兩種酵母對葡萄酒揮發性物質的影響

陳佳富　熊麗娜　朱江潤　付鴻博

摘 要：【目的】分析不同酵母對葡萄酒中揮發性物質的影響，并篩選適宜濃度。【方法】選擇安琪活性葡萄酒專用酵母和大曲谷物酒酵母，將兩種酵母分別設定3種濃度（100、150和200 mg/L）對葡萄進行發酵。采用頂空固相微萃取技術（HS-SPME）提取葡萄酒的揮發性物質，并用氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）對其進行分析。【結果】所有處理中共有155種揮發性物質被鑒定，可將其分成9大類，包括烷烴類、烯烴類、醇類、酚類、醛類、酮類、酸類、酯類和其他類，其中酯類物質數量最多有42種；安琪酵母和大曲酵母發酵處理分別有117種和95種揮發性物質被鑒定到，無論是安琪酵母還是大曲酵母均是在200 mg/L時可鑒定到更多的揮發性物質；在6個處理中均能檢測到的揮發性物質共有22種；利用安琪酵母發酵得到1種特異性物質為辛酸異戊酯，大曲酵母發酵后沒有特異性物質；6個處理之間相比，每個處理之間均存在特異性物質。通過相對定量分析后發現，相對含量較高的為醇、酸和酯類物質，其中異戊醇為主要的醇類物質，乙酸乙酯為最主要的酯類物質。【結論】本研究為不同葡萄酒釀造過程中適宜酵母種類和濃度的選擇提供了一定的參考依據。

關鍵詞：安琪酵母；大曲酵母；葡萄酒；主成分分析；乙酸乙酯

文章編號：2096-8108（2024）03-0045-08 中圖分類號：S663.1中圖分類號 文獻標識碼：A文獻標志碼

Effects of Two Yeasts on Volatile Substances in Wine

CHEN? Jiafu1，2，XIONG? Lina1，ZHU? Jiangrun1，FU? Hongbo1*

（1.College of Biological and Agricultural Sciences， Honghe University， Key Laboratory for Research and Utilization of Characteristic Biological Resources in Southern Yunnan， Mengzi Yunnan 661199，China; 2.College of Horticulture Hunan Agricultural University， Changsha Hunan 410128，China）

Abstract： 【Objective】 The effects of different yeasts on volatile substances in wine were evaluated， and the appropriate concentration was screened.【Methods】Angel active wine yeast and Daqu grain wine yeast were selected， and three concentrations （ 100， 150 and 200 mg / L ） of each yeast were set for grape fermentation. The volatile substances of in grape fermentation were extracted by headspace solid phase microextraction （ HS-SPME ） and analyzed by gas chromatography-mass spectrometry （ GC-MS ）.【Results】A total of 155 volatile substances were identified in all treatments， which could be classified into nine types， including alkanes， alkenes， alcohols， phenols， aldehydes， ketones， acids， esters， and others， with the largest number of esters being 42. 117 and 95 volatile substances were identified by fermentation with Anqi yeast and Daqu yeast， respectively. Both Anqi yeast and Daqu yeast could identify more volatile substances at 200 mg/L. A total of 22 volatile substances were detected in 6 treatments. One specific volatile substance was obtained as isobutyl acetate using the fermentation of Anqi yeast compared with that of Daqu yeast， and no specific volatile substance was obtained after the fermentation of Daqu yeast. Compared between the six treatments， there were specific substances between each treatment. Through relative quantitative analysis， it was found that the relative contents of alcohols， acids and esters were higher， among which isoamyl alcohol was the main alcohol and ethyl acetate was the main ester. 【Conclusion】This study provided a reference for the selection of suitable yeast types and concentrations for different wine fermentation.

Keywords：anqi yeast; daqu yeast; wine; principal component analysis; ethyl acetate

葡萄（Vitis vinifera）作為一種古老的樹種，栽培歷史已有5 000年左右［1］。它也是世界上種植最早、分布最廣、栽培面積最大的果樹樹種之一［2］。西班牙和意大利分別是世界上葡萄種植面積最大和葡萄酒生產最大的國家［3］。

在長期的栽培歷史中，育種家通過不懈的努力，培育出大量葡萄新品種，目前，歐洲葡萄已有5 000多個品種，其果實除鮮食外，還可用作加工，制成葡萄酒或葡萄醋等［4-5］。葡萄成熟后落在地上，由于自然擠壓和破碎，果汁和果皮接觸到天然酵母后，開始發酵，這就是第1種葡萄酒的制作方法。葡萄酒因其令人陶醉的口感、優雅的香氣和強烈的酸味，不僅能給人們帶來愉悅的心情，而且對人類健康起著巨大的作用［6］。

