基于膝關(guān)節(jié)軟骨損傷探討自體軟骨細(xì)胞植入術(shù)的相關(guān)研究進(jìn)展

王寧,王廣積,杜秀藩

(1.海南醫(yī)學(xué)院,海南 海口 570311;2.海南醫(yī)學(xué)院附屬海南醫(yī)院,海南省人民醫(yī)院運(yùn)動醫(yī)學(xué)科,海南 海口 570300)

膝關(guān)節(jié)軟骨是覆蓋雙關(guān)節(jié)末端的無血管和非神經(jīng)結(jié)締組織,其功能主要是實(shí)現(xiàn)潤滑的關(guān)節(jié)運(yùn)動,在日常活動中其承受重復(fù)的高沖擊和負(fù)荷,所以膝關(guān)節(jié)軟骨損傷是常見的骨科疾病之一[1]。由于其無血管結(jié)構(gòu),再生能力較差,因此對于它的修復(fù)和再生具有很高的挑戰(zhàn)性。臨床上對于修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷的手術(shù)已有多種方法,比如微骨折(microfracture,MF)、骨軟骨自體移植(osteochondral autograft transplantation,OAT)、同種異體骨軟骨移植(osteochondral allograft transplantation,OCA)、自體軟骨細(xì)胞植入(autologous chondrocyte implantation,ACI)以及組織工程技術(shù)等。

目前關(guān)節(jié)軟骨缺損的理想治療方法是恢復(fù)有組織的透明軟骨,降低其再發(fā)病率。目前ACI、OAT與OCA以及組織工程技術(shù)理論上能提供透明軟骨的幾種手術(shù)方案,然而OAT存在供體區(qū)發(fā)病率的問題,并且與移植物的面積大小成正比,即軟骨損傷區(qū)域越大,應(yīng)用OAT治療軟骨損傷后引發(fā)供體區(qū)發(fā)病率的可能性越大[2]。OCA作為替代OAT的治療手段,目前是臨床研究的熱點(diǎn)之一,但OCA作為異體移植物,可能存在宿主-移植物反應(yīng),這可能導(dǎo)致移植失敗。除此以外OCA還存在著疾病傳播、移植物輪廓匹配以及從移植物獲取到植入的時(shí)間有限等因素的影響[3]。

1 ACI的進(jìn)化過程

20世紀(jì)60年代末,Chesterman和Smith[4]發(fā)表了一篇具有里程碑意義的文章,描述了成功地將分離的軟骨細(xì)胞移植到兔子身上。他們的發(fā)現(xiàn)為后續(xù)ACI的發(fā)展做了良好的鋪墊,直到1994年ACI技術(shù)被Brittberg等[5]首次報(bào)道。ACI技術(shù)主要分為兩個(gè)步驟:(1)在關(guān)節(jié)鏡檢查過程中獲得軟骨細(xì)胞,然后將其送去培養(yǎng);(2)在獲得的軟骨細(xì)胞培養(yǎng)2～3周后,將骨膜貼片用可吸收縫線固定在周圍的軟骨上以形成一個(gè)儲液器,并在其下方注射培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞懸浮液。最早的ACI技術(shù)也被稱為第1代ACI,基于骨膜的自體軟骨細(xì)胞植入(periosteum-based autologous chondrocyte implantation,ACI-P)。隨著技術(shù)的發(fā)展,研究者也對第1代ACI技術(shù)進(jìn)行了新的改進(jìn),比如應(yīng)用膠原膜替代骨貼膜、使用支架等;第2代ACI在懸浮培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞表面覆蓋一層由I型或Ⅲ型膠原組成的膜;第3代技術(shù)涉及細(xì)胞外基質(zhì)或臨時(shí)支架的創(chuàng)造,旨在誘導(dǎo)細(xì)胞在體外生長和成熟。軟骨細(xì)胞附著在支架上,從而避免了將細(xì)胞注射到病變部位的需要。這些第2代和第3代技術(shù)也被稱為基于膠原膜的自體軟骨細(xì)胞植入(collagen membrane-based autologous chondrocyte implantation,ACI-C)、膜相關(guān)自體軟骨細(xì)胞植入(membrane-associated autologous chondrocyte implantation,MACI)和基于支架的ACI[6]。

