基于Tb-OBBA-Hemin納米酶測定人血清中左氧氟沙星含量

葉 強(qiáng)

(自貢市輕工業(yè)設(shè)計研究院，四川 自貢 643000)

左氧氟沙星是一種喹諾酮類藥物，具有廣譜的抗菌作用[1]。對大多數(shù)腸桿菌科細(xì)菌，如沙門菌屬、變形桿菌屬、志賀菌屬等革蘭陰性菌有較強(qiáng)的抗菌活性，在臨床上有著廣泛的應(yīng)用。一般而言，靜脈注射后，可在24 h內(nèi)排泄完全，口服后，在12 h內(nèi)可排泄完全。但對于腎病綜合征以及腎功能不全的患者，由于不能及時排泄，持續(xù)常規(guī)劑量給藥會造成嚴(yán)重的不良反應(yīng)，因此，準(zhǔn)確監(jiān)測此類患者體內(nèi)的血藥濃度，就顯得尤為重要。

左氧氟沙星的主要檢測方法有高效液相色譜法[2]、紫外-可見分光光度法[3]、拉曼光譜法[4]、分子熒光法[5]等。其中高效液相色譜法是最為常用的方法，但存在前處理復(fù)雜，分析時間長等缺點。傳統(tǒng)的紫外-可見分光光度法靈敏度較低，一般用于檢測注射液或滴眼液等高濃度左氧氟沙星，SERS(表面增強(qiáng)拉曼光譜)需要使用特定的增強(qiáng)劑，且儀器價格昂貴，不能滿足對血液中左氧氟沙星濃度進(jìn)行快速、準(zhǔn)確分析的需求.

納米酶是具有酶樣特性的納米材料，與天然酶相比，納米酶具有催化活性高、成本低廉、易于生產(chǎn)和穩(wěn)定性可靠等優(yōu)點。基于人工納米酶的以上優(yōu)點，我們設(shè)計出通過Tb-OBBA-Hemin檢測血液中左氧氟沙星的新方法。檢測體系由Tb-OBBA-Hemin、過氧化氫、TMB組成，當(dāng)樣本中不含有左氧氟沙星時，自身的擬過氧化物酶活性較弱，催化過氧化氫將TMB氧化為ox-TMB的能力較弱，因此體系呈淺藍(lán)色。當(dāng)樣本中含有左氧氟沙星時，左氧氟沙星能顯著提高Tb-OBBA-Hemin的擬過氧化物酶活性，在一定范圍內(nèi)，左氧氟沙星濃度越高，酶活提高越明顯。因此，當(dāng)TMB、過氧化氫、Tb-OBBA-Hemin的濃度相同時，吸光度大小與左氧氟沙星含量成正比。按照實驗方法測定了3個人血清樣本中左氧氟沙星，結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確度令人滿意。檢驗結(jié)果可以滿足臨床用藥指導(dǎo)的需求。

1 實 驗

1.1 主要試劑

4，4’-二苯醚二甲酸(簡稱OBBA，0.1 mol/L，稱取1.29 g 4,4’-二苯醚二甲酸于50 mL DMFO中)；氯化血紅素(簡稱Hemin，0.1 mol/L，稱取3.255 g氯化血紅素于50 mL DMFO中)；硝酸鋱(0.1 mol/L，稱取2.085 g硝酸鋱四水合物于50 mL水中)；3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺(簡稱TMB，5 mmol/L，稱取0.28 g 3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺溶于50 mL無水乙醇中，超聲中放置5 min，促進(jìn)溶解)；過氧化氫(50 mmol/L，吸取0.1 mL 30%過氧化氫，加20 mL水，搖勻，冰箱內(nèi)保存)；左氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000μg/mL，取0.100 0 g鹽酸左氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)對照品，溶于水中，轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻)；左氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 μg/mL，吸取10.00 mL 1 000 μg/mL左氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液，轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻)；左氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液(10 μg/mL，吸取10.00 mL 100 μg/mL左氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液，轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻)。

1.2 儀 器

TU-1901紫外-可見分光光度計，北京普析通用儀器公司；101型鼓風(fēng)干燥箱，北京永光明儀器設(shè)備公司；L420實驗室離心機(jī)，長沙湘儀實驗室儀器公司。

1.3 Tb-OBBA-Hemin的制備

吸取1 mL硝酸鋱于水熱釜中，加入2 mL OBBA，0.5 mL Hemin，7 mL DMSO，磁力攪拌20 min，放入烘箱中，135 ℃反應(yīng)5 h，取出，離心分離，棄去上層清液，用100 mL無水乙醇分三次洗滌沉淀，低溫烘干備用。稱取25 mg干燥后的Tb-OBBA-Hemin，分散在10 mL水中。

1.4 血清中左氧氟沙星的測定

用校準(zhǔn)后的移液槍吸取50 μL血清樣品于1.5 mL EP管中，加入0.45 mL甲醇，劇烈震蕩30 s，用桌面離心機(jī)離心1 min，備用。吸取200 μL試液于5 mL比色管中，在沸水浴上蒸干甲醇，加入1 mL水，100 μL Tb-OBBA-Hemin，放置1 min，加入50 μL 50 mM過氧化氫，100 μL 5 mM TMB，10 min后再654 nm處，以水為參比，測定吸光度，并從工作曲線上查出樣品溶液中左氧氟沙星濃度。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別吸取0、10、25、50、100、200、500 μL 10 μg/mL左氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液于5 mL比色管中，加水至1 mL，其余同樣品測定。

