黑松露多糖提取及純化研究進(jìn)展

紀(jì)如倩，覃宛鑫，龔湘涵，李秋然，韓偉

（華東理工大學(xué)藥學(xué)院制藥工程與過程化學(xué)教育部工程研究中心，上海市新藥設(shè)計(jì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237）

黑松露（perigord truffle）也稱塊菌、無娘果，是一種生長于地下的野生食用真菌，其對生長環(huán)境的需求極高，對陽光、水分或者土壤的pH極其挑剔。黑松露主要分布在阿爾卑斯山脈及喜馬拉雅山脈的一些地區(qū)，四川省攀枝花附近亦有分布。黑松露多糖十分昂貴，它與魚子醬、鵝肝醬在歐美同稱為三大珍品。黑松露富含粗蛋白、粗脂肪、粗纖維、維生素B1、維生素B2、維生素C、維生素PP、多糖等元素，營養(yǎng)價(jià)值極高，其中，黑松露多糖作為發(fā)揮生物活性的最重要的元素，受到人們的廣泛研究，其抗衰老、抗氧化、抗炎癥、增強(qiáng)免疫力等生理功效為實(shí)驗(yàn)所證實(shí)。

1 黑松露多糖的藥理作用

黑松露的藻、菌、地衣均可入藥，其中多糖是黑松露碳水化合物的主要來源，因此其直接體現(xiàn)著黑松露的營養(yǎng)價(jià)值。多項(xiàng)研究表明，黑松露多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、降血糖、降血脂等多項(xiàng)生理活性，與其他藥物相比，其毒副作用較低，水溶性好，因而受到研究者的廣泛關(guān)注[1]。

1.1 免疫調(diào)節(jié)作用

科學(xué)研究表明，黑松露多糖能夠在一定程度上進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)。趙玲[2]通過體外培養(yǎng)小鼠脾淋巴細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)塊菌粗多糖直接促淋巴細(xì)胞增殖作用和對LPS 誘導(dǎo)的B淋巴細(xì)胞增殖作用都不顯著，在多糖濃度為100 μg/mL 時(shí)表現(xiàn)出較強(qiáng)的促ConA 誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖作用，這一現(xiàn)象可能與黑松露多糖結(jié)構(gòu)有關(guān)；其通過體外培養(yǎng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，塊菌粗多糖在較低濃度下（50 μg/mL）就能顯著提高巨噬細(xì)胞吞噬中性紅的能力，且當(dāng)濃度大于100 μg/mL 時(shí)能極顯著提高吞噬能力，NO 的產(chǎn)量隨著塊菌多糖濃度的提高而升高。另外，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，一定濃度的塊菌多糖可以有效增強(qiáng)免疫抑制小鼠吞噬細(xì)胞的吞噬能力，進(jìn)一步論證了黑松露多糖是巨噬細(xì)胞的重要靶點(diǎn)。由此得出黑松露多糖可以通過增強(qiáng)T 淋巴細(xì)胞的增殖能力和巨噬細(xì)胞的吞噬能力來提高機(jī)體的免疫力。王海燕等[3]提取黑松露多糖并分離出兩個(gè)組分TP1和TP2，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明這兩種組分對小鼠巨噬細(xì)胞（RAW264.7）沒有毒性作用，且都能顯著增強(qiáng)小鼠巨噬細(xì)胞的中性紅吞噬能力，但TP1的作用優(yōu)于TP2。

1.2 抗氧化作用

多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，多糖在體內(nèi)和體外都具有較強(qiáng)的抗氧化活性。國琦[4]等從云南黑松露粗多糖中分離出四種不同分子質(zhì)量的多糖組分：TSP-1、TSP-2、TSP-3 和TSP-4，其中TSP-4含量最低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示這四種多糖組分在一定濃度范圍內(nèi)均具有較強(qiáng)的清除DPPH 自由基、ABTS自由基的能力，并有一定的鐵離子螯合能力與還原能力，且這種能力與其濃度成正比，但其清除能力均小于維生素C。魏鑫悅等[5]通過體外抗氧化實(shí)驗(yàn)得出黑松露多糖清除DPPH 自由基的能力要強(qiáng)于清除羥自由基的能力，且在濃度為3 mg/mL 時(shí)清除DPPH 自由基和羥自由基的效果最為顯著，分別為64.29%和52.42%。岳金玫[1]研究發(fā)現(xiàn)，塊菌多糖清除羥自由基效果最好，可能是分離得到的塊菌多糖組分不同所導(dǎo)致。

