高效液相色譜法測定羅望子膠的單糖組成

王寶群，趙曉琳，林莎莎，鄒圣燦，劉桂亭

(青島琛藍海洋生物工程有限公司，山東 青島 266100)

羅望子多糖膠是一種從豆科羅望子屬植物羅望子(又稱酸角)的種子胚乳中提取分離出來的中性聚多糖，主要由葡萄糖、木糖和半乳糖三種單糖組成[1-3]。作為一種植物來源的多糖，其具有來源廣泛、價格低廉、安全無毒等優點，所以被廣泛使用。目前，羅望子多糖膠已被廣泛使用于食品行業，主要用作冰淇淋增稠劑、飲料懸浮劑、淀粉品質改良劑、果凍和糕點膠凝劑等。此外，其在醫藥、保健、紡織等行業的應用也被廣泛關注[4-7]。

高效液相色譜法(HPLC)作為一種高效準確的檢測方法，已被廣泛應用于分析多糖中單糖組成和含量[8-12]。但是由于單糖組分的光學性質普遍較差，所以常常需要用具有強紫外吸收的PMP試劑對單糖物質進行衍生后再進行檢測，從而提高HPLC法的靈敏度[13]。PMP柱前衍生化高效液相色譜法具有靈敏度高、穩定性好、重復性好、數據準確、設備操作簡便等優點[14-15]，因此采用該方法分析羅望子多糖膠中葡萄糖、木糖和半乳糖三種單糖組分的比例。此外，多糖水解采用的酸化試劑通常為三氟乙酸，但是三氟乙酸屬于弱酸，水解能力較弱，有時會造成水解不徹底的現象，所以采用強酸硫酸作為酸化試劑，以確保多糖能夠充分水解。綜上，采用硫酸水解-PMP柱前衍生化高效液相色譜法檢測羅望子多糖膠的單糖組分含量，為其準確檢測提供方法和依據。

1 實 驗

1.1 儀器與試劑

LC-20AT型液相色譜儀、SPD-M20A 230V型光電二極管陣列紫外可見光檢測器，安捷倫有限公司；色譜柱(Diamonsil-plus C18-A*)，北京迪馬科技有限公司；101-1A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海滬越明科技儀器有限公司；AR224CN型電子天平，奧豪斯儀器(常州)有限公司；Master-E plus UF型實驗室純水系統，上海和泰儀器有限公司；DK-98-ⅡA型電熱恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；XW-80A型旋渦振蕩器，上海滬西分析儀器廠有限公司；PHS-3E型pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司。

羅望子多糖膠，安徽舒俊生物科技有限公司；D-葡萄糖、D-木糖和D-半乳糖標準品，上海源葉生物科技有限公司；PMP，麥克林生物科技有限公司；硫酸、鹽酸、磷酸、氫氧化鈉、甲醇、二氯甲烷、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉，國藥集團化學試劑有限公司；乙腈，賽孚瑞科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 磷酸鹽緩沖液配制

配制50 mmol/L磷酸二氫鉀和50 mmol/L磷酸氫二鈉溶液，將兩者按體積比1∶1混合，然后用2 mol/L NaOH調節pH至6.8。

1.2.2 羅望子多糖膠樣品水解

稱取10 mg羅望子多糖膠樣品于頂空瓶中，加入1 mol/L H2SO4溶液2 mL，密封后放置于100 ℃烘箱酸解6 h。取出后冷卻，開封。向溶液加入2 mol/L NaOH溶液2 mL，渦旋振蕩器混勻。將溶液過0.22 μm濾膜。

1.2.3 標準品溶液配制

分別稱取葡萄糖標準品27 mg、木糖標準品29 mg和半乳糖標準品33 mg，放置于同一250 mL容量瓶中，用水定容后將溶液混勻。

1.2.4 衍生

取0.3 mL待測溶液于10 mL離心管中，加入0.3 mL 0.5 mol/L PMP-甲醇溶液，加入0.3 mol/L NaOH溶液0.5 mL。將溶液用渦旋振蕩器混勻后，在70 ℃水浴衍生30 min。冷卻，加入0.3 mol/L鹽酸0.3 mL進行中和。然后用二氯甲烷萃取多余衍生劑，每次1 mL，重復3次，直至二氯甲烷層無色。上清液過0.22 μm濾膜后置于色譜瓶中。

1.2.5 色譜條件

色譜柱為Diamonsil-plus C18-A*型(4.6 mm×50 mm，5 μm)，流動相為50 mM磷酸鹽緩沖液(pH6.8)∶乙腈=82∶18的混合溶液，進行等度洗脫。檢測波長為245 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫為35 ℃，采集時間為45 min。

1.2.6 進樣檢測

將樣品溶液進樣體積設置為5.0 μL，標準溶液進樣體積依次設置為0.3、0.5、1.0、3.0和5.0 μL，進行HPLC測定，記錄峰面積。按標準曲線法計算樣品中三種單糖葡萄糖、木糖和半乳糖的含量。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 流動相比例的確定