發酵過程中所產生的揮發性物質是葡萄酒中主要的呈香物質［7］。葡萄酒發酵過程中產生的香氣和風味的數量和質量取決于許多條件，例如環境、釀造過程和所選擇發酵的酵母［8］。酵母是釀酒過程中的主要微生物［9］，自古以來，酵母就被用于生產酒精飲料，包括葡萄酒、啤酒和谷物酒［10］。作為人類使用的第1種微生物，酵母最早被記錄為公元6 000年在埃及生產的布扎酸啤酒。目前，酵母已成為人類非常有用的微生物。其主要特點是，它能有效地將高濃度糖轉化為醇類和感官［11］。作為一種重要的發酵產物，這些物質使酒精飲料散發出香味。這些香氣的產生是各種酵母相互作用的結果，酵母多樣性直接決定了葡萄酒風味和呈香［8］。由于酵母細胞壁的吸附能力不同，酵母會影響葡萄酒中的有益和有害物質［12］。酵母產生的胞外酶可能為葡萄酒提供其生產區域特有的特性［13］。酵母菌的代謝還產生大量的副產品，例如甘油、乙酸、琥珀酸和乳酸。此外，高級醇和其他揮發性物質的產生會嚴重影響葡萄酒的芳香特性。此外，作為一種活生物體，酵母含有多種酶系統，它們對葡萄酒質量起著重要作用［14］。

酵母是果品釀造的核心和關鍵，對果品釀造后的葡萄酒精度和色澤有很大影響。通過選擇不同的酵母菌株并將其添加到發酵基質中，它們可以在基質中繁殖并引起酒精發酵，由此獲得的葡萄酒發酵完全，無殘留糖或低含量，酒精度略高，易于儲存［4］。因此，選擇能產生最受歡迎的香氣和風味的酵母菌株對葡萄酒釀造非常重要。本研究選擇不同濃度的安琪活性葡萄酒專用酵母和大曲谷物酒酵母對葡萄進行發酵，并對葡萄酒揮發性物質進行測定，分析酵母濃度和種類與葡萄酒揮發性物質之間的聯系，對生產出具有目標消費者群體預期的風味和香氣特征的葡萄酒具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 樣品提取

試驗所用材料為‘早黑寶葡萄，于2019年8月15日采自山西農業大學，將完全成熟的葡萄果實去梗，保留果皮，進行榨汁處理，得到葡萄汁。將葡萄汁轉入發酵罐，在每個發酵罐中加入濃度為20 mg/L的SO2 （Na2SO3），混勻后在25 ℃下靜置12 h，選擇兩種酵母，即安琪活性葡萄酒專用酵母（安琪酵母股份有限公司）和大曲谷物酒酵母（山西紫林醋業股份有限公司），將每種酵母分別設定為3種濃度（100、150和200 mg/L），在25～28 ℃發酵12 d，得到葡萄酒。分別采集20～30 mL葡萄酒樣品。將每個樣品以8 000×g離心10 min后收集5 mL上清液用于頂空固相微萃取（HS-SPME）提取。

1.2 揮發性物質測定

測定時間為2019年12月31日。頂空固相微萃取和氣相色譜/質譜條件：首先，在40 ℃條件下，將DVB/CAR/PDMS萃取纖維頭插入樣品中吸附30 min；然后，將萃取纖維頭置于GC入口處解吸5 min；隨后，解吸完后自動進樣進行GC-MS分析，其中GC-MS分析使用色譜柱（HP-5MS），進樣口溫度為280 ℃。加熱過程中：初始溫度＜40 ℃保持3 min，以5 ℃/min的速度升至180 ℃并保持1 min，隨后以10 ℃/min的速度升至270 ℃并保持5 min。載氣為高純氦氣，流量為1 mL/min，進氣分流比為20∶1。

1.3 數據分析

數據分析、主成分分析和作圖使用Microsoft Excel v. 2007、Statistical Analysis System v. 9.2和OriginPro 9.0進行。