2 關(guān)于3代ACI

三種ACI技術(shù)均以軟骨細(xì)胞培養(yǎng)以誘導(dǎo)透明軟骨形成為目的,三者的區(qū)別主要在于貼膜性質(zhì)與承載軟骨細(xì)胞的介質(zhì)不同。雖然ACI-P的短期和中期結(jié)果可觀,但可能發(fā)生多種并發(fā)癥,包括骨膜肥大、骨膜鈣化、分層和關(guān)節(jié)內(nèi)病變等[7]。

ACI-C與MACI的發(fā)展相當(dāng)迅速,其目的是解決與ACI-P相關(guān)的局限性。ACI-C目前經(jīng)過至少一項(xiàng)前瞻性研究已被證實(shí)持久有效。比如在一項(xiàng)前瞻性實(shí)驗(yàn)中,Ossendorf等[8]使用一種基于自體聚合物的三維軟骨細(xì)胞移植物,可以很好地修復(fù)局灶性關(guān)節(jié)軟骨缺損。這種聚合物名為BioSeed-C,是一種第2代ACI組織工程軟骨移植物,它能將自體軟骨細(xì)胞與凝膠樣基質(zhì)的組織二者特性結(jié)合在穩(wěn)定的生物可吸收聚合物支架中。該研究結(jié)果報(bào)告認(rèn)為這種第2代ACI方法與ACI-P相比具有許多優(yōu)勢,具體表現(xiàn)在通過使用穩(wěn)定的生物貼膜,使接種的軟骨細(xì)胞更有效地保留在植入部位,減少關(guān)節(jié)腔細(xì)胞丟失,從而促進(jìn)新軟骨與周圍宿主關(guān)節(jié)軟骨組織之間更充分的整合。Gooding等[9]比較了ACI-P和ACI-C的短期療效,隨訪2年中試驗(yàn)結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。然而,ACI-P組的并發(fā)癥發(fā)生率較高,因?yàn)槎嗬颊咭蛞浦参?骨膜)肥大或出現(xiàn)分層需要進(jìn)行翻修手術(shù)。Samuelson和Brown等[10]則對ACI-P和ACI-C進(jìn)行了成本效益分析,他們發(fā)現(xiàn)雖然這兩種方法都具有成本效益,但是基于移植物肥大風(fēng)險(xiǎn)而言,發(fā)現(xiàn)ACI-C比ACI-P更具成本效益。在一項(xiàng)針對第1代和第2代ACI技術(shù)臨床治療效果長達(dá)10年隨訪的研究中,與ACI-P相比,ACI-C將膠原膜與自體軟骨細(xì)胞結(jié)合使用可帶來更好的臨床長期結(jié)果。基于這些結(jié)果,ACI-C應(yīng)優(yōu)先于ACI-P[11]。

MACI出現(xiàn)于20世紀(jì)90年代和21世紀(jì)初,提倡使用MACI的研究者們認(rèn)為該技術(shù)消除了與ACI-P和ACI-C相關(guān)的某些并發(fā)癥和困難[12]。例如,當(dāng)使用帶骨膜或膠原蛋白貼片的ACI時(shí),很難均勻分布軟骨細(xì)胞或在不規(guī)則骨軟骨連接處形成安全貼片。ACI-P和ACI-C二者都需要縫合和行關(guān)節(jié)切開術(shù),會延長手術(shù)時(shí)間,與貼片技術(shù)相關(guān)的常見并發(fā)癥包括移植物肥厚、貼片剝離以及縫合線對周圍軟骨的損傷等。與ACI-P和ACI-C不同,MACI中自體軟骨細(xì)胞是在膜上植入的。MACI膜由含有軟骨細(xì)胞的Ⅰ型/Ⅲ型膠原雙分子層組成,雙分子層的一側(cè)有間距很大的膠原纖維,這就形成了一個(gè)粗糙的表面,雙分子層的另一側(cè)由緊密排列的膠原纖維組成,這就形成了一個(gè)光滑的表面。軟骨細(xì)胞分布在雙分子層粗糙的一側(cè)。在手術(shù)過程中,用纖維蛋白膠將膜直接固定在軟骨損傷處,從而避免了縫合膜的需要。由于其粘附性,這種膜可以植入困難的部位,細(xì)胞也均勻分布在整個(gè)膜上。MACI的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是它可以作為成纖維細(xì)胞移入軟骨細(xì)胞的屏障,否則會導(dǎo)致纖維軟骨的形成[12]。