選定50 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)-乙腈流動相體系，調節流動相中乙腈比例分別為16%、17%、18%、19%和20%。結果如圖1所示，隨著流動相中乙腈比例的降低，各色譜峰間的分離度有所提高，但是當乙腈比例過低時，各色譜峰的保留時間較長。從色譜峰的分離度及保留時間兩個方面綜合考慮，確定流動相條件為50 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)∶乙腈的比例為82∶18。

圖1 流動相中乙腈比例對各單糖分離效果的影響Fig.1 Effect of acetonitrile ratio of mobile phaseon the separation of monosaccharides

2.1.2 流動相pH的確定

選定50 mmol/L磷酸鹽緩沖液：乙腈比例為82∶18的流動相體系，調節磷酸鹽緩沖液的pH分別為6.4、6.6、6.8、7.0和7.2。結果如圖2所示，隨著磷酸鹽緩沖液pH的降低，各色譜峰間的分離度逐漸提高，各色譜峰的保留時間延長。綜合分析色譜峰的分離度及保留時間，確定50 mmol/L磷酸鹽緩沖液的pH為6.8。

圖2 流動相pH值對各單糖分離效果的影響Fig.2 Effect of pH value of mobile phase on the separation of monosaccharides

2.1.3 柱溫的確定

調節柱溫分別為25、30、35、40和45 ℃。結果如圖3所示，隨著柱溫升高，色譜峰的保留時間逐漸縮短。但當柱溫過高時，色譜峰的分離度呈下降趨勢。結合色譜峰的分離度及保留時間兩因素考慮，確定柱溫為35 ℃。

圖3 柱溫對各單糖分離效果的影響Fig.3 Effect of column temperature on separation of monosaccharides

2.2 樣品檢測

選取三批相同來源的羅望子多糖膠樣品進行檢測，色譜譜圖如圖4所示。對檢測數據采用標準曲線法進行計算計算，確定各檢測樣品中三種單糖葡萄糖、木糖和半乳糖的組成，結果如表1所示。結果表明，羅望子多糖膠樣品中含有葡萄糖、木糖和半乳糖三種單糖，葡萄糖含量最高，木糖次之，半乳糖含量最低，三者的所占比例分別為52.05%、20.03%和12.17%。

表1 羅望子多糖膠中三種單糖的含量Table 1 Contents of three monosaccharides in tamarind polysaccharide gum

圖4 羅望子多糖膠的色譜圖Fig.4 Chromatogram of tamarind polysaccharide gum

2.3 色譜方法學驗證

2.3.1 線性關系和檢出限

將標準品溶液衍生化，進樣體積分別設置為0.1、0.2、0.3、0.5、1、3、5、10和15 μL，上機進行檢測，記錄各色譜峰的峰面積。在進行數據處理時，以各單糖標準品的峰面積為縱坐標(y)，質量濃度為橫坐標(x)，繪制線性回歸曲線。采用信噪比S/N=3的公式計算檢測限，結果如表2所示。結果表明，三種單糖的相關系數在0.999 2～0.999 9之間，檢出限在0.004 3～0.005 6 mg/L之間，說明三種單糖在線性范圍內具有良好的線性關系，并且儀器具有較高的靈敏度。

表2 三種單糖的標準曲線方程、相關系數、線性范圍和檢出限Table 2 Standard curve equations，correlation coefficients，linear rangesand detection limits of the three monosaccharides

2.3.2 精密度

取同一標準品溶液進行上機測定，連續測定6次，計算各單糖色譜峰RSD值。數據表明，三種單糖葡萄糖、木糖和半乳糖的峰面積RSD值分別為0.64%、0.85%和0.62%，說明儀器精密度良好。

2.3.3 穩定性

取同一樣品待測液，分別在制備后0、3、6、9、12、24 h上機進行測定，計算各單糖色譜峰RSD值。數據表明，三種單糖葡萄糖、木糖和半乳糖的峰面積RSD值分別為1.22%、1.06%和0.96%，說明樣品待測液在24 h內具有良好的穩定性。

2.3.4 加樣回收率

取已知含量的羅望子多糖膠樣品水解液于具塞試管中，準確加入一定量葡萄糖、木糖和半乳糖標準品，進行衍生，平行制備6份，制得的待測液上機檢測。根據公式回收率=(加標試樣測定值-試樣測定值)/ 加標量×100%，計算加樣回收率，結果如表3所示。結果表明，三種單糖葡萄糖、木糖和半乳糖的加樣回收率在100.33%～101.34%之間，RSD 值小于2.0%，說明該分析方法準確度良好。

表3 三種單糖的加樣回收率Table 3 Recovery rates of three monosaccharides

3 結 論

本研究建立 PMP柱前衍生化高效液相色譜法，同時檢測羅望子多糖膠中三種單糖葡萄糖、木糖和半乳糖的組成比例。以羅望子多糖膠為原料，經硫酸水解、PMP衍生化后進行單糖組成測定。結果表明樣品中同時含有葡萄糖、木糖和半乳糖三種單糖，組成分別為52.05%、20.03%和12.17%。實驗表明，該方法具有較高的靈敏度和準確度，結果穩定可靠，可滿足羅望子多糖膠中單糖組成分析和含量測定的要求，可為羅望子多糖膠的質量控制提供分析方法和科學依據。