1.3 降血糖作用

多項(xiàng)研究表示，生物大分子的基本組成單位會(huì)影響其高級結(jié)構(gòu)及功能，而大多數(shù)具有降血糖功效的多糖都含有葡萄糖、半乳糖，少部分含有半乳糖醛酸、鼠李糖和巖藻糖[6]。魏鑫悅等[5]對黑松露多糖的單糖組成進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其主要成分分別是甘露糖、葡萄糖、鼠李糖、半乳糖，其中葡萄糖含量僅次于甘露糖；多糖類物質(zhì)通過調(diào)控相關(guān)消化酶如α-葡萄糖苷酶、麥芽糖酶等活性，調(diào)節(jié)肝臟糖代謝中關(guān)鍵酶表達(dá)和調(diào)控腸道菌群等途徑達(dá)到降血糖作用[6]。魏鑫悅等[5]的實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，黑松露多糖對α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶均有一定的抑制作用，其通過抑制相關(guān)消化酶活性來阻止其將多糖水解為葡萄糖，從而降低機(jī)體血糖水平。

1.4 抗腫瘤作用

王小花[7]對塊菌子實(shí)體及其發(fā)酵體系多糖組分對人結(jié)直腸癌（HCT-116）細(xì)胞株、乳腺癌細(xì)胞株（SK.BR-3）、肺癌細(xì)胞株（A.549）、肝癌細(xì)胞株（HepG2）和人白血病HL-60 細(xì)胞的增殖抑制作用分別進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)塊菌發(fā)酵體系多糖的腫瘤細(xì)胞抑制作用要強(qiáng)于塊菌子實(shí)體多糖，且對于肝癌細(xì)胞HepG2 增殖的抑制作用最為明顯。根據(jù)胡慧娟等[8]的研究，多糖對于腫瘤細(xì)胞的抑制作用可能是因?yàn)槎嗵峭ㄟ^上調(diào)細(xì)胞凋亡相關(guān)因子p21的表達(dá)同時(shí)下調(diào)細(xì)胞周期蛋白DI的表達(dá)，或者通過上調(diào)細(xì)胞凋亡相關(guān)因子Bax 蛋白，從而誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，直接抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。

2 黑松露多糖的提取

黑松露多糖具有抗氧化、抗衰老與降低血脂等多種生理功效，如何提高黑松露多糖得率，降低生產(chǎn)成本，且不破壞生物活性，對惠及人類身體健康具有重要意義。在黑松露多糖提取方面，傳統(tǒng)方法面臨易造成有效成分損失、耗時(shí)長等問題，現(xiàn)代提取技術(shù)較傳統(tǒng)方法具有提取速率快、收率高、無需加熱、環(huán)保等特點(diǎn)。

2.1 傳統(tǒng)提取方法

2.1.1 水煎煮法

水煎煮法即水提法，是傳統(tǒng)工藝提取中最常用的方法。該法是將中藥與水煎煮取汁，其一般原理：將預(yù)處理粉碎好的中藥置于適宜的煎煮器中，向其中加水并浸沒中藥，先浸泡一段時(shí)間后再對其加熱至微沸，保持微沸一段時(shí)間后，將煎出液分離，回收藥渣再進(jìn)行2～3次煎煮，回收合并各次煎煮液，再對煎煮液進(jìn)行后續(xù)精餾純化得到最終有效成分。此法實(shí)驗(yàn)設(shè)備簡單，操作工藝簡便，周期較短，但該法在煎煮過程中易造成黑松露焦糊，對溫度的控制較為嚴(yán)格，此外，由于多糖從細(xì)胞中浸取量少，最終產(chǎn)率較低，故此法不適用于對黑松露多糖的直接提取。

2.1.2 水提醇沉法

水提醇沉法是目前較為常用的黑松露多糖傳統(tǒng)提取方法，是水煎煮法進(jìn)一步優(yōu)化的提取工藝。該法利用多糖類物質(zhì)易溶于水，難溶于乙醇等有機(jī)溶劑的原理對多糖進(jìn)行提取。水提醇沉法根據(jù)浸取劑pH 的不同，可分為水提法、酸提法、堿提法。

水提法又可分為熱水浸提與冷水浸提，而對于多糖通常采用熱水浸提的方法。用熱水將多糖進(jìn)行萃取，由于多糖不溶于乙醇，可通過沉淀將多糖提取出來。岳金玫等[1]在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，測得傳統(tǒng)熱水浸提法的最佳工藝參數(shù)為提取溫度90℃，提取時(shí)間60 min，料液比33∶1（g/mL），在該條件下多糖理論提取率為13.45%，理論含量為70.75%，并驗(yàn)證得實(shí)際提取率為13.32%，實(shí)際含量為71.55%。該方法較一些其他傳統(tǒng)提取方法最終提取率較高，但該法由于實(shí)驗(yàn)所需溫度高、耗能多、耗時(shí)長，現(xiàn)在很少單獨(dú)使用此方法進(jìn)行提取。

