四種不同產地核桃青皮中萘醌提取工藝優化*

李良哲，王 宇，羅心雨，姚 軍，程煜鳳

(1 新疆醫科大學，新疆 烏魯木齊 830000；2 沈陽藥科大學，遼寧 沈陽 110000)

核桃青皮，又名“青龍衣”，是胡桃科(Juglandaceae)胡桃屬(Juglans)植物核桃(JuglansregiaL.)和核桃楸(Juglansmandshurica Maxim.)的未成熟外果皮[1]。始載于《開元本草》，其鎮痛、治瘍功效在《山東中草藥手冊》《救急方》等醫藥典籍中早有記載，民間也有將其泡水飲用起止痛之效的應用。核桃青皮占有核桃總質量的45%，是常見的農業廢棄物之一。將核桃青皮這種農業廢棄物通過綠色、環保、經濟的方式“變廢為寶”迫在眉睫[2]。現代研究表明，青龍衣中含有豐富的化學成分，包括醌類、黃酮類、二芳基庚烷類、酚酸類等[3]，具有良好的抗菌、抗腫瘤[4]、鎮痛[3]、抗氧化[5]等多種藥理活性。青龍衣中萘醌的提取分離方法一般是，先使用有機溶劑通過浸漬、熱回流、超聲等方式提取，再通過大孔吸附樹脂以及硅膠柱色譜進行多次分離[6]。超聲波提取具有提取溫度低、提取率高、提取時間短等[7]優點，并且在提取過程中對有效成分損傷小、損失小[8]。紫外-可見吸光光度測定核桃青皮中的萘醌類化合物，檢測時間比高效液相色譜法少，是一種高效快速的測定含量的方法。本試驗以四種不同產地核桃青皮作為研究對象，采用超聲波輔助提取核桃青皮中的萘醌類化合物，比色法測定其提取率，考察4個單因素對核桃青皮萘醌類化合物得率的影響，通過正交設計試驗優化提取過程，為核桃青皮的有效開發利用提供可行的方法。

1 實 驗

1.1 實驗材料與試劑

四種不同產地(新疆、東北、安徽和陜西)的核桃青皮；1，8-二羥基蒽醌標準品(含量>98%)，Sigma-Aldrich公司；無水乙醇、氫氧化鉀均為分析純。

1.2 儀器與設備

AB135-S型十萬分之一電子天平，瑞士梅特勒公司；UV-2550紫外-可見分光光度計，日本島津；SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵，鄭州長城科工貿有限公司；KQ-500DE超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；高速萬能粉碎機，天津泰斯特FW135 /FW177；電熱鼓風干燥箱，上海-恒科學儀器有限公司

1.3 實驗方法

1.3.1 標準曲線的制備

參考文獻[9]的標準曲線制備方法并做相應修改。精密稱取1，8-二羥基蒽醌(含量>98%)0.01 g，溶于60%乙醇，置于50 mL容量瓶中，混勻并定容至刻度。用移液管精密移取上述制備的溶液0.0 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL置于25 mL容量瓶中，精密加入1 mL 5% KOH溶液和60%乙醇至刻度。使用UV-2550紫外分光光度計掃描300～700 nm處的光譜。

1.3.2 核桃青皮萘醌類化合物提取率的計算

根據標準曲線計算提取物的濃度，根據以下公式計算提取率。

式中：c為萘醌類化合物的濃度，mg/mL；V為提取液總體積，mL；m為核桃青皮粉的質量，g。

1.3.3 四個單因素試驗對萘醌類化合物提取率的影響

為探究四個不同因素對萘醌類化合物提取率的影響大小，對每個因素都進行了五個不同水平[8]的考察，乙醇濃度的單因素：20%、40%、60%、80%、100%；料液比的單因素：1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80(g/mL，下同)；超聲溫度的單因素：40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃；超聲時間的單因素：30 min、60 min、90 min、120 min、150 min，分別取1.0 g核桃青皮粉，初始條件為60%乙醇、料液比1∶60、超聲溫度60 ℃、超聲時間120 min。按照1.3.1所述方法測定核桃青皮萘醌類化合物含量，3次平行試驗，計算每次試驗提取率。

1.3.4 正交設計試驗

為探尋最佳提取工藝，在單因素實驗的基礎上，建立正交設計試驗，測定核桃青皮中萘醌類化合物的含量，進行四因素三水平的正交試驗，選用L9(34)正交表(見表1)。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 Orthogonal test factor level table