Ebert等[13]用MACI治療膝關(guān)節(jié)軟骨損傷,并在移植后5年用臨床癥狀和MRI進(jìn)行評估治療效果。在接受治療的45例患者中,膝關(guān)節(jié)損傷和骨關(guān)節(jié)炎結(jié)局評分(knee injury and osteoarthritis score,KOOS)以及健康調(diào)查簡表(the MOS item short from health survey, SF-36)均有顯著改善,MRI評分顯著提高,67%患者的移植物顯示完全填充,89%患者的移植物顯示良好到極好的填充。同樣,Marlovits等[14]報(bào)告了用MACI治療軟骨缺損的臨床和放射學(xué)的5年隨訪結(jié)果,MACI術(shù)后患者的KOOS評分均有顯著改善,不僅如此,患者國際膝關(guān)節(jié)文獻(xiàn)委員會(international knee documentation committee,IKDC)評分、辛辛那提膝關(guān)節(jié)評分和膝關(guān)節(jié)Lysholm評分也取得了顯著改善,而在治療5年后大多數(shù)患者觀察到移植物完全填充(83%)。在一項(xiàng)Ⅱ級研究中,Zeifang等[15]比較了MACI和ACI-P的2年預(yù)后,該研究納入了21例軟骨受損平均面積為4.1 cm2的患者,雖然術(shù)后IKDC的差異不大,但ACI-P組Lysholm的評分卻較高。此外,術(shù)后MRI的評估顯示,ACI-P組的軟骨修復(fù)組織MRI觀察評分較MACI組更高,但隨訪2年后結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而Bartlett等[12]在ACI-C與MACI治療效果的Ⅱ級隨機(jī)研究中共納入91例患者,結(jié)果兩組辛辛那提膝關(guān)節(jié)評分、國際軟骨修復(fù)協(xié)會評分、疼痛視覺模擬評分表的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且兩組患者并發(fā)癥發(fā)生率接近,均發(fā)生移植物肥厚。

3 ACI與其他手術(shù)的差異

3.1 ACI與MF 以MF為代表的骨髓刺激技術(shù)因?yàn)槠浜喴住⒊杀镜汀⒍唐谛Ч枚３Ｗ鰹檐浌菗p傷后的首選治療方式。但有證據(jù)提示在接受MF治療5年后,特別是應(yīng)用MF治療大面積軟骨缺損治療時(shí),膝關(guān)節(jié)功能會發(fā)生惡化[16]。在一項(xiàng)多中心前瞻性試驗(yàn)中,Saris等[17]將118例患者隨機(jī)分組,分別進(jìn)行MF和ACI治療(ACI-P或ACI-C),隨訪3年后發(fā)現(xiàn)兩組KOOS、疼痛視覺模擬評分表以及生活質(zhì)量上比較,ACI組明顯高于MF組。而Kon等[18]進(jìn)行了一項(xiàng)前瞻性隊(duì)列研究,比較了ACI-C與MF治療膝關(guān)節(jié)軟骨損傷的療效。該研究應(yīng)用了一種名為Hyalograft C的聚合物,發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的推移,植入Hyalograft C組在2～5年后觀察到良好的結(jié)果,而MF組在治療4～6年后逐漸惡化。在Kon[19]的另一項(xiàng)研究中,在高水平的男性足球運(yùn)動員中發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果:雖然MF組較早恢復(fù)運(yùn)動,但隨著時(shí)間的推移結(jié)果有所下降,所以他認(rèn)為基于膠原貼膜的軟骨細(xì)胞植入技術(shù)(Hyalograf-C)較MF能提供更持久的臨床結(jié)果。Basad等[20]進(jìn)行了一項(xiàng)前瞻性隨機(jī)對照試驗(yàn)研究,將MACI與骨髓刺激技術(shù)進(jìn)行了比較,其中20例患者接受MACI手術(shù),20例患者接受MF手術(shù),兩組在Lysholm評分、國際軟骨修復(fù)協(xié)會評分方面均有顯著改善,但手術(shù)后2年內(nèi)MACI優(yōu)于MF。而在Dhillon等[21]一篇關(guān)于MACI與MF治療膝關(guān)節(jié)局灶性軟骨缺損的meta分析也支持這種觀點(diǎn),他認(rèn)為在短期隨訪中,MACI治療成功率高于MF。