酸堿提取法通過破壞多糖與其他物質(zhì)結(jié)合的化學(xué)鍵，使多糖變?yōu)橛坞x態(tài)后再進(jìn)行提取，在實(shí)驗(yàn)過程中由于使用酸堿浸提劑的原因，易造成環(huán)境污染。此外，不同黑松露多糖嗜酸堿性不同，實(shí)驗(yàn)前應(yīng)對不同黑松露多糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定。故因其實(shí)驗(yàn)時(shí)間較長，工作量較大，目前很少用于多糖的提取。

2.1.3 滲漉法

滲漉法是一種動(dòng)態(tài)的傳統(tǒng)提取方法，具體操作步驟：將原藥材進(jìn)行粉碎等處理后置于滲漉筒中，從筒的上部不斷添加溶劑，溶劑通過裝置往下流，并不斷滲過藥材，此時(shí)有效成分將隨之浸出。實(shí)驗(yàn)前選用合適的溶劑，將黑松露多糖提取出，此法溶劑的利用率高，有效成分能最大程度地浸出。滲漉法適用于一些貴重藥材的提取，對于黑松露多糖的提取而言無疑是有益的，但其易造成滲漉筒堵塞，導(dǎo)致產(chǎn)出率降低，故在多糖的提取中鮮用此法。

2.2 現(xiàn)代提取方法

2.2.1 超聲波輔助法

超聲波輔助法是利用20～50 kHz的機(jī)械波，產(chǎn)生強(qiáng)烈的空化效應(yīng)、機(jī)械振動(dòng)、擾動(dòng)效應(yīng)、擊碎和攪拌等多種作用而實(shí)現(xiàn)的。當(dāng)大量的超聲波作用于提取物時(shí)，空穴效應(yīng)使液體微粒間發(fā)生猛烈的撞擊作用，從而達(dá)到破壞細(xì)胞壁、加速目標(biāo)產(chǎn)品進(jìn)入溶劑的效果。天然產(chǎn)物樣品的前處理工作繁重、操作繁瑣、耗時(shí)長，超聲提取技術(shù)可以防止多糖降解和多糖活性的降低，而且能縮短提取時(shí)間，減小料液比，提高提取效率，降低生產(chǎn)成本[9]。

超聲波處理時(shí)間、處理溫度、處理功率等均會(huì)對最終產(chǎn)率造成影響，故其常搭配正交試驗(yàn)、Box-benhnken Design優(yōu)化、響應(yīng)面優(yōu)化法等對其各影響因素進(jìn)行最優(yōu)化處理。岳金玫等[1]運(yùn)用Box-benhnken Design 優(yōu)化超聲輔助提取黑松露多糖，發(fā)現(xiàn)最佳提取工藝為超聲時(shí)間36 min，超聲溫度50℃，液料比為40∶1（g/mL），超聲功率為140 W，在此條件下多糖得率為18.15%。黃治國等[10]運(yùn)用正交試驗(yàn)優(yōu)化超聲輔助提取黑松露多糖，發(fā)現(xiàn)最佳提取工藝為料液比l∶30（g/mL），超聲波溫度40℃，超聲波功率100 W，超聲波處理60 min，在此條件下黑松露多糖提取率為17.86%。

2.2.2 復(fù)合酶法

不同種類的酶作用靶點(diǎn)不同，因此使用復(fù)合酶比單一酶更高效[11]。大多情況下植物多糖被包裹在細(xì)胞壁內(nèi)，纖維素酶能破壞細(xì)胞壁，使多糖從細(xì)胞中釋放出來；而蛋白酶可以水解糖綴合物中的蛋白質(zhì)，有利于多糖的浸出。酶法相對于超聲波或微波更為溫和，對多糖結(jié)構(gòu)的破壞較少，并且其對設(shè)備和工藝的要求也較低，更適用于大規(guī)模生產(chǎn)[12]。

清源等[12]利用纖維素酶和中性蛋白酶對黑松露多糖進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)黑松露多糖的最佳提取工藝條件為酶配比1∶7（g/g），酶解時(shí)間48 min，酶解溫度41℃，酶用量3.6%，酶解pH 值4.8，料液比1∶29（g/mL），此條件下黑松露多糖的得率可達(dá)14.50%，說明復(fù)合酶法可用于黑松露多糖的提取。