2 結果與分析

2.1 葡萄酒揮發性物質類別分析

采用氣相色譜-質譜聯用儀（GC-MC）分析了兩種酵母在不同發酵濃度下葡萄酒樣品的揮發性物質。葡萄酒中的揮發性物質共鑒定到155種，可將其分為9類（見表1），包括烷烴類、烯烴類、醇類、酚類、醛類、酮類、酸類、酯類和其他類。其中酯類物質鑒定到42種，數量最多，占總數量的27.10%，其次為烷烴類物質有28種。酚類物質數量最少鑒定到3種，只占總數量的0.02%。比較安琪酵母和大曲酵母發酵后對葡萄酒揮發性物質類別的數量影響可以發現，所鑒定的揮發性物質的數量有著明顯差異。安琪酵母發酵后共鑒定出117種揮發性物質，明顯高于大曲酵母發酵后鑒定出的95種揮發性物質，這種數量上的差異可能是由于用安琪酵母發酵可獲得更多的酯類物質（35種），而用大曲酵母發酵鑒定到的酯類物質明顯較少（23種）。用安琪酵母發酵后可獲得更多數量的烷烴類、醇類、酚類、醛類、酸類、酯類和其他類物質，用大曲酵母可獲得更多的烯烴類和酮類物質。兩種酵母在濃度相同的情況下，安琪酵母發酵后所鑒定到的揮發性物質數量也明顯高于大曲酵母。隨著安琪酵母濃度的增加，揮發性物質的數量先減少后增加，濃度為200 mg/L時揮發性物質數量最多有71種，濃度為150 mg/L時揮發性物質數量最少有63種。大曲酵母則是隨著酵母濃度的升高揮發性物質數量逐漸增加，當酵母濃度為200 mg/L時，可獲得較多的揮發性物質（62種），當酵母濃度為100mg/L 時，揮發性物質數量較少（52種）。酵母的種類和濃度對葡萄酒中揮發性物質的數量有很大的影響。

2.2 葡萄酒揮發性物質相對含量分析

在用安琪酵母發酵條件下，醇、酸和酯類物質的相對含量較高（見表2）。其中，醇類物質含量在3個濃度安琪酵母發酵后均超過30%，隨著濃度的升高，醇類物質含量表現為先升高后降低的趨勢，在150 mg/L時，含量最高為35.26%；在200 mg/L時，含量最低為30.42%。酸類物質含量隨著安琪酵母濃度的升高表現也表現為先升高后降低的趨勢，在150 mg/L時，含量最高為31.58%；在100 mg/L時，含量最低為24.26%。酯類物質含量隨著安琪酵母濃度的升高而降低，在100 mg/L時。含量最高為35.70%；在200 mg/L時，含量最低為24.81%。另外6類物質含量均較低，尤其是酚類和酮類物質均低于1%，當安琪酵母濃度為100 mg/L和150 mg/L時，沒有檢測到酚類物質。

在用大曲酵母發酵條件下，同樣是醇、酸和酯類物質的相對含量較高（見表2），隨著濃度的變化規律與安琪酵母發酵時存在差異。其中醇類和酯類物質含量在3個濃度大曲酵母發酵后均超過30%，醇類物質含量隨著大曲酵母濃度的升高表現為逐漸降低的趨勢，在100 mg/L時，含量最高為38.62%；在200 mg/L時，含量最低為30.04%。酯類物質含量隨著大曲酵母濃度的升高表現為先降低后升高的趨勢，在200 mg/L時，含量最高為40.63%；在150 mg/L時，含量最低為31.46%。酸類物質的含量隨著大曲濃度表現為先升高后降低的趨勢，在150 mg/L時，含量最高為32.99%；在100 mg/L時，含量最低為20.38%。另外6類物質含量均較低，其中酚類、醛類和酮類物質含量均低于1%，當大曲酵母濃度為100 mg/L時沒有檢測到酮類物質，當大曲酵母濃度為150 mg/L沒有檢測到酚類物質。

比較兩種酵母在濃度相同的情況下揮發性物質相對含量可以發現，安琪酵母在3個濃度下所獲得的烷烴類、烯烴類和其他類物質的含量均高于大曲酵母，大曲酵母在3個濃度下所獲得的酯類物質的含量均高于安琪酵母。結合表1和表2綜合分析可以發現，在兩種酵母發酵條件下，酸類和醇類物質的數量均少于10種，但相對含量均較高，而烷烴類物質的數量均超過10種，但相對含量較低。安琪酵母在三個濃度下所鑒定到的酯類物質的數量均多于大曲酵母，但相對含量均低于大曲酵母。說明葡萄酒中的物質數量與相對含量無相關性。

