Hh信號(hào)通路分子TPX2對(duì)口腔鱗癌增殖的作用探討

張洪瑞，蘇本香，龐艷，孫月茹

呼倫貝爾職業(yè)技術(shù)學(xué)院口腔教研室，內(nèi)蒙古呼倫貝爾 021000

口腔癌是發(fā)生于口腔黏膜的惡性腫瘤，主要包括唇頰黏膜、舌前2/3、硬腭、牙齦以及口底等部位，其中病理類型以鱗癌最常見。印度、東南亞為口腔癌的高發(fā)區(qū)，男性發(fā)病率約為女性的2倍[1]。目前口腔鱗癌的治療方案多為以手術(shù)為主的放化療等綜合治療，但是很難持續(xù)改善患者的預(yù)后，并且大多數(shù)進(jìn)展期患者在治療后仍然復(fù)發(fā)[2]。因此需要識(shí)別促進(jìn)口腔鱗癌增殖的分子，從而研制有效的靶向治療藥物治療口腔鱗癌，降低疾病的復(fù)發(fā)率和病死率[3]。口腔鱗癌發(fā)生的分子機(jī)制仍然不清楚，有研究表明叉頭盒M1（Forkhead Box Protein M1,FOXM1）是癌胚轉(zhuǎn)錄因子及細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)因子，靶向Xklp2靶蛋白（Targeting Protein for Xenopus Kinesin-like Protein 2, TPX2）是有絲分裂的關(guān)鍵癌基因，但是如何促進(jìn)口腔鱗癌發(fā)生與發(fā)展仍不明確[4-5]。本研究選取2022年1月—2023年7月呼倫貝爾職業(yè)技術(shù)學(xué)院口腔教研室培養(yǎng)的6株CAL-27人口腔鱗癌細(xì)胞株為研究對(duì)象，旨在探討與分析Hedgehog（Hh）信號(hào)通路分子TPX2對(duì)口腔鱗癌增殖的作用，以明確TPX2的作用機(jī)制。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

CAL-27人口腔鱗癌細(xì)胞株（美國ATCC）；DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco）；GANT61及cyclopamine（美國Sigma-Aldrich）；Puromycin（北京Solarbio）；轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine 2000 transfection reagent和總RNA提取試劑（美國Thermo Fisher Scientific）；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基（美國Gibco）；FOXM1抗體、TPX2抗體（英國Abcam）。

1.2 方法

1.2.1 TPX2 shRNA獲取及RT-qPCR Genbank數(shù)據(jù)庫確定人TPX2的基因序列，針對(duì)TPX2的基因序列設(shè)計(jì)1條shRNA，shTPX2序列：5'-AGCCAAGTTGTGCAATGTTC-3'，由蘇州吉瑪基因公司設(shè)計(jì)合成。采用TRIzol法提取試劑盒對(duì)細(xì)胞總RNA進(jìn)行提取，RNA的純度和濃度的測定應(yīng)用紫外分光光度計(jì)，取2 μl RNA，在反轉(zhuǎn)錄酶作用下合成cDNA，再取2 μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物PCR擴(kuò)增，以磷酸甘油醛脫氫酶（Glyceraldehyde 3-Phosphate Dehydrogenase, GAPDH）為內(nèi)參照，PCR反應(yīng)條件：①95℃ 5 min，②95℃ 30 s，③60℃ 30 s，④72℃ 30 s，⑤72℃ 5 min；其中②、③、④為40個(gè)循環(huán)。

1.2.2 細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染 把CAL-27細(xì)胞隨機(jī)分為兩組：對(duì)照組與Lv-shTPX2組。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，待細(xì)胞融合度達(dá)到70.0%～80.0%后，對(duì)照組與Lv-shTPX2組分別用lipofectamine 2000細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染Lv-pc3.0 vector與Lv-pc3.0-shTPX2，轉(zhuǎn)染終濃度為10 nmol/L，轉(zhuǎn)染后12 h更換培養(yǎng)液。

1.2.3 細(xì)胞增殖 將轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的細(xì)胞消化離心，顯微鏡下計(jì)數(shù)，以細(xì)胞5 000個(gè)/孔的密度接種于96孔板，24 h后培養(yǎng)基中加入50 μmol/L Edu再孵育1～4 h，每次實(shí)驗(yàn)每孔重復(fù)3次，只顯示1個(gè)有代表性的區(qū)域。