1.3.5 四種不同產地的核桃青皮中萘醌類化合物的提取率

以正交試驗最優條件提取四種不同產地核桃青皮中的萘醌類化合物，重復三次，求平均值。

2 結果與討論

2.1 標準曲線的繪制

選用300～700 nm波長范圍的紫外-可見分光光度計對對照品進行掃描，最大吸收處的波長為540 nm(見圖1)；在300～700 nm處對用5% KOH進行衍生化后的樣品進行光譜掃描，最大吸收波長為540 nm(見圖2)，所以選擇檢測波長為540 nm測定核桃青皮中萘醌類化合物。在540 nm下，根據1.3.1所示方法，得到萘醌標準曲線如圖3所示。

圖1 對照品儲備液最大吸收Fig.1 Maximum absorption of control stock solution

圖2 衍生化后樣品最大吸收圖譜Fig.2 Maximum absorption spectrum of samples after derivatization

圖3 標準曲線Fig.3 Standard curve

2.2 乙醇濃度對提取率的影響

由圖4可知，在40%乙醇條件下，提取率達最高值2.82%。在20%～40%乙醇濃度，濃度越高，溶液與萘醌類成分極性越接近，溶解度變大，提取量變大，乙醇濃度繼續增大，溶劑與萘醌極性差距變大，提取量變小[10]。

圖4 乙醇濃度對提取率的影響Fig.4 Ethanol concentration’s influence on extraction rate

2.3 料液比對提取率的影響

由圖5可知，料液比1∶70提取率達最高值2.82%。當料液比超過1∶70，測定吸光度時，稀釋的體積過大，單位體積中所含的萘醌類化合物的濃度過低，吸光度數值不斷減小，萘醌類化合物提取率反而開始下降，所以選擇最佳料液比為1∶70。

圖5 料液比對提取率的影響Fig.5 Solid-liquid ratio’s effect on extraction rate

2.4 超聲溫度對提取率的影響

由圖6可知，超聲溫度為70 ℃提取率達最高值1.75%。在40～70 ℃范圍內，隨著溫度的升高，萘醌類化合物更易在乙醇中溶解，提取率不斷增加。超聲溫度過高，乙醇揮發性增加，而且萘醌類化合物的化學性質也會改變[10]，所以選取70 ℃為最佳提取溫度。

圖6 超聲溫度對提取率的影響Fig.6 Temperature-related effects of ultrasound on extraction rate

2.5 超聲時間對提取率的影響

由圖7可知，在超聲時間為120 min的條件下，提取率達最高值1.72%。隨提取時間增加，萘醌類化合物在乙醇中溶解的越徹底，提取量越大。但提取時間超過120 min，提取率減少，這是由于當提取率趨近飽和時，萘醌類化合物的提取率不會隨著時間的增加而增加[10]。

圖7 超聲時間對提取率的影響Fig.7 Effect of ultrasonic time on extraction rate

2.6 超聲輔助提取核桃青皮中萘醌類化合物的正交結果

正交試驗發現，A2B1C2D3的組合萘醌類化合物提取率最高，所以本試驗篩選出的最優提取工藝為：40%乙醇，料液比為1∶50，超聲時間為90 min，超聲溫度為70 ℃。根據表2與表3結果，各因素對萘醌類化合物提取率的影響乙醇濃度>料液比>超聲溫度>超聲時間，對核桃青皮中萘醌類化合物提取具有參考意義。

表2 正交試驗設計與結果Table 2 Orthogonal test design and consequences

表3 方差分析表Table 3 ANOVA orthogonal experiment

2.7 四種不同產地的核桃青皮中萘醌類化合物的提取率

由表4可知，東北地區的核桃青皮中萘醌類化合物提取率最高。不同地區環境不同，核桃成熟期不同，核桃青皮脫落時間不同，相同提取方法和條件下，萘醌類化合物提取率不同，可證明本試驗是有意義的。通過比較不同地區的核桃青皮的萘醌類化合物的含量，尋找提取率最高的核桃青皮產地，為后續工作提供條件。

表4 不同產地的提取率(n=3)Table 4 Extraction rates in different places

3 結 論

采用正交試驗法優化核桃青皮萘醌類化合物的提取條件，影響顯著性順序依次為乙醇濃度>料液比>超聲溫度>超聲時間。最優工藝提取條件為：40%乙醇，料液比1∶70，超聲時間90 min，超聲溫度70 ℃。四種不同產地的核桃青皮，東北的核桃青皮中萘醌類化合物提取率最高，達2.85%。本實驗方法操作簡便、成本較低，有效快速的提取及其測定核桃青皮中萘醌類化合物的含量，一定程度上提高了核桃青皮資源的利用率。