2.3 不同酵母菌對葡萄酒揮發性物質的影響

將在葡萄酒中鑒定到的155種的揮發性物質以相對含量大于0.1為準則進行篩選，共獲得42種主要的揮發性物質（見表3），包括烷烴類物質9種、烯烴類物質5種、醇類物質7種、醛類酚類酮類物質各1種、酸類物質4種、酯類物質11種和其他類物質3種。醇類的7種物質中，異戊醇的相對含量在6個處理中均最高，尤其是大曲酵母濃度為100 mg/L時，最高達38.14%。6個處理中當安琪酵母濃度為200 mg/L時，異戊醇含量最低（18.16 mg/L），但該處理下正戊醇含量較高為10.13%。酸類的4種物質中，含量最高的包括草酸和2-（氨基氧基）乙酸，其中草酸含量最高出現在安琪酵母（100 mg/L）、大曲酵母（100 mg/L）和大曲酵母（200 mg/L），且后2個處理沒檢測到2-（氨基氧基）乙酸。2-（氨基氧基）乙酸含量最高出現在安琪酵母（150 mg/L）、安琪酵母（200 mg/L）和大曲酵母（150 mg/L），同時這3個處理均沒檢測到草酸。酯類的11種物質中，乙酸乙酯的相對含量最高，是最重要的酯類物質。但兩種酵母發酵后乙酸乙酯的含量差異較大，安琪酵母發酵后所獲得的乙酸乙酯的相對含量要明顯低于大曲酵母。尤其是安琪酵母濃度為150 mg/L和200 mg/L時，乙酸乙酯的含量均低于10%，這也直接影響了酯類物質總含量偏低（見表2）。

將所鑒定到的155種揮發性物質進行Venn圖繪制（見圖1）。結果表明：在6個處理中均能檢測到的揮發性物質共有22種，其中烷烴類和酯類的數量較多分別為7種和5種。醇類和酯類物質中重要的異戊醇和乙酸乙酯兩種物質也均在6個處理中鑒定到。安琪酵母和大曲酵母發酵后相比，利用安琪酵母發酵得到1種特異性物質為辛酸異戊酯，大曲酵母發酵后沒有特異性物質。6個處理之間相比，每個處理之間均存在特異性物質，當安琪酵母濃度為100、150、200 mg/L和大曲酵母濃度為100、150、200 mg/L時分別得到的特異性物質有18、7、21、9、9和15種。當安琪酵母濃度為200 mg/L時所獲得的特異性物質最多，其中酯類物質占比最大。

2.4 主成分分析

基于不同發酵條件的主成分分析結果確定了兩個主成分，解釋了葡萄酒中揮發性物質總變量的99.26% （見圖1-a）。第一主成分占總變量的96.58%，與葡萄酒發酵處理具有較大的正相關值，表明這些處理對Prin1的貢獻顯著。第二主成分占總變量的2.68%。通過繪制主成分散點圖（見圖1-a）發現，第一主成分較大的為醇類，其次是酯類和酸類，但由于這3類物質的第二主成分差異較大，因此被明顯分離。其他6類揮發性物質包括烷烴、烯烴、酮類、酚類、醛類和其他類，由于第一和第二主成分差異均較小，可分為一組。

基于不同揮發性物質類型的相對含量的主成分分析結果確定了兩個主成分，解釋了葡萄酒中揮發性物質總變量的94.14% （見圖1-b）。第一主成分占總變量的77.23%，與酯類物質含量具有較大的負相關值，與酸類物質含量具有較大的正相關值。第二主成分占總變量的16.91%，與醇類物質具有較大的負相關值。通過繪制主成分散點圖（見圖1-b）發現，安琪酵母發酵后更容易獲得相對含量更好的酸類物質，大曲酵母發酵后更容易獲得相對含量較高的酯類物質。6個處理均被明顯的分離，說明酵母種類和酵母濃度均對揮發性物質含量具有較大的影響。

3 討論

本研究的目的是分析不同酵母對葡萄酒中揮發性物質的影響，并篩選適宜濃度。有關這一主題的文獻表明，酵母菌種類以及每個種類中的不同菌株在揮發性物質方面有很大差異［15］。選用兩種酵母QA23和OKAY發酵的3個品種干白葡萄酒中的主體香氣成分濃度因酵母和葡萄品種的不同而有很大差異［8］。在不同菌株發酵赤霞珠干紅葡萄酒酒樣中共檢出56種揮發性香氣物質，其中SC酒樣37種，PK1酒樣41種，PK2酒樣44種，PK3酒樣39種，包括16種酯類、19種醇類、9種醛類、7種酸類、2種酮類和3種萜烯類，各混合發酵酒樣組間除酸類物質之外，其他揮發性物質組成之間均存在顯著差異［9］。選擇ADT、CECA、NSD和VIC酵母發酵無核寒香蜜葡萄酒中分別檢出39、39、28和26種揮發性物質［16］。因此，酵母引起的發酵香氣是造成成分以及味道上的巨大差異的原因。本研究選擇了兩種酵母，分別為安琪活性葡萄酒專用酵母和大曲谷物酒酵母，安琪酵母被稱為國產葡萄酒的新動力，1996年10月通過專家鑒定并迅速在全國諸多葡萄酒、果酒廠推廣應用并且取得了良好的效果［17］。大曲谷物酒酵母屬于釀酒酵母，目前將其在葡萄酒發酵中的研究較少。本研究結果表明用安琪酵母和大曲酵母發酵分別有117種和95種揮發性物質被鑒定到，其中均是酯類物質的數量較多，且比前人研究中所鑒定到的揮發性物質更多。兩種酵母在濃度相同的情況下，安琪酵母發酵后所鑒定到的揮發性物質數量也明顯高于大曲酵母。同時，隨著安琪酵母濃度的增加，揮發性物質的數量先減少后增加，濃度為200 mg/L時揮發性物質數量最多；濃度為150 mg/L時揮發性物質數量。大曲酵母則是隨著酵母濃度的升高揮發性物質數量逐漸增加，當酵母濃度為200 mg/L時，可獲得較多的揮發性物質；當酵母濃度為100 mg/L時，揮發性物質數量較少。說明，酵母的種類和濃度對葡萄酒中揮發性物質的數量有很大的影響，安琪酵母與大曲酵母相比可獲得更多數量的揮發性物質。

