7種訶子多酚透皮吸收試驗研究*

楊旭婷，郝 季，張浩穎，張玉霞，李 琪，王 巍

(遼寧中醫藥大學 藥學院，遼寧 大連 116600)

中藥訶子為使君子科植物訶子TerminaliachebulaRetz.或絨毛訶子T.chebulaRetz.var.tomentellaKurt.的干燥成熟果實，其味苦、酸、澀，性平，歸肺、大腸經，具有澀腸止瀉、斂肺止咳的功效。訶子在蒙藥和藏藥中應用極為廣泛，被稱之為“眾藥之王”。在我國衛生部公布的114種可用于保健食品的原料中訶子的抗氧化活性高居第一[1]。文獻研究報道，訶子含有豐富的植物多酚，其總多酚含量可達320.5 mg/g，是其抗氧化活性的物質基礎[2]。不同化學成分由于結構、分子量和脂溶性等多種因素的影響，通常具有不同的透皮性能，使用透皮吸收促進劑可以減低皮膚屏障，改善透皮效果[3]。

本研究探討訶子中7種多酚類成分透皮吸收性能，研究不同質量濃度的透皮吸收促進劑(氮酮、丙二醇)對訶子中7種多酚類成分的體外透皮吸收的促進效果，為研究訶子外用制劑及具有抗氧化性能的護膚品開發奠定基礎。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

SD大鼠，12只，體質量為(250±20)g，購自遼寧長生生物技術有限公司。大鼠飼養于(25±2)℃、相對濕度55%±10%的環境內，期間自由進食、飲水，適應性喂養7天。

1.2 實驗藥材

訶子藥材購自河北安國藥材市場，產地為云南，經遼寧中醫藥大學藥學院宋慧鵬副教授鑒定為使君子科植物訶子T.chebulaRetz.的干燥成熟果實。

1.3 主要試劑

訶子次酸、鞣花酸、沒食子酸購自成都曼思特生物科技有限公司(批號MUST-22112801、MUST-14031010、MUST-13040103)，安石榴苷對照品購自大連美侖生物技術有限公司(批號J0201AS)，柯里拉京、訶子酸、訶黎勒酸購自成都普瑞法科技開發有限公司，(批號PRF9101742、PRF8071201、PRF8112302)，所有對照品純度均大于98%；氮酮、丙二醇購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司(批號K2203035、I2226367)；乙醇為分析純，乙腈、甲醇、甲酸均為色譜純，購自天津科密歐化學試劑有限公司；水為超純水。

1.4 主要儀器及設備

LC-16高效液相色譜儀，島津儀器(蘇州)有限公司；TP-6型智能透皮實驗儀，天津市鑫洲科技有限公司；YQD-6B型氮吹儀，上海亭山儀表廠；FA1004B型分析天平，上海精密科學儀器有限公司；410HTD數碼超聲波清洗機，深圳市潔拓超聲波清洗設備有限公司；DZKW-S-4型電熱恒溫水浴鍋，北京市永光明醫療儀器有限公司。

2 方法與結果

2.1 上樣液的制備

取訶子藥材，砸取果肉，粉碎(過65目篩)，取30.00 g，置具塞三角瓶中，加入60%乙醇420 mL，超聲提取(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，過濾，濾液濃縮并定容制250 mL作為上樣液，備用。取該上樣液，分別按1%、3%、5%加入氮酮、丙二醇，混合均勻，作為含透皮吸收促進劑的上樣液。

2.2 離體鼠皮的制備

將SD大鼠以20%烏拉坦麻醉，以8%Na2S溶液涂布腹部皮膚，去毛，12 h后處死，剪取腹部去毛皮膚，剔除皮下脂肪及黏膜，以生理鹽水沖洗至皮膚洗液不再白色渾濁，置于生理鹽水中浸泡約30 min，取出，用濾紙吸干表面，錫箔紙包好置于冰箱-20 ℃保存，備用。

