組織培養法保存新鮮同種異體骨軟骨移植物的研究進展

馬永勝,劉洋,楊文銘,邢煜剛,林啟泰,李澤昊,段王平,衛小春

(山西醫科大學第二醫院骨科,骨與軟組織損傷修復山西省重點實驗室,山西 太原 030001)

關節軟骨(articular cartilage,AC)因無血管和神經的解剖學特性而具有免疫特權,非常適合同種異體移植手術[1]。同種異體骨軟骨移植(osteochondral allograft,OCA)技術治療由骨壞死、剝脫性骨軟骨炎和創傷性損傷等引起的軟骨缺損療效顯著[2-3]。傳統上,OCA技術是在移植物獲取后7 d內植入的,具有較高的軟骨細胞活性,新鮮的同種異體骨軟骨移植物(osteochondral allografts,OCAs)5年生存率已經超過80%[2-4]。然而,OCAs從尸體標本獲取到植入,需要經過取材、處理、保存、細菌學檢測、供體病原檢測等過程,這些至少需要14 d時間,如果涉及到移植物運輸、手術安排等問題,時間窗口會延長到21 d甚至更長時間[5-6]。OCA的臨床結果很大程度上依賴于植入時存活的軟骨細胞量,但軟骨細胞存活率會隨OCAs保存時間的延長而下降[7-9]。有研究表明,移植物細胞存活率70%以下時,術后效果很不理想[10]。如何延長和提高OCAs在體外保存過程中軟骨細胞的活力成為OCAs保存的最大困難。目前,體外保存OCAs的方法有玻璃化法、冷凍法和組織培養法等,其中組織培養法能夠保持軟骨細胞活力,所以廣受臨床醫生的歡迎[11]。組織培養法保存OCAs缺乏系統性的綜述,本文通過對近年來組織培養法保存OCAs的文獻進行回顧和展望,為OCAs的臨床應用提供參考。

1 組織培養法保存OCAs的優勢

目前,體外保存OCAs的方法有玻璃化法、冷凍法和組織培養法。玻璃化保存法是將移植物置于特定的玻璃化溶液中快速降溫固化,通過玻璃化凍存液與水分子發生強烈的水合作用,增加溶液黏性,從而防止移植物細胞內外冰晶形成,有效避免軟骨細胞在降溫和復溫過程中的多種損傷。近年來,OCAs的玻璃化保存已成為日益流行的有效延長離體組織體外保存時間的一種方法[12]。然而,與組織培養法相比,玻璃化保存的OCAs在同種異體骨軟骨移植時表現出較低的軟骨細胞活力[13]。冷凍法可通過冷卻至極低溫度(-80 ℃)有效阻止任何可能對移植物造成損害的化學活動,保存移植物6個月甚至是1年的時間[14]。但軟骨細胞存活率低和細胞外基質(extracellular matrix,ECM)的丟失是其重要的缺陷[15]。低溫冷凍限制了軟骨細胞的活力,OCAs通過組織培養法保存能夠維持軟骨細胞的活力,更適用于臨床[8-9,16]。組織培養法是人工培養具有活性組織的方法,指將移植物放入含營養成分的培養基內,于適宜溫度下保存,以保持OCAs的新鮮水平。組織培養法相對于玻璃化法和冷凍法保存AC,其主要優勢是有效避免了細胞因冷凍而產生的損傷,能保持較高的軟骨細胞存活率和基質含量[13]。由于軟骨細胞活力和ECM含量是同種異體骨軟骨移植成功的關鍵,所以組織培養法保存OCAs具有明顯的臨床優勢。

2 組織培養法保存溶液及各種介質

2.1 保存溶液的選擇

目前,常用的組織培養液有乳酸林格液(ringer lactate solution,RLS)、Eagle最低必需培養液(eagle’s minimum essential medium,EMEM)、Dulbecco改良Eagle培養液(Dulbecco’s modified eagle medium,DMEM)、威斯康星大學溶液(university of Wisconsin,UW)、RPMI 1640培養液和X-VIVO培養液等。RLS是最早用于保存OCAs的保存液,是由電解質和乳酸鹽組成的等滲溶液,雖然在RLS和4 ℃無菌環境保存是最基本的新鮮組織保存方法,但缺乏維持細胞生長的營養,不能有效地支持軟骨細胞新陳代謝,無法長期維持軟骨細胞活性[17]。有學者比較RLS和DMEM/F12基礎培養基保存OCAs,實驗數據表明,OCAs在RLS中保存1周后軟骨細胞存活率顯著下降至70%以下;然而,保存在培養基中的OCAs有較高的軟骨細胞存活率,14 d后軟骨細胞存活率>85%[18]。將OCAs保存液從RLS改進為基礎培養基可以提高移植物軟骨細胞存活率,延長保存時間,具有更好的臨床效果。

