劉 孟,徐曉雙,韓 霜,張 琳,劉 歡,張 飛,王建國*

(1.中國藥科大學新藥安全評價研究中心,江蘇 南京 211198;2.內蒙古鴻茅藥業有限責任公司,內蒙古 烏蘭察布 013750)

中藥材泡制的藥酒在治療、預防、保健及養生等各個方面均發揮了重要作用,在我國文化源遠流長,因此也深受消費者歡迎[1]。鴻茅藥酒是獲得國家衛生行政主管部門批準的非處方藥。其組方配伍以中醫大方復治法為立方基礎,選用人參、紅花、黃芪、熟地、蓯蓉、沉香、當歸、附子、遠志、羌活等67味中藥,主治風寒濕痹,筋骨疼痛,脾胃虛寒,腎虧腰酸以及婦女氣虛血虧等癥[2-4]。近年來,鴻茅藥酒因其配方和廣告備受爭議,本研究旨在采用去酒精鴻茅藥酒濃縮液作為受試物,對其藥材進行安全性評價,給臨床應用提供參考[5-6]。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SD大鼠購于浙江維通利華實驗動物技術有限公司,生產許可證號是SCXK(浙)2019-0001,動物等級為SPF級(質量合格證編號1909200048、1910090008)。

1.2 受試物

由內蒙古鴻茅藥業有限責任公司提供,批號20180202。為滿足試驗要求,對去除乙醇樣品進行減壓濃縮(每5.5 mL原鴻茅藥酒濃縮至1mL),作為一般毒性研究受試物。

1.3 儀器

SIMENS全自動血液分析儀和全自動生化分析儀、Behnk Elektronik全自動凝血分析儀、MEDICA電解質分析儀、SARTORIUS電子天平等。

1.4 試劑

PT、APTT、TT、FIB檢測試劑盒,正常值質控品,異常值質控品。Retic、BASO、HGB、RBC/PLT、PEROX1、PEROX2、PEROX3、PEROX SHEATH試劑包,正常值質控品、異常值質控品。AST、ALT、ALP、ALB、GGT、TBI、TGL、TP、BUN、CREA、CKI、CHOL、GLUC檢測試劑盒,BIO-RAD1多項質控,BIO-RAD2多項質控等。

1.5 試驗方法

1.5.1 大鼠經口單次給予鴻茅藥酒濃縮液毒性試驗

選用40只健康成年SD大鼠,隨機分為4組,每組10只,雌雄各半,單次經口給予400、800、1600 mg/kg鴻茅藥酒濃縮液,給藥體積分別為5、10、20 mL/kg,對照組給予20 mL/kg的滅菌注射用水。連續觀察14天,記錄動物的臨床體征及體重,試驗結束后稱重,安樂死動物作大體解剖。

1.5.2 大鼠13周經口重復給予鴻茅藥酒濃縮液毒性試驗

選用120只健康成年SD大鼠,隨機分為4組,每組30只,雌雄各半。分別經口給予200、400、800 mg/kg鴻茅藥酒濃縮液及溶媒(滅菌注射用水),給藥體積均為10 mL/kg;連續給藥13周,恢復期4周。記錄所有動物臨床體征、體重及攝食測定;并對高劑量組、滅菌注射用水對照組動物進行眼科檢查;采集血樣進行血液學、血生化指標檢查;檢查各系統臟器的大體改變并稱取部分臟器濕重,計算臟體比;并對滅菌注射用水對照組、高劑量組及尸檢異常的動物臟器進行組織病理學檢查等。

1.5.3 統計學方法

使用SPSS 22.0軟件進行均數、標準差的計算和統計學檢驗。計量資料以均數±標準差表示,多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)和秩和檢驗(Kruskal-Wallis H)。

2 結果

2.1 大鼠經口單次給予鴻茅藥酒濃縮液毒性試驗

給予各劑量受試物后,SD大鼠未見明顯毒性癥狀,觀察期內未見死亡,體重未見異常(見表1),大體解剖肉眼未見異常。SD大鼠經口單次給予鴻茅藥酒濃縮液,最大耐受劑量>1600 mg/kg。

表1 鴻茅藥酒濃縮對大鼠急性經口毒性試驗結果

2.2 大鼠13周經口重復給予鴻茅藥酒濃縮液毒性試驗

2.2.1 一般臨床癥狀

連續13周經口給予200、400、800 mg/kg鴻茅藥酒濃縮液及恢復4周,未見受試物相關死亡及臨床毒性癥狀。

2.2.1 鴻茅藥酒濃縮液對大鼠體重的影響

給藥前,各組同性別的動物極大和極小體重與平均體重比較均不超過10%,組間無統計學差異。與滅菌注射用水組比較,800 mg/kg鴻茅藥酒濃縮液組雄鼠在給藥第4、8、13周體重降低,有統計學差異(P<0.05),停藥后體重差異逐漸減小。各組雌性動物體重組間無統計學差異(見表2)。