2.2.3 微波輔助法

微波輔助提取技術(shù)是利用微波能，使得細(xì)胞內(nèi)分子吸收微波產(chǎn)生大量熱能，導(dǎo)致胞內(nèi)的溫度上升，加劇熱運(yùn)動(dòng)，同時(shí)液體汽化產(chǎn)生的壓力可導(dǎo)致細(xì)胞壁破裂，胞內(nèi)物質(zhì)滲出；同時(shí)胞內(nèi)液體汽化發(fā)生減少，細(xì)胞壁破裂，萃取液進(jìn)入胞內(nèi)，溶解并釋放胞內(nèi)物質(zhì)。該方法中微波能量利用率高，溫度提升快，加熱均勻，浸取時(shí)間短[13]。

清源[14]利用微波法提取黑松露多糖，發(fā)現(xiàn)最佳提取條件為微波功率320 W，料液比1∶40（g/mL），微波時(shí)間200 min，此條件下多糖提取率為15.54%，表明微波輔助法應(yīng)用于黑松露多糖提取是可行性的。

3 黑松露多糖的純化

目前，純化黑松露多糖的常用方法有水提醇沉法、樹脂吸附法以及吸附澄清法，這些方法在實(shí)際應(yīng)用過程中往往有提取率較低或雜質(zhì)較多等弊端。近年來一些新興的膜分離技術(shù)能夠集分離、精制、濃縮為一體，為分離純化提供了幫助[15]。

3.1 傳統(tǒng)純化方法

3.1.1 大孔吸附樹脂法

大孔樹脂吸附技術(shù)是多糖類純化的常用技術(shù)，可根據(jù)純化物質(zhì)的特點(diǎn)選擇不同型號的樹脂，樹脂本身不含有離子，其因分子間作用力而有吸附性。該法基本程序簡單：將樹脂置于層析柱中，以粗多糖溶液上樣，用乙醇洗脫后回收，得到多糖溶液[16]。文獻(xiàn)搜索中缺少其應(yīng)用于黑松露的實(shí)例，而基于樹脂吸附成本較低、純化效果好、廣泛用于天然產(chǎn)物純化的特點(diǎn)，可在粗提取后的富集步驟中使用，且粗處理后的多糖多酚含量僅存0.49%[4]，大大降低了脫色處理的難度。該方法的缺點(diǎn)是預(yù)處理難度較大，使用過程中易破碎。

3.1.2 凝膠柱層析法

凝膠柱層析又稱分子篩層析，可根據(jù)多糖的形狀與分子量大小將其分離，常以聚糖為固定相，無機(jī)鹽溶液為洗脫液，待洗脫液平衡[17]，再加入樣品，物質(zhì)按分子量從大到小的順序出柱，得到分子量均勻的小分子多糖[18]。王海燕等[3]將用蒸餾水洗脫的、經(jīng)陰離子交換層析的黑松露多糖干品命名為TP1，其在葡聚糖凝膠柱層析后多糖含量高達(dá)91.51%，且該分子量多糖之前未見報(bào)道，突出該方法純化能力和效率較高的特點(diǎn)。雖然可通過選擇不同長度的層析柱進(jìn)行分辨率的調(diào)整，但不適宜在分離黏多糖或樣品量多的情況下使用[19]。

3.1.3 季銨鹽沉淀法

長鏈季銨鹽作為陽離子清潔劑或堿性表面活性劑，可與溶于水中的酸性多糖的陰離子結(jié)合，將其沉淀分離[20]。將粗多糖配制成pH 適宜的溶液，加入季銨鹽溶液，收集離心或靜置沉降后產(chǎn)生的沉淀，經(jīng)反復(fù)溶解與沉淀后用乙醇多次洗滌，可得到較純凈的多糖產(chǎn)物[2]。正負(fù)電荷的結(jié)合使該方法局限于酸性多糖的純化，且溶液中帶負(fù)電的蛋白質(zhì)會(huì)產(chǎn)生影響，導(dǎo)致純化效果不理想[20]。國琦等[4]證明，多糖經(jīng)過前處理，蛋白質(zhì)基本除去，他們同時(shí)應(yīng)用了Sevag法和透析法，最終蛋白質(zhì)含量僅為2.23%，成為可應(yīng)用于黑松露純化的有力證據(jù)。

