，質控有效數據75 292條，質控有效率達85.12%。以97%的一致性將序列聚類成為OTUs，共得到6 319個OTUs，然后對OTUs序列與Silva 132數據庫進行物種注釋。其中能夠注釋到數據庫的OTUs數目為6 300，分類為41個門、63個綱、158個目、315個科、865個屬、606個種。每個組別分析后的詳細數據見表2。

2.2 仿刺參體表微生物Alpha多樣性分析

Alpha多樣性分析可反映樣本內的微生物群落多樣性。冬季沿海5個地區仿刺參體表微生物多樣性指數見表3。由表3可見，5個地區養殖仿刺參體表的微生物多樣性存在差異。5組樣品的覆蓋率（goods_coverage）均達到99%以上，說明樣品中序列檢測率很高，測序結果符合樣品中體表微生物的真實情況。對比樣品中香農（Shannon）指數，辛普森（Simpson）指數，DL組的物種多樣性最高；同時，DL組的豐富度（Chao1）指數最大，表明DL組物種豐富度最大。

2.3 仿刺參體表微生物Beta多樣性分析

Beta多樣性可以反映不同地區冬季仿刺參體表微生物物種的組成差異。采用非度量多維尺度分析（NMDS）方法對不同組間樣本物種差異進行分析，結果見圖1。樣品間距離越近，表示二者物種差異程度越小；樣品間距離越遠，表示二者物種差異越大。結果顯示，DL組和YK組的仿刺參體表微生物物種組成與其他3個地區仿刺參體表微生物物種組成差異較大；TS、WH以及ND組這3個地區的仿刺參體表微生物物種組成差異較小。

2.4 仿刺參體表微生物組成分析

在門水平上（見圖2-a），5個地區養殖仿刺參體表微生物的第一優勢菌門均為變形菌門（Proteobacteria），其中TS組相對豐度占比最高，達87.44%；ND組相對豐度占比最低，為76.16%。YK、WH、TS組這3個地區養殖仿刺參體表微生物的次優勢菌門均為厚壁菌門（Firmicutes），相對豐度占比分別為5.67%、8.94%、5.90%。

在綱水平上（見圖2-b），α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）是5個地區養殖仿刺參體表微生物的第一優勢菌綱，其中YK組相對豐度占比最高，達83.05%；DL組相對豐度占比最低，為52.16%。DL、WH、TS和ND組這4個地區養殖仿刺參體表微生物的次優勢菌綱均為γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria），相對豐度占比分別為22.82%、17.12%、9.42%和20.25%；而YK組養殖仿刺參體表微生物的次優勢菌綱為擬桿菌綱（Bacteroidia）。

在目水平上（見圖2-c），DL、YK、WH和TS組養殖仿刺參體表微生物的第一優勢菌目均為紅螺菌目（Rhodobacterales），相對豐度占比分別為15.58%、38.03%、22.72%和22.09%；而ND組的第一優勢菌目為柄桿菌目（Caulobacterales），相對豐度占比為14.48%。在目水平上的第一優勢菌目呈現出明顯的南北地區差異。DL、ND組養殖仿刺參體表微生物的次優勢菌目為纖維弧菌目（Cellvibrionales），其相對豐度占比分別為14.58%和12.93%。

在科水平上（見圖2-d），DL、YK、WH和TS組養殖仿刺參體表微生物的第一優勢菌科均為紅螺菌科（Rhodobacteraceae），相對豐度占比分別為15.58%、38.03%、22.72%和22.09%，而ND組的第一優勢菌科為生絲單胞菌科（Hyphomonadaceae），相對豐度占比為14.34%。在目、科分類水平上的第一優勢菌均呈現出明顯的南北地區差異。DL、TS組兩地養殖仿刺參體表微生物的次優勢菌科為生絲單胞菌科，其相對豐度占比分別為11.17%和12.48%。

在屬水平上（見圖2-e），鑒定到的細菌總體水平偏低，常見病原菌弧菌屬并不在排名前30的優勢菌內，輔證了近年來由弧菌引起的仿刺參發病率逐年降低，同年度采集的仿刺參病例同樣較少。

由圖3可見，在屬水平上，沿海5個地區仿刺參體表微生物物種的相對豐度依次為WH>TS>DL>ND>YK，其中，WH和TS組乳桿菌屬（Lactobacillus）相對豐度占比較高，分別為2.70%和2.62%；WH組雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）相對豐度占比較高，為2.26%。

由圖4可見，位于南部的寧德地區與其他4個地區在屬水平上具有顯著差異的微生物有嗜冷菌屬（Colwellia）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、溶桿菌屬（Lysobacter）、副球菌屬（Paracoccus）、鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas）、亞硝化螺菌屬（Nitrosospira）、獨島桿菌屬（Dokdonella）、熱單胞菌屬（Thermomonas）等。威海地區在屬水平上的微生物多樣性最為豐富，該地區與其他4個地區存在差異的微生物有不動桿菌屬（Acinetobacter）、副球菌屬（Paracoccus）等，其中副球菌屬（Paracoccus）與其他4地均有顯著差異。

