孟德爾隨機化分析方法在非酒精性脂肪性肝病病因探索中的應用

郭紫薇， 武慶娟， 葉永安， 陳蘭羽， 呂文良

1 中國中醫科學院廣安門醫院感染疾病科， 北京 100053

2 北京中醫藥大學東直門醫院脾胃科， 北京 100700

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是指除外酒精和其他明確肝損傷因素所致的以肝細胞內脂肪過度沉積為主要特征的臨床病理綜合征［1-3］。近期發表的一項納入120余萬人的系統評價和薈萃分析報告［4］指出，NAFLD正影響著全球約30%的人群，且影響范圍仍有擴大趨勢。2023年，歐洲肝病學會（EASL）提出將NAFLD更名為代謝功能障礙相關脂肪性肝病（metabolic dysfunctionassociated steatotic liver disease，MASLD）［5］。NAFLD的發病機制是一個復雜的過程，涉及多種因素的相互作用，如胰島素抵抗、氧化應激、炎癥因子、腸道菌群失調等，而遺傳因素也被證明影響NAFLD的疾病進展，這種影響被認為是遺傳變異和環境因素之間相互作用的結果［6］。

近年來，基于全基因組關聯研究（genome-wide association study，GWAS）的大樣本的孟德爾隨機化（mendelian randomization，MR）研究方法越來越廣泛地應用于多種疾病的高危因素探索中，其采用單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphisms，SNP），也就是遺傳變異作為工具變量（instrumental variables，IV），對風險因素和疾病之間進行因果推斷［7-8］。隨著肝病領域多項大規模GWAS的公開發布，使得利用MR方法進行相關慢性肝病危險因素的評估成為可能，且探索NAFLD的病因和高危因素具有重要臨床意義。本文將圍繞目前MR方法及其在NAFLD的病因探索中的應用進行綜述，從而為NAFLD的病因學研究和預防策略提供依據。

1 MR研究簡介

隨機對照研究（RCT）在循證醫學中證據級別最高［9］，其核心在于隨機分組，可最大程度地避免臨床試驗設計及實施中可能出現的各種偏倚，平衡混雜因素，提高統計學檢驗的有效性等優勢［10］。然而，由于其受到倫理學、受試者依從性、研究期限等因素的制約，理想的設計和實施存在一定差距。另外，RCT中納入排除標準的限制可能導致研究樣本與真實世界的人群出現異質性，致使研究結論的外推性也有待驗證［11］。傳統觀察性研究的方法原則為非干預性、非隨機化，因受大量混雜和反向因果干擾，結論無法推斷因果［12］。為克服上述問題，MR引入計量經濟學中IV法的思想，其基于全基因組測序數據，以遺傳變異作為IV，用于揭露結局與暴露之間的因果關系。該研究方法以孟德爾遺傳定律為基礎，在減數分裂過程中，遺傳變異隨機分配到子代中，并且在此后保持不變，這使得其相比于傳統的觀察性研究，更少受到混雜與偏倚因素的干擾［13］。1986年，Katan［14］提出不同等位基因決定了不同載脂蛋白E亞型，進而通過調控膽固醇水平的高低影響人群中癌癥發病率的差異，是MR概念的雛形。2004年，Thomas和Conti［15］提出使用遺傳信息作為IV來進行流行病學的因果推斷的模型有效性。IV的選擇需要滿足3個基本條件：（1）關聯性假設，即IV和暴露因素相關；（2）獨立性假設，即IV與暴露因素和結局之間的混雜因素無關；（3）排他性假設，即IV只能通過暴露因素影響結局。利用遺傳變異作為IV的主要優勢在于：遺傳變異的形成獨立于社會環境、生活習性和其他性狀，這一特性保證了各個混雜因素在遺傳變異的不同亞組間的均衡性，理論上避免了混雜因素的影響；另一方面，遺傳變異的形成先于環境暴露、混雜及疾病結局的發生及水平變化，由遺傳變異作為暴露的IV所解釋的暴露變異亦先于結局，由此排除了逆向因果問題［10，16］。

