真皮成纖維細胞對傷口愈合的作用研究進展

毛夢婕，張曦木

（重慶醫科大學附屬口腔醫院 牙周科/口腔疾病與生物醫學重慶市重點實驗室/ 重慶市高校市級口腔生物醫學工程重點實驗室，重慶，401120）

皮膚是人體最大的器官，是機體免疫的第一道防線。皮膚由表皮和真皮組成，真皮層主要的細胞成分為真皮成纖維細胞。真皮成纖維細胞呈梭形或扁的星狀形，具有突起，細胞體積和細胞核均較大，輪廓清楚。胞質嗜弱堿性，電鏡下可見發達的粗面內質網、高爾基復合體及游離核糖體，用于合成并分泌蛋白質。真皮成纖維細胞是皮膚具有彈性的結構基礎，其處于靜止狀態時也可被稱為祖細胞，在外傷等因素刺激下，轉變為活躍狀態，快速分裂產生分泌旺盛的真皮成纖維細胞和其他間充質譜系的細胞，參與組織損傷的修復。本文綜述了真皮成纖維細胞在創口修復中的分子機制研究進展。

2 真皮成纖維細胞的來源

哺乳動物胚胎真皮成纖維細胞來源于胚胎的不同部位，并分布在最接近其起源的皮膚上。小鼠背部皮膚源自體節的生皮肌節。背側生皮肌節細胞經歷上皮-間充質轉化，生成的真皮成纖維細胞前體從其背側分層，短距離遷移來填充外胚層下的細胞外空間，以響應神經管和外胚層的信號[1]，形成背部皮膚；從側板中胚層的背側胚外壁分層形成腹部、側面及四肢的皮膚[2,3]。

在E12.5，真皮祖細胞表達泛成纖維細胞標志物。到E14.5，真皮祖細胞進一步分化，產生乳頭狀和網狀真皮譜系[4]，它們的基因表達與功能出現差異。乳頭狀真皮祖細胞產生乳頭狀成纖維細胞和真皮乳頭，在毛囊形態發生和循環中起重要作用[5]。在表皮基板形成后，下方乳頭狀成纖維細胞遷移、黏附，最終聚集形成真皮乳頭的前體——真皮凝結[6]。在真皮凝結與表皮基板溝通作用下，毛囊向下生長。網狀真皮祖細胞產生網狀成纖維細胞和真皮白色脂肪組織（DWAT）。網狀成纖維細胞分泌密集的膠原纖維，保證皮膚結構完整并具有一定強度。DWAT也被稱為皮內脂肪，是最近定義的細胞類型，在發育和來源上與皮下脂肪顯著不同，它承擔一部分皮膚屏障的功能[7,8]。在E16.5，網狀真皮譜系表達DLK1[4]，皮膚中的前脂肪細胞在出生后出現一個表達DLK1的亞群，表明DWAT源自網狀真皮譜系。持續激活皮膚Wnt/β-Catenin信號可使DWAT細胞數量減少，而網狀成纖維細胞增多，ECM產生增多，導致皮膚纖維化[9]。

3 真皮成纖維細胞的作用

3.1 肉芽組織的形成與改建

當皮膚出現急性損傷，巨噬細胞和血小板分泌趨化因子，網狀成纖維細胞快速做出反應，分泌大量ECM并遷移至傷口處，與新生毛細血管、免疫細胞等一同形成肉芽組織。與此同時，ECM的沉積對真皮成纖維細胞產生機械應力，并誘導轉化生長因子（TGF-β1）產生，分子信號和物理因素均誘導靜止的真皮成纖維細胞轉變為肌成纖維細胞[10,11]。也有研究認為，靜止狀態下的真皮成纖維細胞是肌成纖維細胞的主要來源，但由于肌成纖維細胞的異質性，肌成纖維細胞亞群存在其他細胞來源[12]。肌成纖維細胞表達收縮蛋白并分泌大量ECM，通過牽引自身黏附至新分泌ECM上完成收縮，閉合創口。創口的收縮減少了必須重新上皮化的面積，對創口修復有重要意義。