3.2 新型純化方法

3.2.1 微濾法

微濾即為microfiltration。微孔濾膜的物理結(jié)構(gòu)起主要作用，可將小分子與少數(shù)大分子透過，而把漂浮顆粒物、細(xì)菌和病毒等截留在膜外[21]，既能單獨(dú)使用，也能作為與其他膜技術(shù)連用的第一步。該技術(shù)的原理是篩分，推動(dòng)力則是壓力差，全量過濾即將濾膜置于溶液的下方，但經(jīng)過一定的時(shí)間后膜通量下降，需更換或清洗膜表面。交叉流過濾進(jìn)一步發(fā)展，溶液平行流動(dòng)，減少了污染層，使過濾速度保持在較高的水平。黑松露作為一種食用菌，其提取液中常含有木質(zhì)素、菌絲等小微米級的固體懸浮物以及尚未除去的某些蛋白質(zhì)，利用該方法可以有效除去這些雜質(zhì)而不會(huì)造成多糖含量的損失，可有效提高多糖的產(chǎn)率。

3.2.2 超濾法

粗提液流經(jīng)超濾膜表面，以分子量截留值為界，分子量較小的溶質(zhì)通過此膜，稱為透過液，其余部分則為截留液，這個(gè)方法便是超濾法[22]。超濾膜是非對稱性孔膜，分為活化層和多空層，優(yōu)秀的篩分作用較醇沉法而言，能更好地保留所需成分，加之操作簡便、條件溫和，一度成為研究熱點(diǎn)并加以廣泛應(yīng)用。影響超濾效率的因素較多，如溫度、壓力、pH等[23]，應(yīng)用在多糖純化中，常通過正交實(shí)驗(yàn)確定最優(yōu)條件。魏鑫悅在對攀枝花黑松露多糖的研究中測得黑松露多糖的分子量為1.29×104[5]，可選擇適當(dāng)大小的超濾膜對其截留而更好地保留有效成分。

3.2.3 無機(jī)陶瓷膜法

無機(jī)陶瓷膜作為無機(jī)材料，主要除去一些大分子物質(zhì)，擁有耐高溫、性質(zhì)穩(wěn)定、可反復(fù)清洗使用等聚合分離膜所沒有的優(yōu)點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)過程中通常使用無機(jī)陶瓷膜設(shè)備，以壓力驅(qū)動(dòng)錯(cuò)流過濾，截留液隨循環(huán)濃度不斷增大，具有純化的作用[24]。與此同時(shí)，膜的通量也不斷下降，甚至?xí)Ξa(chǎn)品的收率有所影響，可采用不同的清洗方法使其更快地恢復(fù)，延長使用壽命。該方法是對黑松露等蕈類菌種純化較為先進(jìn)的方法，具有提純產(chǎn)率高的特點(diǎn)。

3.2.4 磁性復(fù)合膜法

Fe3O4-PSF 是一種受外加磁場影響后，可改變膜孔徑的新型磁性復(fù)合膜[25]，相對于分子量截留值不變的膜來說，能夠連續(xù)分離分子量不同的物質(zhì)。實(shí)驗(yàn)過程中，改變磁場強(qiáng)度，調(diào)整截留分子質(zhì)量，可獲得不同的透過液，實(shí)現(xiàn)多糖的分級純化[26]。由于制備該磁性復(fù)合膜時(shí)會(huì)出現(xiàn)一定差異，使用前應(yīng)先測定不同強(qiáng)度下的截留率，避免濾過速度過慢或因磁場強(qiáng)度過大導(dǎo)致膜破損。在黑松露單糖組成的分析中，該方法具有廣闊的應(yīng)用前景。

4 展望

黑松露多糖作為黑松露發(fā)揮作用的主要成分，其生理功效毋庸置疑，但因黑松露本身生長條件苛刻、價(jià)格昂貴，加之實(shí)驗(yàn)操作困難，目前系統(tǒng)性的提取純化工藝尚未形成，這對相關(guān)藥物開發(fā)及中成藥的研制造成了一定阻礙。

對于一種生物類藥物或食品的研究，一些常用的多糖提取方法，如利用水或乙醇等有機(jī)試劑提取可以對其起到分離純化的作用，但對于黑松露這種昂貴且極其珍貴的物種，一些極大地提高其提純率的新型提取方法亟待深入研究。隨著科技不斷發(fā)展，越來越多新型方法在設(shè)備更新?lián)Q代的基礎(chǔ)上不斷涌現(xiàn)，為提取純化工藝提供了新的思路與方向。在今后的研究中，一條完整的、最優(yōu)的黑松露多糖提取工藝亟待構(gòu)建，并將規(guī)模化應(yīng)用于黑松露多糖的工業(yè)生產(chǎn)之中。