3.2 ACI與OAT/OCA 既往研究已經(jīng)表明[22-23]關(guān)節(jié)軟骨缺損區(qū)域在2～4 cm2可以使用ACI或OAT,當(dāng)缺損區(qū)域>4 cm2則可以使用ACI或OCA。OAT是一種能立即用透明軟骨填充關(guān)節(jié)軟骨缺損的手術(shù)治療方式,這種技術(shù)需要從患者自己的關(guān)節(jié)收集軟骨(通常是同側(cè)膝蓋的非承重區(qū)域),收獲一個(gè)或多個(gè)骨軟骨移植物,并將其移植到軟骨缺損區(qū)域,但這將導(dǎo)致收集軟骨區(qū)域發(fā)生軟骨缺損的概率增大[2]。在一項(xiàng)關(guān)于ACI與OAT隨訪時(shí)間至少10年的前瞻性研究中發(fā)現(xiàn),與OAT相比,接受ACI治療功能結(jié)局明顯更好[24]。

關(guān)節(jié)軟骨缺損太大而無法成功自體移植時(shí),OCA可作為OAT的替代療法。研究表明[25],這種技術(shù)可改善功能,用于治療局灶性和彌漫性軟骨病變以及高需求患者。在一項(xiàng)隊(duì)列研究中[26]對比了OCA與ACI治療局灶性關(guān)節(jié)軟骨缺損的臨床和功能結(jié)局差異,研究結(jié)果表明,ACI在所有病變部位治療癥狀性關(guān)節(jié)軟骨缺損的結(jié)局與OCA相似。

4 ACI相關(guān)并發(fā)癥

雖然ACI技術(shù)從短期和長期結(jié)果來看都有不錯(cuò)的成績,但伴隨ACI的并發(fā)癥問題不容小覷,一篇關(guān)于研究膝關(guān)節(jié)軟骨缺損自體軟骨細(xì)胞植入后的特征性并發(fā)癥認(rèn)為,ACI的并發(fā)癥主要診斷可歸納為四種:癥狀性肥大、融合紊亂、分層和移植失敗[27]。(1)癥狀性肥大即前文所述的移植物肥厚,最常見于骨膜瓣覆蓋ACI(ACI-P)的患者,常引起的臨床癥狀如持續(xù)疼痛或膝關(guān)節(jié)功能障礙。Harris等[28]在一篇囊括了13項(xiàng)Ⅰ級和Ⅱ級研究報(bào)告的關(guān)于ACI系統(tǒng)綜述中發(fā)現(xiàn)移植物肥厚發(fā)生率在ACI-P中占22%、ACI-C中占5%、MACI中占4%。(2)融合紊亂是指再生軟骨不能與周圍的健康軟骨融合。Niemeyer等[27]發(fā)現(xiàn)融合不足的發(fā)生率為23.1%。以MACI組(4.8%)中發(fā)生干擾融合最為常見,其次是ACI-C組(3.7%),而ACI-P組無干擾融合病例。(3)分層是ACI后的并發(fā)癥之一,指的是軟骨與軟骨下層骨的分離。這是由剪切力引起的,在兩層融合發(fā)生之前,導(dǎo)致軟骨層在軟骨下骨層上滑動,這可能因不順應(yīng)或過早恢復(fù)負(fù)重而發(fā)生[27]。(4)在系統(tǒng)綜述[28]中對移植失敗最常見的定義是再次手術(shù),在13項(xiàng)研究報(bào)告604例病例中,有17例需要再次手術(shù),總體失敗率為2.8%。而在Harris的另一篇單獨(dú)對82項(xiàng)Ⅰ～Ⅳ級系統(tǒng)研究的綜述中[29],囊括了5 276例患者,使用了不同代的ACI和手術(shù)技術(shù),總體來說ACI治療后失敗率較低(1.5%～7.7%),與前面的系統(tǒng)綜述[28]不同。這篇文獻(xiàn)中將失敗率與再手術(shù)率分開來描述結(jié)果,在3代ACI技術(shù)中,以ACI-P的術(shù)后失敗率和非計(jì)劃再手術(shù)率最高分別是7.7%和27.0%。其中以移植物肥厚和分層后進(jìn)行清創(chuàng)為最常見的再手術(shù)原因。除此之外,還存在再生軟骨不足、關(guān)節(jié)纖維化、深靜脈血栓形成、傷口感染以及膿毒性關(guān)節(jié)炎等少見的并發(fā)癥[27]。針對這些并發(fā)癥,Welton等[2]認(rèn)為選用ACI之前應(yīng)從年齡、貼膜類別、軟骨缺損位置等去考慮,比如老年人群及ACI-P治療的患者容易出現(xiàn)再生軟骨不足、移植物肥大等并發(fā)癥,而髕骨軟骨缺損可會導(dǎo)致移植物肥大的風(fēng)險(xiǎn)增加。分層的治療方法是清除已經(jīng)發(fā)生分層的軟骨層后,根據(jù)剩余缺損的大小進(jìn)一步治療,較小的缺損(<2 cm2)可以通過MF或OAT進(jìn)行二次治療,而較大的缺損則考慮通過ACI或OCA來進(jìn)行補(bǔ)救[2]。