2.3 體外透皮吸收實驗

取制備好的離體大鼠皮膚，自然解凍，檢視皮膚是否完整。將其自然固定在改良的Franz擴散池(有效透皮面積0.65 cm2，接收液體積5 mL)的擴散界面上，皮膚角質層朝上固定于供藥池與接收池之間，接收池加入30%乙醇生理鹽水作為接受液，使接收液與皮膚內表面充分接觸。水浴循環(37.0±0.2)℃，待溫度恒定后，供藥池加入2.0 mL上樣液，200 r/min恒速攪拌。分別在1、2、4、6、8、10、12、24 h取1.0 mL接收液，同時補充同溫度等體積接受液并排除氣泡。接收液吹干后，加入50%甲醇200 μL復溶，離心(12 000 r/min)4 min，取上清，采用HPLC法測定訶子次酸、沒食子酸、安石榴苷、柯里拉京、訶黎勒酸、鞣花酸、訶子酸含量，按公式(1)計算單位面積的藥物累積透過量(Q)。

Q=(V×Cn+∑VS×Cn-1)/A

(1)

式中：Q為單位面積的藥物累積透過量；A為有效透皮吸收面積；V為接收室體積；Vs為取樣體積；Cn為第n個取樣點測得的接收液中藥物質量濃度；Cn-1為第n-1個取樣點測得的接收液中藥物質量濃度。以各時間點Q為縱坐標，時間t為橫坐標作圖，進行線性回歸，得到Q-t方程，求出穩態透皮速率J。

王蒙：一切被推崇、提倡、珍愛的東西，都是禍害之源、爭奪之根、虛偽之由，占有與竊取的教唆者，是一切罪惡的源頭。

2.4 高效液相法測定透皮接收液中7種訶子多酚的含量

2.4.1 色譜條件

色譜柱：Dikma Platisil色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相水-甲醇-甲酸95∶5∶0.1(A)：乙腈(B)，采用梯度洗脫，洗脫程序為0～8 min，0%B；8～10 min，0%～3%B；10～15 min，3%～5%B；15～28 min，5%B；28～38 min，5%～10%B；38～75 min，10%B；75～77 min，10～17%B；77～115 min，17%B；進樣量5 μL；流速1 mL/min；柱溫25 ℃；檢測波長270 nm。

2.4.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取訶子次酸、沒食子酸、安石榴苷、柯里拉京、訶黎勒酸、鞣花酸、訶子酸、對照品適量，置于10 mL容量瓶，加入50%甲醇定容制得相應對照品溶液。吸取上述各對照品溶液適量，混合，制得每1 mL含訶子次酸181.0 μg、沒食子酸157.0 μg、安石榴苷267.5 μg、柯里拉京905.0 μg、訶黎勒酸188.0 μg、鞣花酸31.35 μg、訶子酸28.60 μg的混合對照品溶液。

2.4.3 供試品溶液的制備

于不同時間點從接收池中精密吸取透皮吸收接收液1 mL，置氮吹儀吹干后，加入50%甲醇200 μL，渦旋使復溶，離心(12 000 r/min)4 min，取上清，即得。

2.4.4 專屬性

圖1 專屬性色譜圖Fig.1 Exclusive chromatogram

2.4.5 線性關系考察

精密吸取“2.4.2”項下的混合對照品溶液，稀釋成系列梯度濃度的混合對照品溶液，在“2.4.1”色譜條件下進樣，以質量濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)，繪制各成分的標準曲線，并得到回歸方程。結果見表1。

表1 7種多酚的回歸方程及線性范圍Table 1 Regression equations and linear ranges for 7 polyphenols

2.4.6 精密度試驗

精密吸取24 h的透皮吸接收液，按“2.4.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.4.1”項下色譜條件連續進樣6次，記錄峰面積，計算7種多酚成分色譜峰峰面積的RSD為1.16%～1.60%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.4.7 穩定性試驗

精密吸取“2.4.6”項下的供試品溶液，分別在制備后的0、2、4、6、8、12、24 h按“2.4.1”項下色譜條件進樣，記錄峰面積。計算7種多酚成分色譜峰峰面積的RSD為0.48%～1.84%(n=6)，表明溶液在24 h內穩定性良好。

2.4.8 重復性試驗

取“2.1”項下上樣液6份，分別按“2.3”項下方法進行透皮吸收實驗，再按“2.4.3”項下方法取24 h透皮吸收接收液制備供試品溶液，按“2.4.1”項下色譜條件進樣，記錄峰面積。計算7種多酚成分色譜峰峰面積的RSD為1.27%～1.86%(n=6)，表明方法重復性良好。