早期的MR研究通常在小樣本人群中的觀察性研究中進行，且僅使用了少量的遺傳變異，這使得MR研究的效力較低。然而，隨著生物學界發現了大量與特定性狀緊密相關的遺傳變異，以及數十萬個暴露和疾病與遺傳變異相關的GWAS匯總數據的公開發布，使這一領域發生了一場革命。近十年來，MR分析已成為醫學領域尤其是流行病學病因探索研究的熱門統計學技術，不僅為多種復雜疾病的病因及治療提供科學依據，還為新藥研發、公共衛生決策的制定提供了參考與指導［17］。

2 MR在NAFLD病因中的探索

2.1 驗證疾病或病理狀況與NAFLD發生風險的因果關系 既往流行病學研究［18-19］提示，NAFLD可顯著增加心血管疾病、慢性腎病、肝外腫瘤等常見慢性病的發病風險。NAFLD是這些疾病的“病因”之一，還是僅為此類疾病發病過程中的一個伴隨狀態，目前仍不清楚。MR在NAFLD病因的探索中，一定程度上確定和排除了一些疾病或病理狀況與NAFLD發生風險的因果關系。如關于NAFLD在冠狀動脈疾病（CAD）的發病機制中是積極的貢獻者還是無辜的旁觀者，一直存在爭議。陳興棟團隊［20］利用GWAS匯總數據，構建出一套MR分析框架，系統分析NAFLD與34種常見肝外疾病的因果關聯。為了篩選合格的IV，研究人員共進行3輪MR分析，并發現NAFLD與2型糖尿病、高血壓、心肌梗死、老年癡呆等9種疾病存在顯著且穩健的因果關聯。Ren等［21］通過雙樣本MR分析，以評估遺傳預測的NAFLD與CAD風險之間的關系，該研究結果顯示，在排除與極低密度脂蛋白（VLDL）分泌受損相關的遺傳變異后，遺傳預測的NAFLD和CAD之間存在強相關。此外，呂國悅等［22］首次采用英國生物銀行約30多萬人的數據，通過MR法評估肌減少癥相關指標（肌肉量和握力）和NAFLD的關系。該研究結果發現，肌肉量和握力的下降和NAFLD的嚴重程度密切相關，并提示運動能力的改善可有效緩解NAFLD的嚴重程度。然而，該研究提示的只是一種相關關系，而非因果關系，在一定程度上表明MR研究的暴露水平是由遺傳變異決定的，并不等價于傳統的暴露，因此MR研究可能容易獲得陰性結果。近期還有研究發現NAFLD與多囊卵巢綜合征（PCOS）之間存在關聯，但這種關聯的因果性質仍不確定。Liu等［23］基于“肝-卵巢軸”，采用雙向MR分析，檢驗NAFLD和PCOS之間的因果關系。該研究表明，遺傳預測的NAFLD與患PCOS的高風險有關，其中，空腹胰島素和性激素可能介導NAFLD和PCOS之間的聯系，但反之證據較少。有研究［24］試圖在大型隊列中使用雙樣本MR分析方法探索NAFLD是否會增加患重癥新型冠狀病毒感染（COVID-19）的風險。該研究中單變量分析表明NAFLD與重癥COVID-19之間存在顯著關聯［比值比（OR）=3.06，P=1.07×10-6］。然而，在調整了人口統計學和合并癥因素后，這種關聯消失了（OR=1.57，P=0.09）。筆者認為，雖然在人群水平上，NAFLD可能與嚴重的COVID-19發病風險相關，但這種關聯很可能受到NAFLD合并癥后的其他代謝紊亂的干擾。因此，目前尚無確切證據支持NAFLD是重癥COVID-19的致病危險因素。其他相關MR研究還探索了中風［25］、2型糖尿病［26］、甲狀腺功能減退癥［27］、銀屑病［28］、炎癥性腸病［28］、幽門螺旋桿菌感染［29］、胰腺癌［30］等疾病或病理狀況與NAFLD發生風險的因果關聯，亦聯合諸如美國國家健康與營養調查（National Health And Nutrition Examination Survey，NHANES）等數據庫，評估NAFLD患者中某一疾病與NAFLD進展風險之間的關系［31］，進一步強調了預防和管理NAFLD在臨床與公共衛生實踐中的重要性。