氣相色譜-質譜法鑒定的大多數揮發性化合物對香氣的呈現沒有有效的貢獻，只有少數揮發性化合物對特征性香氣的呈現有顯著的貢獻［18］。因此，揮發性物質的類型和相對含量不能直接描述它們對風味的貢獻程度，酯類是眾所周知的花香和成熟果香的貢獻者，酯類也是酒精發酵的典型副產品，并且是大多數酒精飲料，特別是葡萄酒的香氣形成所必需的［19］。發酵香氣產生令人愉快的水果味，主要成分是乙酸己酯、乙酸乙酯和乙酸異戊酯的混合物［20］。選擇畢赤克魯維酵母HSX-5、長孢洛德酵母MNS-6和戴爾有孢圓酵母YQX-8與釀酒酵母AWRI 796混合發酵赤霞珠葡萄酒的研究結果表明：相較于釀酒酵母單菌發酵酒樣，菌株HSX-5和YQX-8混合發酵酒樣中己酸乙酯提升了2倍，菌株HSX-5、YQX-8、MNS-6混合發酵酒樣中的辛酸乙酯和乙酸乙酯含量增加［9］。選擇4種商業酵母分別為VIC、ADT、CECA、NSD對無核寒香蜜葡萄進行發酵后發現，酵母ADT發酵可顯著增加葡萄酒中酯類含量，VIC發酵葡萄酒中萜烯類含量增加，CECA發酵葡萄酒醇類含量多［16］。本研究結果發現，葡萄酒中的主要物質為酯類、酸類和醇類。安琪酵母發酵后酸類物質含量較高，且隨著安琪酵母濃度升高，酸類物質的含量先升高后降低，濃度在150 mg/L時酸類物質含量最高。大曲酵母發酵后酯類物質含量較高，且隨著大曲酵母濃度的升高而逐漸升高，酯類物質含量在大曲酵母濃度為200 mg/L時最高。綜上，不同類型的酵母及不同濃度的酵母均對揮發性物質的數量和含量有著巨大的影響。

4 結論

本研究所有處理中共鑒定出155種揮發性物質，葡萄酒中的主要醇類和酯類物質分別為異戊醇和乙酸乙酯。在安琪酵母和大曲酵母發酵的葡萄酒中，分別鑒定出117種和95種揮發性物質；兩種酵母在濃度相同的情況下，安琪酵母發酵后所鑒定到的揮發性物質數量也明顯多于大曲酵母，利用安琪酵母發酵后可獲得更多的特異性揮發性代謝物，因此，安琪酵母發酵后的葡萄酒可獲得更多種類的揮發性物質。所鑒定到的物質可分為9類，通過相對含量和主成分分析，葡萄酒中的主要物質為酯類、酸類和醇類。安琪酵母發酵后酸類物質含量較高，大曲酵母發酵后酯類物質含量較高。酵母的種類和濃度對葡萄酒中揮發性物質的數量和相對含量均有較大的影響。

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收稿日期：2024-03-10

基金項目：紅河學院大學生創新訓練項目（CX2022173）；紅河學院科研基金博士專項項目（XJ22B12）

第一作者簡介：陳佳富（2002-），男，碩士，主要從事園藝植物次生代謝物研究。E-mail：chenjfu616@163.com

*通信作者：付鴻博（1987-），男，講師，博士，主要從事果樹種質資源創新利用與分子育種工作。E-mail：113311168@qq.com