1.2.4 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期 將細(xì)胞消化、傳代、培養(yǎng)24 h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)至72 h，0.25%胰酶消化成單細(xì)胞懸液，磷酸緩沖生理鹽水（Phosphate Buffer Saline, PBS）洗滌2次，1 000 r/min離心5 min，棄去上清，緩慢加入-20℃預(yù)冷的75%乙醇，4℃保存，取細(xì)胞懸液，PBS洗滌，2 000 r/min離心5 min后，棄去上清液，碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）染液1 mL，染30 min，每樣本收集10 000個(gè)熒光信號(hào)，得出各期細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分率，每組重復(fù)3次。

1.2.5 蛋白印跡法檢測目的蛋白的表達(dá) 培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)預(yù)冷的PBS漂洗2次，吸凈PBS，加入預(yù)冷的裂解液置于冰上。將研磨液置于離心管中震蕩，間斷吹打，共約30 min，反復(fù)吹打，超聲破碎，置于4℃離心機(jī)中，以13 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min，取上清液置于新的EP管中，加入蛋白上樣緩沖液，反復(fù)吹打，利用BCA法定量蛋白，制備10%SDS-PAGE凝膠，上樣，轉(zhuǎn)膜，5%牛奶在室溫孵育2 h，TBST洗3次，10 min/次，單克隆抗體GLI2、FOXM1以及TPX2（1 ∶ 3 000），GAPDH（1 ∶ 5 000），在4℃搖床過夜，TBST洗3次，10 min/次。二抗孵育：膜與相應(yīng)的二抗在室溫下孵育2 h。顯色劑混合，滴于膜上。

1.3 觀察指標(biāo)

比較兩組細(xì)胞的TPX2表達(dá)水平、細(xì)胞增殖指數(shù)、細(xì)胞周期（G1期、S2期、G+M期）相對(duì)比例、目的蛋白（GLI2、FOXM1）相對(duì)表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

使用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料（TPX2表達(dá)水平、細(xì)胞增殖指數(shù)、細(xì)胞周期相對(duì)比例、目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平）用（±s）表示，行t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組細(xì)胞TPX2表達(dá)水平對(duì)比

轉(zhuǎn)染后24、48 h，Lv-shTPX2組的TPX2 mRNA與蛋白相對(duì)表達(dá)水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。見表1。

表1 兩組細(xì)胞TPX2表達(dá)水平對(duì)比（±s）

表1 兩組細(xì)胞TPX2表達(dá)水平對(duì)比（±s）

組別Lv-shTPX2組（n=3）對(duì)照組（n=3）t值P值轉(zhuǎn)染后24 h mRNA 5.44±0.17 24.59±0.33 89.352＜0.05蛋白2.01±0.23 10.47±0.16 52.299＜0.05轉(zhuǎn)染后48 h mRNA 5.18±0.47 24.58±2.76 12.002＜0.05蛋白1.33±0.16 7.48±0.33 29.045＜0.05

2.2 兩組細(xì)胞增殖指數(shù)對(duì)比

轉(zhuǎn)染后24、48 h，Lv-shTPX2組的細(xì)胞增殖指數(shù)低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。見表2。

表2 兩組細(xì)胞增殖指數(shù)對(duì)比[（±s），%]

表2 兩組細(xì)胞增殖指數(shù)對(duì)比[（±s），%]

組別Lv-shTPX2組（n=3）對(duì)照組（n=3）t值P值轉(zhuǎn)染后24 h 33.59±2.03 67.24±8.42 6.729＜0.05轉(zhuǎn)染后48 h 45.32±3.48 83.76±9.22 6.756＜0.05

2.3 兩組細(xì)胞周期相對(duì)比例對(duì)比

轉(zhuǎn)染48 h后，Lv-shTPX2組的G2+M期細(xì)胞相對(duì)比例高于對(duì)照組，S期細(xì)胞相對(duì)比例低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。見表3。

表3 兩組細(xì)胞周期相對(duì)比例對(duì)比[（±s），%]

表3 兩組細(xì)胞周期相對(duì)比例對(duì)比[（±s），%]

組別Lv-shTPX2組（n=3）對(duì)照組（n=3）t值P值G1期50.43±3.59 45.56±4.44 1.477 0.214 S期29.84±4.09 42.24±3.75 3.871＜0.05 G2+M期19.87±2.14 10.33±1.57 6.226＜0.05

2.4 兩組細(xì)胞目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平對(duì)比

轉(zhuǎn)染48 h后，Lv-shTPX2組的GLI2、FOXM1蛋白相對(duì)含量低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。見表4。

表4 兩組細(xì)胞目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平對(duì)比[（±s），%]

表4 兩組細(xì)胞目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平對(duì)比[（±s），%]

組別Lv-shTPX2組（n=3）對(duì)照組（n=3）t值P值GLI2 1.48±0.22 5.58±1.00 6.936＜0.05 FOXM1 1.57±0.33 6.01±0.57 11.676＜0.05