2.2 確認和揭示生活方式、代謝相關指標、血清參數對NAFLD的潛在影響 生活方式的改變可能會對公眾健康產生重大影響，諸多流行病學證據表明，咖啡攝入、糖攝入、久坐等生活方式均是NAFLD發生的危險因素，但這些生活方式是否與NAFLD之間有明確的因果關系以及改變這些因素是否會降低NAFLD的患病風險尚不清楚［32］。此外，循環脂質等代謝相關指標、血清參數與NAFLD之間的關系也一直是研究的熱點。然而，上述相關研究均是風險因素或生物標志物的“相關性”研究，而鮮有大隊列研究聚焦因果關聯，全面、系統地評估NAFLD和危險因素的“因果性”仍具挑戰。Xie等［33］基于單變量和多變量MR分析，發現飲酒頻率、血清肝功能相關酶升高、身體狀況不佳、肥胖、2型糖尿病、高血壓可增加NAFLD的發病風險，而高學歷和高密度脂蛋白膽固醇與NAFLD風險降低相關。此外，輕度體育鍛煉與NAFLD呈弱相關，而吸煙、咖啡、睡眠、劇烈運動等均無顯著相關性。既往觀察性研究顯示，NAFLD與血清尿酸（SUA）水平高度相關，但由于反向因果關系，這些研究存在固有的偏倚風險。Li等［34］通過雙向MR分析支持NAFLD導致SUA水平升高的因果關系，但該研究并未證實SUA水平與NAFLD風險之間的潛在因果關聯，且仍需更深入的研究來解釋相關機制。盡管在一些臨床試驗中觀察到維生素D具有改善肝臟對胰島素的反應以及減輕肝臟炎癥和改善肝功能等治療效果，但其與NAFLD之間的因果關系尚未闡明。Yuan等［35］的一項MR研究通過大樣本數據證實，維生素D水平的增加在歐洲人群的NAFLD預防中發揮作用。Chen等［36］采用9個與全基因組血漿磷脂花生四烯酸（AA）顯著相關的SNP作為IV，旨在通過MR分析確定AA與NAFLD之間的因果關系。研究表明，AA水平每增加一個標準差，NAFLD的發生風險隨之增加（OR=1.06，95%CI：1.02～1.11，P=0.008），即高水平的AA與NAFLD風險存在潛在因果關聯。既往研究亦發現，在NAFLD發生發展過程中，補體系統被激活，且補體水平與肝臟損傷程度呈平行關系，關于補體系統與NAFLD因果關系的研究證據目前尚不充分。Li等［37］基于廣西防城港男性健康隊列，在橫斷面和縱向研究設計基礎上，結合雙向MR分析方法，探討了血清補體C3和C4與NAFLD發生發展的因果關系。該研究結果證實，NAFLD是導致人體血清補體C3水平升高的原因，但血清補體C3水平升高并不是導致NAFLD發生風險升高的原因。該研究為遺傳因素決定的補體C3、C4與NAFLD之間的因果關系提供了新的證據，血清補體C3水平的變化可考慮作為NAFLD患者臨床治療中判斷疾病進展程度的輔助觀察指標。此外，一些研究也采用MR法分析了其他因素如習慣性咖啡攝入量［38］、睡眠特征［39］、大麻的攝入［40］、486種血液代謝物［41］、同型半胱氨酸及葉酸［42］、循環半乳糖凝集素［43］等生活方式、代謝相關指標或血清參數與NAFLD發病風險的潛在關聯。基于以上相關研究，筆者認為，在解釋MR結果時尚需考慮其局限性，如連鎖不平衡（LD）、樣本重疊、弱IV偏倚的存在、統計能力不足以及難以通過結果解釋潛在作用機制等，以最大限度地減少研究結果因水平多效性而可能產生的偏倚。