5 ACI球狀體的應(yīng)用

2002年,Anderer和Libera[30]首次提出了源自自身聚集軟骨細(xì)胞的球狀體的概念,通過在瓊脂糖包被的孔中培養(yǎng)擴(kuò)增的軟骨細(xì)胞來制造球狀體是可行的,在內(nèi)含自身血清的培養(yǎng)基中進(jìn)行完整的細(xì)胞培養(yǎng),不使用額外的生長因子、抗生素或其他異種產(chǎn)物。

基于球狀體的概念,科研人員在早期進(jìn)行了一系列臨床前和非臨床研究。在一項(xiàng)臨床前實(shí)驗(yàn)中,Schubert等[31]進(jìn)行了球狀體的原理驗(yàn)證試驗(yàn),該實(shí)驗(yàn)首次證明了軟骨細(xì)胞球狀體填充軟骨病變的預(yù)期功能。而在另一項(xiàng)研究中,針對于骨骼成熟的雄性豬進(jìn)行評估大型動物模型軟骨細(xì)胞球狀體的體內(nèi)療效[32]。在進(jìn)行人為軟骨缺損形成及球狀體治療后2個(gè)月后,對缺損區(qū)域進(jìn)行組織學(xué)評估,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在進(jìn)行球狀體治療后表現(xiàn)出較未處理缺損更高程度的填充,并伴有更光滑的再生表面。除此之外,研究人員通過根據(jù)良好實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)范評估免疫缺損型小鼠的生物分布和致瘤性,解決了植入球狀體ACI后的安全性問題[33]。在隨后的Ⅱ、Ⅲ期臨床實(shí)驗(yàn)中研究了球狀體劑量對治療膝關(guān)節(jié)軟骨缺損的安全性和有效性,以及對比了球狀體與MF治療膝關(guān)節(jié)軟骨缺損的效果,結(jié)果顯示隨訪數(shù)據(jù)得到改善,且較MF治療水平高[34]。