臨床環境中，傷口閉合被認為是傷口愈合的終點，但損傷后2-3 周后的組織重塑可持續數月至數年。重塑過程包括新生血管的退化、ECM的周期性沉積和肉芽組織的改建。角質細胞完成再上皮化后，肉芽組織內的肌成纖維細胞仍舊合成金屬蛋白酶（MMP）及金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMP）[13]。在它們的共同作用下，ECM合成減慢，Ⅲ型膠原蛋白被I 型膠原蛋白所取代。傷口成熟后期，肌成纖維細胞的收縮基因表達降低，最終停止，在損傷消退后可轉化為其他專門的間充質譜系。Plikus等人觀察到，終止小鼠皮膚傷口中肌成纖維細胞的收縮行為，該細胞開始響應毛囊分泌的骨形態發生蛋白（BMP）[7]，被重新編程為皮內脂肪細胞。肌成纖維細胞也可發生凋亡，被巨噬細胞吞噬，重組堿性成纖維細胞生長因子可促進肌成纖維細胞凋亡來促進無瘢痕愈合[14]。在慢性損傷或持續炎癥的異常激活下，肌成纖維細胞沒能正常轉歸，ECM生成紊亂，將導致局部瘢痕形成或彌漫性纖維化。

3.2 抵御病原體

感染是影響創口愈合的一大因素。雖然真皮成纖維細胞以前被認為是免疫中性細胞，但近年來已經觀察到真皮成纖維細胞在免疫中的多種功能。真皮成纖維細胞可以作為防御感染的哨兵。Toll受體家族（TLRs）能夠識別病原相關分子模式與危險相關分子模式，體外研究證實了TLRs中多個成員在人真皮成纖維細胞中表達并響應[15]。基孔肯雅病毒、西尼羅病毒刺激下，真皮成纖維細胞內TLR3，7，8，9 表達量增加，并激活下游炎癥通路，最終抑制病毒復制[16]。細菌脂多糖能夠刺激真皮成纖維細胞產生IL-1β，而非IL-18，可能依賴于跨膜蛋白TLR4 的識別[17]。

真皮成纖維細胞應對感染會反應性成脂，使真皮層白色脂肪增厚，加固物理屏障。創口的金黃葡萄球菌感染致使DLK1前脂肪細胞（源于網狀成纖維細胞）分化為幼稚脂肪細胞，并分泌大量抗菌肽[18]。真皮成纖維細胞來源ECM與抗菌制劑環丙沙星聯合使用能顯著加快小鼠感染創口的愈合[19]。在其他細胞，諸如CD4+T細胞[20]、血管內皮細胞[21]、角質形成細胞[22]的存在下，真皮成纖維細胞展現出更強的抗感染能力，但其細胞互作的詳細機制仍舊有待進一步闡明。