2.3 探索社會經濟因素及社會環境與疾病的關聯 目前，探索社會經濟因素及社會環境與疾病相關聯的研究相對有限。Kong等［44］旨在探索低出生體質量與NAFLD的因果關聯，并確定潛在的代謝介質及其與該關聯的中介作用。該研究顯示出生體質量每降低1個標準差，未來NAFLD的風險增加45%，并且在調整兒童肥胖、成年人肥胖特征以后，這種關聯仍然存在。同時，通過兩步MR法確定了其中潛在的中介變量，包括空腹胰島素、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸和單不飽和脂肪酸等，而空腹血糖、糖化血紅蛋白、高密度脂蛋白等被證明不在其中發揮中介作用。此外，抑郁癥與胃腸道疾病之間關聯的因果關系尚未確定，有研究者通過MR分析，系統地探索了抑郁癥與包括NAFLD在內的24種胃腸道疾病的關聯。該研究在全基因組顯著性水平上選擇與抑郁癥相關的獨立遺傳變異作為IV，同時采用多變量MR分析探討體質量指數（BMI）、吸煙和2型糖尿病的中介作用。經過多次測試校正后，結果顯示抑郁癥的遺傳易感性與NAFLD風險增加有關（OR=1.46，95%CI：1.15～1.85，P=0.002），且二者之間的關聯在很大程度上由BMI介導［45］。過去的觀察性研究中一直將高等教育等社會經濟因素與疾病風險的降低聯系起來，如冠心病［46］、COVID-19［47］等。因此，從社會經濟角度評估諸如教育年限、母親在懷孕期間吸煙、兒童認知能力、精神分裂癥等與NAFLD的關聯，對于探索NAFLD的早期干預具有重要意義。

此外，除上述MR在NAFLD病因探索中具有廣泛應用外，MR也被越來越多地運用于尋找NAFLD治療的新藥物作用靶點。如觀察性研究發現，血脂異常是NAFLD的危險因素，他汀可能會降低NAFLD的發生風險。吳永健團隊的一項MR研究［48］結果顯示，他汀、貝特類藥物、依折麥布、PCSK9抑制劑、膽汁酸螯合劑、血管生成素樣3（ANGPTL3）抑制劑、靶向載脂蛋白C-Ⅲ（APOC3）mRNA的反義寡核苷酸等降脂藥物均無助于降低脂肪肝風險。同時，各血脂指標對NAFLD風險均無明顯影響，且在9個降脂藥物靶點（HMGCR、NPC1L1、PCSK9、ABCG5/ABCG8、APOB、LDLR、ANGPTL3、APOC3、LPL）中，脂蛋白脂肪酶（LPL）是唯一可顯著降低NAFLD風險的藥物靶點。LPL在NAFLD中的作用機制可能是通過調節胰島素水平而非通過降脂發揮作用。因此，筆者認為，MR作為藥物靶點發現的一個有效工具，涉及受體、酶、離子通道、轉運體、免疫系統、基因等，將其越來越多地運用于NAFLD相關藥物的探索中，對于識別和篩選NAFLD潛在的藥物靶點、致病因子和生物標志物具有重要的臨床意義。

3 小結與展望

MR遵循“親代等位基因隨機分配給子代”的遺傳定律，推斷暴露與結局是否存在因果關聯，能有效避免遺傳變異受到后天混雜因素的影響，為流行病學研究中因果關聯的推斷提供了新的視角。此外，筆者認為MR研究通過構建“遺傳變異-風險因素-疾病結局”的模型，探索各種因素如疾病、環境、社會、行為、心理等與疾病之間潛在因果關聯等設想與中醫整體和辯證論治觀念不謀而合，對于某一危險因素與疾病間存在相關性但先后順序不明的情況，可將中醫臨床與雙向MR研究進行結合，從而檢驗兩者間的因果效應及效應的方向。然而，MR研究應用于中醫藥領域面臨諸多挑戰，如中醫藥相關的GWAS可用數據庫相對局限，且暫無傳統醫學診斷及證型分類數據。因此，MR在中醫藥領域的研究將處于長期探索階段。

隨著GWAS數據生成成本的降低以及MR模型應用規范的制訂，MR將進一步豐富NAFLD疾病關聯網絡，成為研究NAFLD等疾病中因果關系的有力工具之一，越來越多地被用于探索該病的危險因素、中間機制和與其他復雜疾病間的雙向因果關系，這些研究將更兼顧科學性與可行性的統一，有望成為因果證據鏈中連接傳統觀察性研究和RCT的重要紐帶。未來研究者應當注意避免該研究方法本身存在的局限性，遵循相關指南和共識規范，發現更多與NAFLD發病風險相關的遺傳變異，為干預和治療NAFLD提供可靠的指導性意見，從而更好地為臨床服務。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：郭紫薇參與選題，撰寫論文；武慶娟參與檢索文獻，數據提取，修改論文；葉永安、陳蘭羽、呂文良負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。