2.4.9 加樣回收率試驗

取已知7種多酚含量的透皮吸收接收液(24 h)，再按照1∶1分別精密加入7種多酚的對照品，按“2.4.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.4.1”色譜條件下進樣，記錄色譜圖，計算各成分的加樣回收率。結果顯示，訶子次酸、沒食子酸、安石榴苷、柯里拉京、訶黎勒酸、鞣花酸、訶子酸的加樣回收率為97.93%～104.5%，RSD為0.32～1.96%(n=6)。

2.6 透皮促進劑對7種訶子多酚透皮吸收速率的影響

按“2.1”項下方法制備含1%氮酮、3%氮酮、5%氮酮、1%丙二醇、3%丙二醇和5%丙二醇的上樣液，經“2.3”項下方法進行透皮吸收實驗，按“2.4.3”項下方法制備不同時間點的供試品溶液，并按“2.4.1”項下方法檢測，計算不同時間段單位面積累積透皮吸收量(Q)，以Q對不同時間(t)作圖，進行線性回歸，根據Q-t方程，求出穩態透皮速率J及促滲倍數ER。結果表明，1%丙二醇能有效促進訶子次酸及沒食子酸的滲透，3%、5%丙二醇均能有效促進鞣花酸的滲透。除3%、5%氮酮組外，兩種透皮促進劑各濃度的不同藥物累積透過量Q與時間t均呈良好的線性關系R2均大于0.83，除訶子酸外3%、5%氮酮不同藥物累積透過量Q與時間t均呈良好的線性關系R2均大于0.79；不同透皮吸收促進劑對訶子次酸的促進透皮效果依次為1%丙二醇>5%丙二醇>3%丙二醇>5%氮酮>未加透皮吸收促進劑>1%氮酮>3%氮酮，對沒食子酸的促進透皮結果依次為未加透皮吸收促進劑>1%丙二醇>3%丙二醇>5%丙二醇>1%氮酮>3%氮酮>5%氮酮，對安石榴苷的促進透皮結果依次為未加透皮吸收促進劑>1%丙二醇>5%丙二醇>3%丙二醇>3%氮酮>1%氮酮>5%氮酮，對柯里拉京的促進透皮效果依次為1%丙二醇>3%丙二醇>5%丙二醇>未加透皮吸收促進劑>3%氮酮>1%氮酮>5%氮酮，對訶黎勒酸的促進透皮結果依次為未加透皮吸收促進劑>5%丙二醇>1%丙二醇>3%丙二醇>3%氮酮>1%氮酮>5%氮酮，對鞣花酸的促進透皮結果依次為未加透皮吸收促進劑>5%丙二醇>3%丙二醇>1%丙二醇>1%氮酮>3%氮酮>5%氮酮，對訶子酸的促進透皮效果依次為1%丙二醇>3%丙二醇>5%丙二醇>1%氮酮>3%氮酮>未加透皮吸收促進劑>5%氮酮。見圖2，表3。

表3 7種訶子多酚的滲透動力學參數(n=3)Table 3 Permeation kinetic parameters of 7 polyphenols in polyphenols (n=3)

圖2 不同質量濃度透皮促進劑對7種訶子多酚的Q-t圖Fig.2 Q-t diagram of 7 phenolic acid components of transdermal accelerator with different mass concentrations of transdermal accelerator