2.2 營養介質

為了使軟骨細胞存活更長的時間,基礎培養基必須補充多種營養成分。血清中含有細胞生長所必需的營養成分,在細胞培養和軟骨組織的保存中都有應用。有研究表明,在保存液中加入胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)可以顯著提高軟骨細胞的存活率[19]。此外,Onuma等[20]從大鼠股骨遠端采集的骨軟骨組織樣本,在含有0、1%、10%和50%同種異體血清的UW溶液中保存14 d,結果顯示在含有10%或更高濃度血清的UW溶液中,具有最高的軟骨細胞活力和最低的軟骨細胞退行性變化。也有研究顯示,在富含人血清蛋白的培養基中保存人類的OCAs可以顯著減少軟骨細胞的死亡率[14]。然而,不同批次的血清之間缺乏一致性,存在潛在的免疫反應以及傳染病傳播的風險[21]。

生長因子是存在于生物體內,對生物的生長、發育具有廣泛調節作用的活性蛋白質或多肽類物質。它可以代替培養基中血清高分子物質促進細胞生長,是具有刺激細胞生長活性的細胞因子[22-23]。Mickevicius等[24]發現在培養基中添加胰島素樣生長因子可以提高軟骨細胞的活力,改善軟骨的機電和組織學性能。Sprifermin是一種新型的重組人成纖維細胞生長因子18(human-recombinant fibroblast growth factor-18,rhFGF18),在體外刺激軟骨細胞增殖和基質生成,在體內增加關節軟骨的新生基質形成[25]。Meloni等[25]使用含有rhFGF18的培養基保存牛的OCAs,3周后進行力學檢測和生化分析發現,rhFGF18能促進細胞外膠原蛋白和抑制基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)的產生,保持關節軟骨固有的力學特性。在OCAs保存過程中,營養物質的重要性是毋庸置疑的,添加什么樣的營養介質和如何添加營養介質還需要進一步研究。

2.3 抗凋亡介質

軟骨細胞死亡,尤其是由細胞凋亡引起的軟骨細胞死亡,與軟骨基質降解和骨關節炎的發生有關[24]。細胞凋亡也是OCAs獲取、保存和植入過程中軟骨細胞活力下降的原因之一[26]。研究發現,OCAs保存過程中存在與細胞凋亡相關的靶點,如半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase),Fas受體和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等,這些凋亡相關受體在保存階段的基因表達顯著上升[27]。軟骨細胞有不同的凋亡調節途徑,一氧化氮(NO)途徑在其中占主導地位[26]。有報道稱,N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)可預防NO誘導的軟骨細胞凋亡和退行性改變[28]。Calvo等[26]在NAC富集培養基中保存OCAs,4周后,軟骨細胞存活率高達83.8%。此外有研究表明,AC淺表層細胞凋亡表達最高,在軟骨保存液中添加凋亡抑制劑依那西普,它可以通過抑制TNF-α來阻斷凋亡途徑,增強淺表層軟骨細胞的活力[29]。因此,明確促凋亡基因在OCAs保存過程中的機制,并抑制其表達,保護淺表層細胞,減少移植后軟骨退化,是增強軟骨細胞活力的有效方法。

2.4 抗炎介質

炎癥因子在軟骨移植的作用機制尚未得知,但早有研究提到,在OCAs保存中炎癥因子的表達會顯著升高[27]。Ding等[30]實驗證實,OCAs保存過程中軟骨細胞死亡水平的上升可能導致基質降解及MMP-1,MMP-3,MMP-13等蛋白酶的上調,并提出可以在OCAs保存過程中添加抗炎介質,提高軟骨細胞存活率。從結構上看,AC由ECM和軟骨細胞組成,它們通過平衡MMP及其組織抑制劑(tissue inhibitors of MMP,TIMP)的產生來維持ECM的穩態。在軟骨保存液中加入抗炎介質可能是增強軟骨細胞活力的又一發展途徑。

3 組織培養法的保存環境

3.1 溫度

溫度的選擇一直是眾多學者爭論的話題,不同溫度產生不同的OCAs保存效果。組織培養法保存OCAs常用溫度主要為4 ℃、25 ℃和37 ℃,根據不同的保存方案選擇不同的保存溫度,可以延長軟骨細胞活力,得到更好的長期保存效果。