此外，識別病原體后，真皮成纖維細胞可以產生多種細胞因子和趨化因子，包括IL-1α，IL-6，IL-8，招募中性粒細胞、巨噬細胞等免疫細胞至感染部位共同發揮作用。

3.3 真皮成纖維細胞與毛囊再生

過去普遍認為，哺乳動物不能在傷口部位再生皮膚附屬器，直到20世紀40 年代大鼠和兔子皮膚傷口的毛囊再生被報導[23]。傷口中，毛囊的生成具有抗纖維化和促進血管生成的作用[7,24]。在皮膚傷口愈合的過程中，網狀成纖維細胞先出現，分泌厚而排列有序的膠原纖維，纖維化傷口中的典型膠原纖維來源于此[4]。乳頭狀成纖維細胞在后期傷口上皮化時出現。只有乳頭狀成纖維細胞參與毛囊的發育，因此，皮膚受傷時網狀成纖維細胞的立即參與或許是傷口皮膚中毛囊缺失的原因。近年來，WNT/β-catenin信號通路在皮膚創口毛囊再生中的重要作用被認識到。值得注意的是，成人皮膚毛囊再生能力的喪失并不反映表皮也沒有再生毛囊的能力。激活小鼠表皮中β-catenin信號，無論皮膚有無損傷，均可誘導產生毛囊[25,26]。激活表皮的β-catenin可激活網狀成纖維細胞和乳頭狀成纖維細胞，但只有激活乳頭狀成纖維細胞才能使毛囊再生[4]。小鼠出生后，抑制真皮成纖維細胞中的β-catenin信號對傷口愈合過程中毛囊再生起促進作用[27]。WNT/β-catenin信號通路的具體作用機制還未明確，或許還存在獨立于該通路的其他通路調控毛囊再生。隨著年齡的增長，乳頭狀成纖維細胞減少，真皮乳頭層變薄，并逐漸被網狀成纖維細胞取代，而β-catenin活性也隨年齡增長而增加。發生損傷時，皮膚通過快速吸引網狀成纖維細胞修復創口，代價是毛囊無法再生[27]。可以推測，正常的上皮-間充質相互作用發生在表皮和真皮乳頭層之間，維持這種相互作用對毛囊的產生至關重要，調整響應創傷修復的不同類型真皮成纖維細胞比例，或許能成為誘導創傷皮膚再生毛囊的一大方向。

3.4 真皮成纖維細胞與皮膚無痕愈合

人類胎兒能夠無痕愈合皮膚創口，這一能力一直保留到妊娠晚期。與成人相比，胎兒損傷區域的ECM和細胞因子表達譜有很大差異。TGF-β在傷口早期由免疫細胞和血小板分泌，晚期由真皮成纖維細胞分泌[28]，它的3 種表型里TGF-β1和TGF-β2 參與促進傷口纖維化，而TGF-β3 抗纖維化。成人皮膚損傷時，前兩種表型占據主導地位，但胎兒損傷皮膚中可檢測到大量TGF-β3[29]。目前，重組人TGF-β3 已用于臨床試驗，可顯著減少或防止術后瘢痕形成[30]。成人真皮ECM中，I 型膠原是主要成分，透明質酸（HA）含量較低。在成人的新愈合皮膚中，I型膠原與Ⅲ型膠原的比例接近1:1，與新生兒皮膚類似。但在胎兒新愈合皮膚中，Ⅲ型膠原占比較高。同時，胎兒真皮成纖維細胞不會隨著細胞密度的增加而減少HA的合成[31]，HA是胎兒真皮ECM的主要成分，而基于HA的基質是一種有效的再生皮膚基質。此外，胚胎真皮成纖維細胞在損傷時遷移更快，它表現出一種獨特的收縮表型，促進ECM的組裝，以重建真皮的自然結構和功能，這種行為在體內和體外的移植實驗中都得到了保存[32]。

近年來，測序技術的出現對真皮成纖維細胞的功能探究給予很大幫助。Dongsheng Jiang等人通過單細胞命運圖譜、實時三維共聚焦成像等方法研究得出結論，真皮成纖維細胞存在兩種表型，En1陽性成纖維細胞（EPF）是病理性瘢痕形成的主要因素，En1陰性成纖維細胞（ENF）不參與瘢痕形成，真皮對損傷反應從再生到瘢痕是由En1譜系置換驅動，完成了ENF到EPF的表型轉換[33]。Shamik[34]等人的研究指出，小鼠真皮成纖維細胞在出生后停止表達En1，可能存在某個ENF亞群在傷口愈合中受機械轉導信號驅動En1激活，轉化為EPF，阻斷該信號可使皮膚創口無痕愈合。