表2 鴻茅藥酒濃縮液對大鼠體重的影響

2.2.2 鴻茅藥酒濃縮液對大鼠攝食量的影響

給藥等4、8、13周,200、400、800 mg/kg鴻茅藥酒濃縮液組雄鼠攝食量均有所減低,有統計學差異(P<0.05)。給藥制劑黏稠,可見800 mg/kg劑量組雄鼠的攝食有明顯的降低;800 mg/kg劑量組雌鼠攝食也有降低,但受影響程度較小。其他給藥組動物攝食量有所減低,可能與給藥有關,但影響輕微,不具毒理學意義(見表3)。

表3 鴻茅藥酒濃縮液對大鼠攝食量的影響

2.2.3 鴻茅藥酒濃縮液對大鼠血液學的影響

連續13周經口給予200、400、800 mg/kg鴻茅藥酒濃縮液,與滅菌注射用水組比較,800 mg/kg劑量組雌鼠的嗜堿性粒細胞百分比(BASO%)升高(P<0.05)。以上個別指標,變化程度輕微,可能由個體差異造成(見表4)。

表4 鴻茅藥酒濃縮液對大鼠血液學指標的影響(給藥末期,Mean±SD,n=10)

2.2.4 鴻茅藥酒濃縮液對大鼠血生化的影響

連續13周經口給予200、400、800 mg/kg鴻茅藥酒濃縮液,200、400、800 mg/kg劑量組雄鼠的血糖降低,有統計學差異(P<0.05)。200 mg/kg劑量組雌鼠的肌酐降低(P<0.05),但未見明顯劑量相關性。停藥后,以上差異指標未見異常(見表5)。

表5 鴻茅藥酒濃縮液對大鼠血生化指標的影響(給藥末期,Mean±SD,n=10)

2.2.5 鴻茅藥酒濃縮液對大鼠臟器重量的影響

連續13周經口給予200、400、800 mg/kg鴻茅藥酒濃縮液,給藥期結束,800 mg/kg劑量組雄鼠肝臟重量降低(P<0.05),200 mg/kg組雄鼠睪丸重量降低(P<0.05),以上差異指標,疑似由于個體差異造成。停藥后,各組動物臟器重量未見明顯異常(見表6)。

表6 鴻茅藥酒濃縮液對大鼠臟器重量的影響(給藥末期,Mean±SD,n=10)

2.2.6 組織病理學檢查

給藥13周及恢復4周時分別進行大體解剖,未見受試物相關異常病變。組織病理學檢查高劑量組和滅菌注射用水組動物所有剖檢臟器,高劑量1例大鼠為淋巴細胞型白血病,并侵及肝臟、脾臟、肺臟,腎臟可見腎小管變性壞死、管型,十二指腸、空、回、盲、結、直腸腸腔擴張,胸腺退行性變,發生率低,提示以上病變為動物的自發病變。1例大鼠左耳可見外耳損傷修復伴多發性囊腫,結合肉眼觀察的結果,提示該病變可能為外界損傷引起的。試驗期間,高劑量組和滅菌注射用水組動物還出現肝臟局灶性壞死、肝臟脂肪變性、耳朵多發性囊腫,以上病變發生率低,考慮為動物的自發病變。連續13周經口給予800 mg/kg鴻茅藥酒濃縮液及恢復4周,未引起大鼠臟器明顯的毒性病理改變。

3 討論

鴻茅藥酒,臨床上用于風寒濕痹,筋骨疼痛,脾胃虛寒等,輔料為白酒、紅糖、冰糖;乙醇含量為36%～38%。口服,一次15 mL,一日2次,每mL含生藥量14.44 mg。以生藥量計,按照人和大鼠體表面積公式進行劑量折算,臨床日用量為6.19 mg/kg;大鼠體重以0.2 kg計,大鼠等效日用量為39.00 mg/kg。試驗結果顯示,大鼠單次給予鴻茅藥酒濃縮液毒性試驗的最大耐受劑量>1600 mg/kg(約臨床日用量的40倍);13周亞慢性試驗提示,每日給予鴻茅藥酒濃縮液400 mg/kg(臨床日用量的10倍),大鼠沒有出現死亡和明顯毒性癥狀。

鴻茅藥酒濃縮液為鴻茅藥酒成品加熱后回收溶劑,取殘渣制備而得,每1mL濃縮液等于5.5 mL原鴻茅藥酒。濃縮液因其性質黏稠、微苦,影響動物進食,導致800 mg/kg劑量組動物體重出現下降現象、攝食量減少,誘發血糖降低、嗜堿性粒細胞百分比(BASO%)升高。上述癥狀在停藥后均可恢復,無藥材相關性。

本研究有別于傳統的中成藥上市后安全性再評價的方法,通過濃縮上市藥酒增加了藥材劑量,以期充分暴露藥材潛在毒性,這給予上市后安全性再評價以及臨床應用一定的參考意義[7]。因鴻茅藥酒濃縮液濃度較高,不易吸收,出現無受試物相關的癥狀是本研究的局限性。