4 ℃保存一直是組織庫中OCAs的標準保存方法,具有微生物感染風險低、細胞代謝率低、保存成本低等優點[31]。de Sousa等[14]把人軟骨組織保存在培養基中,分別存放在4 ℃和37 ℃環境中,14 d后發現37 ℃保存的軟骨細胞死亡率是4 ℃保存的2倍。Harb等[32]實驗同樣證實,4 ℃保存比37 ℃保存有更好的軟骨細胞存活率。但移植過程中,OCAs從保存溫度向體溫轉變的代謝反應也可能是導致移植失敗的機制之一,相比于37 ℃,在4℃長期保存并植入體內,細胞環境變化巨大,可能會對軟骨細胞產生意料之外的損傷[33]。

膝關節運動時的生理溫度大約為33 ～39 ℃,因此37 ℃保存OCAs對軟骨組織的長期維護可能更適合[34]。有研究表明,4 ℃冷藏保存的OCAs,軟骨細胞生存能力低于37 ℃保存,因此生理溫度更有利于軟骨細胞存活[7]。AC淺表層是軟骨最敏感和脆弱的區域,早期軟骨退化最明顯,特別是淺表層軟骨細胞的喪失,可能會導致臨床移植失敗[4]。有研究發現37 ℃保存OCAs不僅提高了軟骨細胞活力和基質含量,而且保護了軟骨淺表層細胞,因此37 ℃環境下保存OCAs可能會成為未來組織保存的優先選擇[35]。然而,37 ℃環境下保存OCAs具有細胞代謝率高,營養需求多及細菌感染風險高等缺點。

Stoker等[10]認為4 ℃保存不利于軟骨細胞生長,37 ℃保存可能會增加細菌和真菌的污染,25 ℃更有利于OCAs的保存,并以此開發了密蘇里州同種異體骨軟骨移植的保存系統(Missouri osteochondral allograft preservation system,MOPS)。MOPS保存方案與標準保存方案相比,保存時間明顯延長,保存效果更好[10]。但是25 ℃保存OCAs研究較少,未知領域較多。

3.2 氣體

外部環境對OCAs保存具有很大的影響,在不同的氣體環境下,OCAs保存效果也有顯著的差異性。相關研究報道了CO2、H2和O2在OCAs保存中的不同作用[7,36-37],為OCAs的保存環境提供更多的選擇。

CO2在OCAs保存過程中是影響培養基pH的重要變量,5% CO2能將培養基的pH值維持在7.35～7.45之間,如果沒有足夠的CO2,會導致培養基酸堿失衡,從而影響軟骨細胞活力[24,35]。Dontchos等[36]將牛的OCAs放入已添加DMEM培養基的圓底試管中,試管分別在大氣環境或5% CO2環境中孵育20 min,密封后于4 ℃冷藏室保存。14 d后數據顯示,OCAs預先在5% CO2中的平衡可使pH正常化,并降低淺表層軟骨細胞的死亡率,而大氣環境中預平衡,冷藏期間培養液pH升高,導致軟骨細胞存活率降低。因此,添加CO2可能是減少保存期間軟骨細胞死亡的有效選擇[24,35-36]。

另一種有前途的保存OCAs軟骨細胞活性的方法是在保存液中添加H2,這種氣體具有抗炎、抗凋亡和抗氧化的特性[38-39]。有實驗研究證實,保存液中加入氫分子可以提高心臟、腎臟等器官或組織的體外保存效果,同時氫分子減輕冷藏期間同種異體移植物的缺血再灌注損傷,并改善早期移植的組織功能,提高移植后的細胞存活率[40]。Yamada等[37]采用富含氫的無血清培養基在4℃環境下保存大鼠的骨軟骨移植物,21 d后數據顯示,富含氫的培養基可以提高軟骨細胞的活力。Han等[5]比較不加氫氣的DMEM溶液,和分別添加氫氣濃度為0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.8 mmol/L的DMEM溶液,4 ℃保存28 d,實驗數據顯示添加氫氣的DMEM組軟骨細胞存活率更高,其中氫濃度為0.8 mmol/L保存效果最好。因此,H2對離體組織培養具有保護作用,是保存OCAs的新選擇。