4 真皮成纖維細胞治療方式的臨床應用

4.1 真皮成纖維細胞治療RDEB

真皮成纖維細胞在培養、擴增、凍存、包裝、運輸等方面操作可行性強，穩定性好，自身HLA抗原表達水平低，免疫排斥可能性小，這些都是其在細胞治療中的優勢。位于皮膚基底膜下方的Ⅶ 型膠原蛋白（C7）主要來源于真皮成纖維細胞，對維持皮膚結構完整性至關重要。隱形營養不良性大皰性表皮松解（RDEB）為編碼C7 的COLA1 基因突變引起，患者體內C7含量極低，導致皮膚、黏膜廣泛松解，潰瘍形成。真皮成纖維細胞體外培養產生的C7穩定，使其成為細胞治療的熱門靶點。

異體來源的真皮成纖維細胞取自健康人的皮膚組織，傳代培養后可直接注射于病損周圍皮內，或者培養得到皮膚替代物移植于病損區域，此種方法分離得到的真皮成纖維細胞可長期保存，使用便捷。研究表明異體真皮成纖維細胞注射主要增加受體自身細胞內源性COL7A1 的mRNA表達[35]，單次注射異體真皮成纖維細胞能夠增加基底膜帶COL7A1 的mRNA表達量3-6 個月，C7 表達含量9-12 個月[36,37]，在臨床試驗中對于減小潰瘍面積、縮短愈合時間卓有成效。但是，注射異體來源真皮成纖維細胞對于有基礎C7 表達量的患者效果顯著，而對自身不表達C7 的患者成效甚微。

自體來源的真皮成纖維細胞取自患者的非病損區域皮膚，提取得到真皮成纖維細胞經基因矯正后傳代培養、使用，與異體細胞相比，注射的自體真皮成纖維細胞壽命延長，局部C7 的產生時間增加，但是其難以在短期內大量增殖限制了它的使用。局部注射COL7A1 基因修飾的自體真皮成纖維細胞在2019 年首次投入臨床研究，受試的4 位患者均檢測到局部皮膚C7 含量的增加，且持續時間可達12 個月[38]，盡管自體真皮成纖維細胞體外增殖慢，這種針對性強的個體化醫療方式也潛力無窮。

4.2 真皮成纖維細胞治療其他皮膚創口

真皮成纖維細胞能釋放胞外生長因子和基質，誘導附近的上皮增殖、分化并進入傷口床，同時推動其他細胞共同形成肉芽組織[35]。因此，體外培養的真皮成纖維細胞也被用于治療重度燒傷[39]、腫瘤切除后造成的較大皮膚缺損和一些伴有全身性疾患的深潰瘍。皮膚組織工程技術也有真皮成纖維細胞的參與，工程皮膚可作為臨時或永久的皮膚替代物在皮膚損傷修復中發揮作用。真皮成纖維細胞連同特定細胞因子種植于多孔的3 D支架上，植入有缺陷的皮膚部位，創造微環境，促進組織長入。由真皮成纖維細胞和角質形成細胞共培養得到的重組皮膚，在共培養條件下，真皮成纖維細胞能加強細胞-元素、細胞-細胞間接觸，在治療巨大潰瘍時展現更好的效果[40]。

5 總結與展望

除了傳統認知的合成ECM，真皮成纖維細胞在傷口愈合中還承擔了關閉創口、形成并改建肉芽組織以及在感染創口中抵御病原體的功能，真皮成纖維細胞也用于臨床治療皮膚創口并取得良好效果。從發現真皮成纖維細胞的異質性起，其在傷口愈合中的研究便主要聚焦于瘢痕形成與毛囊再生，皮膚的完全再生一直是臨床追求的目標。隨著基因組技術的普及，越來越多的真皮成纖維細胞亞群被挖掘，探明真皮成纖維細胞在傷口愈合中的動態變化機制，區分真皮成纖維細胞的不同亞群并明確其特定作用，將有助于為以真皮成纖維細胞為靶點治療皮膚創口提供新的臨床思路。