使用OriginPro 9.8軟件對訶子次酸、沒食子酸、安石榴苷、柯里拉京、訶黎勒酸、鞣花酸、訶子酸累計透皮量進行零級動力學模型、一級動力學模型與Higuchi模型擬合。結果表明，未加透皮吸收促進劑組訶子次酸、沒食子酸和訶子酸的經皮滲透更符合一級動力學方程和Higuchi方程；安石榴苷、柯里拉京、訶黎勒酸、鞣花酸的經皮滲透更符合零級動力學方程、一級動力學方程。1%、3%丙二醇組訶子次酸、沒食子酸和鞣花酸的經皮滲透更符合一級動力學方程和Higuchi方程，其他透皮吸收促進劑組更符合零級動力學方程、一級動力學方程；3%丙二醇組安石榴苷、柯里拉京的經皮滲透更符合一級動力學方程和Higuchi方程，其他透皮吸收促進劑組的經皮滲透更符合零級動力學方程、一級動力學方程；1%氮酮和3%氮酮組訶黎勒酸經皮滲透更符合零級動力學方程和一級動力學方程，5%氮酮、3%丙二醇和5%丙二醇組更符合零級動力學方程和Higuchi方程，1%丙二醇組符合一級動力學方程和Higuchi方程；5%氮酮和1%丙二醇組訶子酸的經皮滲透更符合零級動力學方程和Higuchi方程，3%氮酮和3%丙二醇更符合一級動力學方程和Higuchi方程，1%氮酮和5%丙二醇組更符合零級動力學方程、一級動力學方程。結果見表4。

表4 7種訶子多酚的體外透皮量-時間模型擬合方程(n=3)Table 4 In vitro transdermal quantity-time model fitting equation for seven polyphenols in Jiazi (n=3)

最后一個時間點取樣后，將鼠皮表面殘留藥物洗凈，將皮膚剪碎，加入甲醇溶液1 mL，超聲提取30 min，離心(12 000 r/min)4 min，取上清液，得皮內滯留量樣品溶液，經HPLC測定，計算皮膚中各化學成分的滯留量(Qm)。Qm=(Cm×V)/A。Cm為測得殘留皮膚內藥物質量濃度，V為加入甲醇體積，A為皮膚滲透面積。結果見表5。

表5 7種訶子多酚的皮膚蓄積率(n=3)Table 5 Skin accumulation rate of 7 polyphenols in Jiuzi(n=3)

3 討 論

3.1 試驗皮膚的選擇

人體皮膚是透皮吸收實驗中的最佳皮膚，但較難獲得，有研究利用大鼠皮膚代替人體皮膚進行實驗，并通過比較新鮮鼠皮和冷凍鼠皮發現滲透系數沒有顯著性差異，且個體差異要遠小于人體皮膚[5]。因此選擇大鼠皮膚進行體外透皮吸收實驗。

3.2 透皮吸收接受液的選擇

理想的接受液應在滿足漏槽條件的基礎上盡可能接近人體皮膚，對于親水性化合物、常用的接受液為生理鹽水，而脂溶性化合物，難溶于生理鹽水，可加入適量的醇以增加藥物溶解度，從而維持漏槽條件[6]。有文獻報道醇濃度超過30%就會破壞皮膚結構，造成藥物體內、外試驗中經皮吸收情況不同，體內外相關性會受到影響。因此選擇30%乙醇-生理鹽水作為接受液。

3.3 透皮吸收促進劑的選擇

由于皮膚的屏障作用，藥物經皮吸收時，通常需使用透皮吸收促進劑促進其經皮吸收，氮酮、丙二醇是目前經皮給藥制劑中常用的透皮吸收促進劑，價格便宜，易于獲得[7-8]。本研究考察了未加透皮吸收促進劑與施加不同濃度氮酮、丙二醇后對7種訶子多酚透皮吸收的影響，發現丙二醇作為促進劑時可有效促進訶子次酸、沒食子酸和鞣花酸體外透皮吸收，可能是由于丙二醇作為透皮吸收促進劑時，改變了皮膚結構，提高了藥物在角質層的分配滲入，增加了藥物的經皮吸收[9]。氮酮作為透皮吸收促進劑時，促滲效果不理想，有研究表明，氮酮作用下藥物log Ko/w值與促透倍數對數值呈拋物線關系，對log Ko/w值約為-0.5的藥物具有最佳的經皮促透作用，訶子中7種多酚多為親脂性，log Ko/w值多大于0，導致氮酮對其促滲效果不佳[10]。氮酮組釋放緩慢，但皮膚滯留量大，說明其可以長時間停留在皮膚中發揮療效，可作為緩釋透皮制劑開發[11]。

4 結 論

訶子中7種多酚類成分可以穿透表皮層、真皮層而到達皮下組織，具有較強的透皮吸收作用，為研究訶子外用制劑及奠定基礎。