3 討論

口腔鱗癌是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，80.0%發(fā)生于口腔黏膜的癌癥為鱗癌[5]。口腔鱗癌患者的預(yù)后比較差，5年生存率不到50.0%[6-7]，腫瘤轉(zhuǎn)移和放化療耐受是口腔鱗癌致死的主要原因，為此需要為治療口腔鱗癌尋找一條新的途徑。有研究證實(shí)口腔鱗癌中Hh信號(hào)通路處于異常激活狀態(tài)，但Hh信號(hào)通路如何調(diào)節(jié)腫瘤生長需要進(jìn)一步研究[8]。同時(shí)目前有多種靶向抑制Hh通路的藥物，主要為環(huán)靶明，但研究報(bào)道腫瘤細(xì)胞對(duì)環(huán)靶明產(chǎn)生耐藥，因此需要進(jìn)一步研究Hh信號(hào)通路下游分子，尋找直接導(dǎo)致口腔鱗癌細(xì)胞增殖和生長的原因，從而針對(duì)性研制出靶向治療藥物[9]。

TPX2是一種在多種腫瘤中呈高表達(dá)的癌基因，可促進(jìn)有絲分裂紡錘體的形成，在細(xì)胞分裂及腫瘤的形成中也發(fā)揮有重要的作用，然而TPX2的表達(dá)調(diào)節(jié)機(jī)制仍不清楚[10]。本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后24、48 h，Lv-shTPX2組的TPX2 mRNA[（5.44±0.17）、（5.18±0.47）]與蛋白相對(duì)表達(dá)水平[（2.01±0.23）、（1.33±0.16）]低于對(duì)照組的TPX2 mRNA[（24.59±0.33）、（24.58±2.76）]與蛋白相對(duì)表達(dá)水平[（10.47±0.16）、（7.48±0.33）]（P均＜0.05）；在尹頌豪等[11]的相關(guān)研究中顯示，在轉(zhuǎn)染TPX2-siRNA后，TPX2 mRNA在48 h后表達(dá)下調(diào)（F=224.8，P＜0.001）；TPX2蛋白質(zhì)在72 h后表達(dá)下調(diào)（F=10.69，P=0.022）。Lv-shTPX2組的細(xì)胞增殖指數(shù)低于對(duì)照組（P＜0.05），表明抑制Hh信號(hào)通路分子TPX2的表達(dá)可抑制口腔鱗癌細(xì)胞增殖。當(dāng)前也有研究顯示，TPX2持續(xù)高表達(dá)后，Edu染色、細(xì)胞增殖曲線及克隆形成實(shí)驗(yàn)證實(shí)口腔鱗癌細(xì)胞生長加速，sonic hedgehog （Shh）信號(hào)通路通過TPX2促進(jìn)口腔鱗癌細(xì)胞增殖[12]。

在口腔鱗癌所有異常調(diào)節(jié)的信號(hào)通路中，Hh信號(hào)通路對(duì)腫瘤的增殖有重要的作用，TPX2是Hh信號(hào)通路的下游的靶基因[8]。GLI是重要的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控Hh信號(hào)由胞質(zhì)到胞核中，敲除GLI，TPX2的表達(dá)下降，GLI異常激活，TPX2的表達(dá)升高。激活Hh配體，Shh、TPX2表達(dá)亦升高[13]。FOXM1在高度分化和未分化的組織細(xì)胞中沒有表達(dá)，而在增殖的上皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)出高度活性，加速細(xì)胞周期進(jìn)程，在正常組織受到損傷后，F(xiàn)OXM1的表達(dá)直接參與損傷后修復(fù)，為此異常激活的FOXM1作為癌基因而促進(jìn)癌癥的發(fā)生發(fā)展[14]。本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染48 h后，Lv-shTPX2組的G2+M期細(xì)胞相對(duì)比例高于對(duì)照組，S期細(xì)胞相對(duì)比例低于對(duì)照組，Lv-shTPX2組的GLI2、FOXM1蛋白相對(duì)含量更低，（P均＜0.05），表明抑制Hh信號(hào)通路分子TPX2的表達(dá)可抑制GLI2、FOXM1蛋白表達(dá)，還可調(diào)節(jié)細(xì)胞周期狀況。

綜上所述，抑制Hh信號(hào)通路分子TPX2的表達(dá)可抑制口腔鱗癌細(xì)胞增殖，也可抑制GLI2、FOXM1蛋白表達(dá)，還可調(diào)節(jié)細(xì)胞周期狀況，可為治療口腔鱗狀細(xì)胞癌提供新的途徑。