3 討論

3.1 仿刺參體表微生物的結構特征

本研究發現，沿海5個地區的仿刺參體表微生物主要由變形菌門（76%～88%）和厚壁菌門（2%～10%）組成，其中變形菌門為第一優勢菌，這與主要魚類體表微生物結構分析的結果一致［20-21］。有研究發現，在門水平上，虹鱒（Oncorhynchus mykiss）［20］皮膚微生物以變形菌門和厚壁菌門為主，小頭裸裂尻魚（Herzensteinia microcephalus）［21］皮膚微生物的主要優勢菌為放線菌門（Actinobacteria）和變形菌門。仿刺參屬于底棲生物，其生活的沉積泥中的最優勢菌也是變形菌門［22］。變形菌門是細菌中最大的一個門，有著最龐大的微生物類群，在各種復雜的環境中都能存活，這類微生物可以參與環境中的碳循環，為宿主積累能量，與宿主的生理特性關系緊密相連［23-24］。仿刺參體表微生物在綱、目水平上的優勢菌分別為α-變形菌綱以及紅螺菌目，均歸屬于變形菌門，其中紅螺菌目是α-變形菌綱中的主要目，這類微生物可以通過光合作用進行生長，還可參與海洋中的碳、氮循環［25］。厚壁菌門多數為革蘭氏陽性細菌，其分布于近海和前海的沉積物中［26］，與刺參活動范圍相符［27］。

3.2 仿刺參體表微生物的潛在致病菌

本研究對5個不同沿海地區的仿刺參體表微生物進行分析，發現仿刺參體表微生物存在不動桿菌屬，該屬微生物可能會導致水質污染和水生動物疾病的發生。不動桿菌屬是一類非發酵革蘭氏陰性桿菌，在自然環境的水體和土壤中廣泛存在，是一類毒力較低的條件致病菌［28］。本研究發現，ND與YK、DL、TS等組的顯著差異菌在屬水平上均有不動桿菌。王軼南等［29］發現，在化皮參苗（Apostichopus japonicus）病灶組織微生物群落結構中存在不動桿菌屬，且其屬于第二優勢菌。不動桿菌屬作為重要的病原菌可致使魚類發生疾病，如鮑曼不動桿菌對美洲鰻鱺（Anguilla rostrata）［30］、鱖（Sinipercachuatsi）［31］、異育銀鯽（Carassius auratus gibelio）［32］、斑點叉尾魚回（Ictalurus punctatus）［33］、線鱧（Channastriata）［34］、露斯塔野鯪（Labeo rohita）［35］均具有致病性；瓊氏不動桿菌可引起石鰈（Kareius bicoloratus）［36］、錦鯉（Cyprinus carpio）［37］發生疾病。有研究表明，不動桿菌在水生動物處于健康狀態時不具有致病性［38］，但該菌的一個重要的感染途徑是在水生動物體表損傷時進行感染［［39］。不動桿菌屬的一些菌種可以分解有機質，產生氨、亞硝酸鹽和硝酸鹽等營養物質，為水生動物生長提供養分，但在水生動物養殖密度過高時則會導致水質污染，引起動物疾病的發生［40-41］。

弧菌作為條件致病菌，只有當宿主抵抗力降低或環境極度惡化時在養殖動物體表大量分離。李曉宇等［42］某次在大連地區發現仿刺參腐皮綜合征的致病菌為溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus），人工回歸感染試驗結果顯示，浸浴感染沒有出現病癥，而腹部注射和體壁創傷浸浴感染則出現病癥并伴有死亡，證實仿刺參體表黏膜層可抵御外來病原弧菌的侵襲，且溶藻弧菌是一種機會致病弧菌。張春云等［12］從患有腐皮綜合征仿刺參的病灶處分離得到優勢菌株——燦爛弧菌，人工回歸感染試驗發現，該菌株引發的癥狀與自然發病的癥狀相同，并且對健康仿刺參有很強的致病及致死作用。在本研究中，在屬水平上被注釋為前30位的優勢屬中并未見到弧菌屬，推測這與采集的樣本均為健康仿刺參有關。