O2是人體進行新陳代謝的關鍵物質,是人體生命活動的第一需要。Denbeigh等[7]在無血清的培養基中放入人的OCAs,然后分別保存在21% O2和2% O2的環境中,實驗結果顯示氧含量的變化沒有顯著影響軟骨細胞的活力。在人體內OCAs缺乏血液供應,關節腔相對密閉,導致軟骨細胞處于一個低氧環境,為了適應這種環境,軟骨細胞產生了一系列的低氧相關分子[10]。有研究發現,關節腔O2微環境改變,是骨關節炎發生的關鍵環節,維持軟骨下骨低氧微環境可有效延緩骨關節炎進展[41]。因此,O2濃度是否在OCAs體外保存時對軟骨細胞產生影響,還需要進一步研究。

4 組織培養液的更換頻率

合適的OCAs保存液更換頻率可以維持保存過程中軟骨細胞的活性,同時有利于降低組織庫保存的成本及組織污染的概率。Stoker等[10]比較了保存期間7 d更換一次培養基和不更換培養基對軟骨細胞存活率和ECM的影響,結果提示,培養基的更換沒有對軟骨細胞活力和ECM產生影響。然而,Qi等[31]發現2 d更換一次保存液,可以明顯提高軟骨細胞存活率。保存溶液的更換頻率和OCAs的體積及保存液的容積密切相關,不同的移植物體積與培養液容積比,會產生不同的更換頻率,但關于這一點目前還沒有更進一步的研究。不同動物之間及動物和人類之間,軟骨細胞需要的營養環境是否相同值得深思。在OCAs保存期間不更換保存液會降低細菌感染率,但可能會導致軟骨細胞所需營養缺乏和代謝廢物堆積,從而降低軟骨細胞活性[31]。OCAs保存液合理更換是維持軟骨細胞活力的重要因素。

5 淺表層軟骨細胞在OCA中的重要性

OCA技術修復大型動物模型時,冷凍OCAs在移植術后6個月關節表面明顯不規則,而新鮮OCAs表面平滑[42]。這種現象可能與軟骨軟化和淺表層細胞減少有關[43]。因此,軟骨表面的健康狀況可能是術后功能恢復的一個關鍵指標,在骨軟骨組織新鮮保存過程中維持淺表層軟骨細胞活力至關重要。此外,軟骨淺表層還擁有抵抗關節腔內剪切應力和降低關節摩擦力的作用[44]。淺表層軟骨細胞的丟失增加了退行性變的速度,相應的軟骨基質蛋白的丟失也隨之增加[29]。因此,體外保存時,保護淺表層軟骨細胞的活性將有利于提高OCAs移植后的生存率,維持軟骨的生理功能和機械性能的完整性。

6 總結與展望

OCAs保存液的研發可以延長保存期間軟骨細胞活性,使其達到手術前移植的標準(存活率>70%)。目前,已有OCAs保存液進入臨床或商業應用[45-49]。盡管該領域取得了一些研究進展,但尚不清楚軟骨保存的最佳方案。而且,OCAs的最佳保存條件缺乏臨床證據,需要進行更多的基礎實驗和臨床轉化研究分析如何保持軟骨細胞的活性和軟骨基質的完整性,增強OCAs的體外保存效果,提高OCA手術成功率[7,10]。

淺表層軟骨細胞的存活與否,與移植軟骨的整體細胞活力息息相關。有研究發現,淺表層的軟骨細胞會分泌一種潤滑素——蛋白多糖-4(proteoglycan 4,PRG4)來維持低摩擦的關節表面,該區域軟骨細胞的死亡可能會在OCAs植入后產生有害影響[50-52]。軟骨細胞活性存在區域差異,在保存時,與中層和深層相比,淺表層的軟骨細胞最先發生死亡[13]。Ball等[18]也觀察到類似的趨勢,移植物的淺表層細胞活力在保存7 d時已經開始下降。考慮到淺表層具有抵抗剪切應力和分泌蛋白多糖-4將關節摩擦降至最低水平的作用,該區域軟骨細胞丟失的影響不可低估[35,51]。因此,在OCAs保存過程中,軟骨細胞淺表層區域損傷或退變后,其分泌的蛋白多糖-4減少,可能是導致OCAs移植失敗的關鍵因素。目前已有研究發現,不同的溫度、氣體和保存液介質對淺表層軟骨細胞的保存效果均有影響且各不相同[29,35-36],在未來,組織培養法保存OCAs應該從不同的方向,對軟骨淺表層細胞的存活率及ECM的完整性進行研究,即從淺表層著手解決OCAs植入后軟骨退化問題,增加其植入后的存活率,使同種異體骨軟骨移植更廣泛應用于臨床。