1.5 結(jié)果計算

式中：c左氧氟沙星為血清中左氧氟沙星濃度，μg/mL；V為試樣溶液總體積，mL；V0為試樣溶液中含有血清的體積，mL。

2 結(jié)果與討論

2.1 Tb-OBBA-Hemin的制備

Tb-OBBA-Hemin是一種人工合成的納米材料，具有擬過氧化物酶活性。Tb作為中心原子，通過調(diào)節(jié)OBBA和Hemin的用量，可以調(diào)節(jié)其過氧化物酶活性。制備幾種不同OBBA和Hemin用量的Tb-OBBA-Hemin，分別測定其擬過氧化物酶活性，結(jié)果如圖1所示，當(dāng)增加OBBA用量，體系吸光度降低，當(dāng)增加Hemin的用量時，體系吸光度增加。說明改變Hemin用量，對擬過氧化物酶活性具有調(diào)控作用。

圖1 OBBA與Hemin用量與過氧化物酶活性的關(guān)系Fig.1 Relationship between OBBA and Hemin dosage and peroxidase activity

擬過氧化物酶活性較強(qiáng)時，空白吸光度較高，不利于測定的進(jìn)行，因此我們選用Hemin與OBBA的用量為0.5 mL和2 mL。

2.2 血清的處理

血清中含有的蛋白質(zhì)不僅使試液變得渾濁，還會阻礙TMB的氧化，最終導(dǎo)致測試的失敗，因此血清中的蛋白質(zhì)必須要予以除去。常見的除蛋白方式有三氯乙酸沉淀法、硫酸鋅-氫氧化鋇沉淀法、有機(jī)溶劑沉淀法等。三氯乙酸具有強(qiáng)烈的腐蝕性，且處理完后需要進(jìn)行中和。硫酸鋅-氫氧化鋇沉淀法是衛(wèi)生部血糖測定的推薦前處理方法，脫除蛋白徹底，但是操作極其繁瑣，耗時較長，不能滿足快速測定的需要。有機(jī)溶劑沉淀法具有操作簡便、血清用量少、蛋白脫除率高等優(yōu)點。因此，我們選用有機(jī)溶劑沉淀法脫除蛋白質(zhì)。為考察不同有機(jī)溶劑脫除蛋白質(zhì)的效果，使用左氧氟沙星濃度為20 μg/mL的人工配制血清，分別采用乙醇、甲醇、乙腈、丙酮處理，然后測定左氧氟沙星濃度，結(jié)果如表1所示。

表1 不同溶劑處理血清樣本的效果Table 1 Effect of different solvents in treating serum samples

乙醇處理后的樣品，顯色后溶液呈紅色，證明蛋白質(zhì)沒有除干凈，不能采用。甲醇處理后的樣品，測定結(jié)果偏低，不能滿足要求。丙酮和乙腈處理后血清樣品，測定值與配制值誤差很小，均可使用，但丙酮易揮發(fā)，后續(xù)處理方便，因此，我們采用丙酮處理血清樣品。

2.3 底物的選擇

底物的選擇，直接關(guān)系到檢測體系的靈敏度與穩(wěn)定性，在5 mL比色管中，分別加入100 μL Tb-OBBA-Hemin，稀釋到1 mL，加入100 μL 0.01 mg/mL的左氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液，放置1 min，分別加入100 μL 5 mM ABTS、TMB、OPD，50 μL 50 mM過氧化氫，10 min后測定體系400～800 nm的吸收光譜。如圖2所示，三種底物均能在Tb-OBBA-Hemin的催化下被過氧化氫氧化，ABTS的吸光度最低，靈敏度較差。OPD易氧化變質(zhì)，需要現(xiàn)用現(xiàn)配，且靈敏度沒有TMB高。TMB在相同條件下具有最高的吸光度，性質(zhì)穩(wěn)定，可以長期存放。因此，底物我們確定為TMB。

圖2 不同底物的吸收光譜Fig.2 Absorption spectra of different substrates

圖3 共存物對檢測體系的影響Fig.3 Effect of co-existing substances on the detection system

2.4 共存物干擾及消除

2.5 樣品分析

根據(jù)上述優(yōu)化得到的實驗條件，繪制工作曲線，并對自貢市第一人民醫(yī)院的三名志愿者的血清樣品分別平行測定8次。結(jié)果表明，通過上述方法繪制的工作曲線線性良好(如圖4所示)，測定結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，n=8)分別為：2.31%、3.87%、2.93%。

圖4 左氧氟沙星線性關(guān)系Fig.4 Linear relationship of levofloxacin

為驗證方法的準(zhǔn)確性，我們在兩份樣品中分別加入不同濃度的左氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后進(jìn)行測定加標(biāo)回收率，實驗數(shù)據(jù)如表2所示。

表2 人血清樣本加標(biāo)回收率Table 2 Human serum sample spiked recovery

3 結(jié) 論

血清樣品經(jīng)過脫蛋白處理后，用Tb-OBBA-Hemin分光光度法測定其中的左氧氟沙星含量，方法簡便易行，血清中其他共存物質(zhì)對左氧氟沙星的測定沒有干擾。對實際樣品進(jìn)行測定，測定結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在2.31%～3.87%之間，樣品加標(biāo)回收率在93.6%～101.9%之間，方法精密度和準(zhǔn)確度能夠滿足臨床患者的用藥指導(dǎo)要求，可應(yīng)用于實際臨床樣本的產(chǎn)生。