3.3 仿刺參體表微生物的有益生物

在本研究中，WH組的優勢菌為乳桿菌屬，此外該組的副球菌屬與其他地區仿刺參體表微生物均存在顯著差異，以上菌屬都是益生菌，推測威海地區的仿刺參疾病發生較少。乳桿菌屬中的乳酸菌（Lactic acid bacteria）、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）等作為水產動物的腸道益生菌可改善腸道內環境，增強機體的免疫力［43］，其中，乳酸菌可作為一種生物屏障抑制病原弧菌的感染；嗜酸乳酸桿菌可分泌抑制物質，與病原弧菌競爭營養從而抑制病原菌的生長，也可降低病原弧菌的黏附率［44］；乳酸桿菌作為益生菌可以促進刺參腸道中益生菌的生長，增強其免疫能力，降低刺參感染疾病的風險［45］。仿刺參腐皮綜合征等皮膚病是由弧菌引起的，周海平等［46］研究表明，乳酸桿菌對病原弧菌有很好的抑制作用；雙歧桿菌屬次之，其屬中的兩歧雙歧桿菌（Bifdobacterium bidfium）是水產養殖中常用的益生菌［47］。

副球菌屬隸屬于變形菌門中的紅螺菌目、紅螺菌科，與本研究中在目水平上和科水平上注釋到的微生物相呼應。副球菌屬的存在可提高刺參的免疫能力。有研究表明，副球菌屬中的馬氏副球菌（Paracoccus marcusii）作為刺參飼料的添加劑可以有效提高刺參體腔細胞的呼吸爆發活力，上調刺參體腔細胞非特異性免疫基因的表達量，增強刺參的非特異性免疫力［48］，還可促進其生長，提高刺參腸道和體腔細胞的免疫能力。在體外試驗中發現，馬氏副球菌對引起刺參腐皮綜合征的病原菌燦爛弧菌具有抑制作用［49］。

3.4 不同海域仿刺參體表微生物的異同及其影響因素

本研究發現，不同海域仿刺參體表微生物的群落結構存在差異，推測其與仿刺參生存海域環境的微生物組成有關。在物種組成上，采自黃海海域（DL和WH）仿刺參體表微生物的多樣性和豐富度總和均高于采自渤海海域（YK和TS）以及東海海域（ND）仿刺參體表微生物的多樣性和豐富度總和。據報道，仿刺參腸道微生物與其生活的環境密切相關，黃海海域的仿刺參腸道微生物多樣性顯著高于渤海的［50］。這與本研究仿刺參體表微生物多樣性的研究結果一致。

不同海域仿刺參體表微生物的物種多樣性可能與海域間的水溫有關。本研究樣品采集時，黃海海域水溫高于渤海海域水溫，其微生物多樣性也高于后者，然而，東海海域水溫高于黃海海域水溫，其微生物多樣性卻低于黃海海域。有研究指出，溫度是影響環境中微生物結構重要的物理因子，溫度能夠加快微生物的生長和繁殖速度，同樣也可以抑制菌群的生長和繁殖速度，從而通過這種促進或抑制作用改變環境中的菌群結構［51-52］。

4 結論

仿刺參體表微生物多樣性分析發現，仿刺參的體表存在益生菌屬，也存在條件致病菌屬。健康仿刺參的體表微生物處于相對平衡狀態，養殖環境惡化會導致一些有害微生物大量增加進而誘發疾病，甚至導致養殖生物體死亡。仿刺參與其共生微生物的關系還需進一步探索。本研究分析了仿刺參體表微生物與自身環境的關聯性，可為進一步開展仿刺參體表微生物多樣性與環境適應進化以及仿刺參疾病的防治提供參考。

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Comparative analysis of microbial diversity on the skin of Apostichopus japonicus located at five coastal areas of China in winter

PAN Meili， DANG Huifeng， HUANG Yuxi， WANG Xiaohang， LI Ruijun， DING Jun

（College of Fisheries and Life Sciences，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China）

Abstract： Apostichopus japonicus was an important aquatic echinoderm in China，and its surface microorganisms played an important role in the occurrence of diseases of A. japonicus and the interaction with the environment.In this study，Illumina HiSeq high-throughput sequencing technology was used to analyze the diversity of microorganisms on the skin of sea cucumbers in five different coastal areas of China（Dalian，Yingkou，Tangshan，Weihai and Ningde）.The results showed that the regional differences had a significant impact on the surface microbial composition of A. japonicus.The skin microorganisms of A. japonicus collected from Ningde（ND） had the most significant difference compared with the other 4 groups.At the phylum level，Proteobacteria was the most dominant phylum in all groups，with the lowest relative richness in ND group（76.16%）.At the order and family level，the most dominant microorganisms of ND group belonged to Caulobacterales and Hyphomonadaceae respectively，accounting for 14.48% and 14.34% respectively.At the genus level，the percentage of some microorganisms in ND group were significantly different from other 4 groups（P＜0.05），in terms of Acinetobacter，Paracoccus，Lachnospira，etc.In addition，Weihai（WH） group had the highest relative richness at the genus level，with significant difference in Paracoccus percentage（P＜0.05）.The results of four research would provide a reference for the further study on microbial diversity and environmental adaptation of sea cucumbers，as well as the prevention and treatment of diseases of sea cucumbers.

Key words： Apostichopus japonicus; winter; skin microorganisms; diversity difference