在進(jìn)行了一系列研究確保該技術(shù)的安全性和有效性后,球狀體在近幾年逐漸應(yīng)用于臨床。目前臨床上應(yīng)用的球狀體是德國制造的產(chǎn)品,又稱為Spherox。在這種技術(shù)中,軟骨細(xì)胞在單層中培養(yǎng),然后進(jìn)行三維培養(yǎng),形成由軟骨細(xì)胞及其自合成的細(xì)胞外基質(zhì)組成的球狀體,在使用前球狀體被放入NaCl溶液中。其可以自粘在軟骨下骨和軟骨上,與其他ACI技術(shù)相比,這去除了任何外源性基質(zhì)、膠水或縫合線的需要[35]。在最近一項(xiàng)研究中,研究人員將球狀體與MF進(jìn)行了治療對比研究,并進(jìn)行了5年隨訪,發(fā)現(xiàn)球狀體ACI治療在5年隨訪期間的IKDC、KOOS、Lysholm以及軟骨修復(fù)組織的磁共振觀察等評分均有良好改善。其中球狀體ACI的KOOS評分優(yōu)于MF且沒有發(fā)現(xiàn)安全隱患[35]。除了臨床數(shù)據(jù)以外,在組織學(xué)結(jié)果上,研究人員對球狀體ACI修復(fù)膝關(guān)節(jié)軟骨缺損后的患者進(jìn)行穿刺活檢,并對標(biāo)本進(jìn)行組織學(xué)染色,發(fā)現(xiàn)在所有患者的再生組織中都觀察到具有完整軟骨-骨邊界界面的缺血性軟骨組織。再生組織內(nèi)的細(xì)胞顯示出圓形和軟骨細(xì)胞表型,并形成簇狀。該研究發(fā)現(xiàn)基于球狀體的ACI治療后再生的軟骨組織在組織學(xué)和免疫組織化學(xué)上與透明關(guān)節(jié)軟骨非常相似,這表明了基于球狀體的ACI在以透明關(guān)節(jié)軟骨為主的再生方面產(chǎn)生了有意義的組織學(xué)結(jié)果[36]。

6 總結(jié)與展望

目前常用的骨軟骨病變治療方法對于軟骨缺損均有不同程度的療效,ACI是一種有效的關(guān)節(jié)軟骨再生方法,目前ACI/MACI被英國國家衛(wèi)生與臨床優(yōu)化研究所推薦作為適用患者的一線手術(shù)[37]。

對于歷代ACI技術(shù),ACI-C較ACI-P的區(qū)別就在于貼膜的性質(zhì),能夠更好的使軟骨細(xì)胞溶液儲存在缺損區(qū)域。雖然目前已經(jīng)有研究證明ACI-C較ACI-P有短期至長期的優(yōu)勢,但大多數(shù)是基于ACI-P并發(fā)癥多且高發(fā)來當(dāng)做證據(jù),這也將可能導(dǎo)致得出研究結(jié)論的依據(jù)過于單一以至于證據(jù)等級可信度不高。而現(xiàn)在尚未有有力的證據(jù)去證明MACI較前兩代ACI技術(shù)存在優(yōu)勢,且闡述歷代ACI之間比較的文獻(xiàn)也較少。除此之外,對于移植失敗的定義與再手術(shù)率的相關(guān)性在三種ACI技術(shù)中尚未得到共識。所以在三種ACI技術(shù)之間差異的問題上,未來可能需要通過設(shè)計(jì)良好且長期的隨機(jī)對照試驗(yàn)研究來進(jìn)一步探討。

球狀體ACI是一項(xiàng)相對較新的技術(shù),多項(xiàng)研究報(bào)告已經(jīng)確定了其安全性和有效性,甚至是相較于MF技術(shù)的優(yōu)越性。而在與傳統(tǒng)ACI技術(shù)的比較上,根據(jù)球狀體ACI應(yīng)用原理與傳統(tǒng)ACI技術(shù)相關(guān)的并發(fā)癥發(fā)生率可能會下降。比如有文獻(xiàn)表明縫合線固定會永久性損傷周圍的軟骨[38],此外因?yàn)楹幸蛛拿?導(dǎo)致使用人纖維蛋白封閉劑粘合移植物可能會引發(fā)免疫反應(yīng)[39]。基于目前對球狀體ACI技術(shù)的研究報(bào)告,球狀體ACI治療軟骨缺損的效果似乎很有潛力,但目前關(guān)于球狀體軟骨細(xì)胞最佳培養(yǎng)時(shí)間和劑量還有待進(jìn)一步研究,除此之外球狀體ACI不良反應(yīng)包括關(guān)節(jié)積液、關(guān)節(jié)痛和關(guān)節(jié)腫脹[40]。未來還需要更多且精心設(shè)計(jì)的隨機(jī)對照實(shí)驗(yàn)去對比球狀體ACI與傳統(tǒng)ACI技術(shù)之間以及與其他軟骨治療方法的差異,才能得出其在治療關(guān)節(jié)軟骨缺損上證據(jù)等級更高的臨床結(jié)論。