外泌體在炎癥性皮膚疾病中的作用研究進展

鄧皓月 黎靜宜

四川大學華西醫院皮膚性病科,四川成都,610041

皮膚是人體最大的器官,總面積約2平方米,約占人體總質量的15%,由外向內依次由表皮、真皮和皮下組織構成,具有免疫、屏障、感覺、代謝、體溫調節等生理功能[1]。皮膚在遺傳易感性、免疫失調、環境變化、病原微生物侵襲等多因素影響下,出現病理改變,引發結構或功能障礙,發展為蕁麻疹(urticaria)、特應性皮炎(atopic dermatitis,AD)、銀屑病(psoriasis)等不同炎癥性皮膚疾病。例如皮膚屏障損傷是AD發病的關鍵因素之一[2],神經酰胺減少和絲聚蛋白基因突變等因素可以導致表皮結構和功能異常,最終引發AD[3,4];免疫系統激活是銀屑病發病的核心機制,Th1和Th17細胞分化增殖出現異常,相關細胞因子促進角質形成細胞增殖、血管生成和炎癥浸潤,推動銀屑病樣皮損發展[5];目前認為蕁麻疹發作主要與免疫紊亂密切相關,肥大細胞活化后釋放以組胺為代表的炎癥介質,導致瘙癢和風團,還可以誘導嗜堿性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞等其他免疫細胞浸潤,共同影響蕁麻疹發病[6]。炎癥性皮膚疾病嚴重影響患者的身心健康和生活質量,進一步探索其發病機制和高效治療手段具有重要意義,關于炎癥性皮膚疾病免疫激活和調控機制仍在深入研究之中。

外泌體是在生理或病理狀態下由各種細胞分泌的包含脂質、核酸、蛋白質等活性物質的細胞外囊泡,不僅具有參與細胞分化遷移、介導細胞間通訊、調節免疫應答、組織修復等生物學功能,還與腫瘤、心血管疾病、神經退行性疾病等機體病理狀態密切相關[7]。近年來,外泌體在炎癥性皮膚疾病中的作用正得到逐步探索,外泌體可能在皮膚免疫系統活化或者抑制中發揮調控作用。本文就外泌體和相關炎癥性皮膚疾病的關系做一綜述,希望對炎癥性皮膚疾病的診斷及治療提供新思路。

1 外泌體

1.1 外泌體的來源與結構 外泌體最早于體外培養的綿羊網織紅細胞上清液中發現[8],它是一種直徑通常在30～150 nm的細胞外囊泡,可由淋巴細胞、肥大細胞、巨噬細胞、內皮細胞、血小板等幾乎所有類型的細胞分泌產生,并廣泛存在于血液、尿液、唾液、腦脊液、乳汁、淚液等體液中[9]。

外泌體通過內體途徑生成[10],主要過程包括:(1)細胞膜內陷形成早期內體,相關生物活性物質開始在其中積累;(2)在相關蛋白的控制下,早期內體變成晚期內體;(3)晚期內體的界膜多處凹陷,向內出芽形成管腔狀囊泡,從而轉變為多泡體;(4)多泡體與細胞膜融合,管腔狀囊泡再次凹陷,以內出芽方式形成顆粒狀小囊泡,胞內物質最終以囊泡的形式釋放到體外,即形成外泌體。

外泌體是具有納米級脂質體結構的胞外雙囊泡,含有核酸、脂質、蛋白質、細胞因子等生物活性物質。外泌體包含多種核酸,如DNA、mRNA、miRNA、siRNA、circRNA等[11]。外泌體有豐富的脂質組分,其組成通常與脂質雙分子層結構一致,包括膽固醇、鞘脂、磷酸肌醇、磷脂酰肌醇、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷酸肌醇激酶、磷脂酰絲氨酸、三酰甘油等[12]。不同來源的外泌體所含蛋白質是有差異的,常用外泌體標記蛋白包括生物發生相關蛋白(如Alix、TSG101)、跨膜蛋白(如CD9、CD63、CD81)、熱休克蛋白(如HSP 70、HSP90)、膜轉運和融合相關蛋白(如Rab,GTPases)、鈣磷脂結合蛋白、脂筏標記蛋白等[13]。

1.2 外泌體與疾病相關性 外泌體與許多疾病的發生發展具有相關性,在疾病診斷與治療方面具有重要潛力。外泌體是一種新型細胞間通訊機制,外泌體表面跨膜配體可直接與受體細胞表面受體結合,觸發信號傳導,激活受體細胞;外泌體也可以與質膜融合或被內化吸收,將生物活性物質釋放到受體細胞的胞質中,影響其生物學活性,調節機體生理或病理狀態[14]。外泌體在大小、內容物等方面具有異質性,可以通過測定相應體液中外泌體含量及其特異性蛋白質、核酸等組分,分析供體細胞功能狀態,由此評估不同疾病中外泌體的生物學功能[15]。外泌體因其介導細胞通訊的功能和異質性的特點,有望成為非侵入性疾病診斷生物標志物。

外泌體在疾病治療上也開辟了新途徑。由于外泌體存在廣泛,且易獲取,同時具備納米級脂質體結構、高生物相容性、高血腦屏障穿透性、高循環穩定性和低毒性等特點,可作為天然藥物分子載體進行靶向藥物輸送[16],具有巨大治療前景。例如外泌體可裝載姜黃素、紫杉醇、甲氨蝶呤等化療藥物,直接靶向腫瘤細胞,進一步提高藥物利用率、降低藥物毒性和減少耐藥,提升腫瘤治療效率[17],在中樞神經系統疾病中,外泌體載藥系統可以穿透血腦屏障,提高藥物濃度和延長作用時間,實現腦內安全高效給藥[18]。

外泌體異常分泌參與疾病進展,但相關調控機制尚未完全明確。Wu等[19]在體外模擬細胞外基質的硬化過程,發現硬化細胞外基質可通過Akt信號通路,磷酸化并激活鳥嘌呤核苷酸交換因子Rabin8,進一步活化Rab8蛋白,使外泌體分泌增多,影響腫瘤微環境,促進肝癌細胞生長和轉移。Yang等[20]發現與腫瘤發生密切相關的長鏈非編碼RNA(lncRNA HOTAIR)通過調節Rab35在多泡體處的定位,并上調Rab35表達,促進多泡體向質膜運動;HOTAIR促進VAMP3與SNAP23的共定位,誘導SNARE復合物形成,介導多泡體與質膜進一步融合,從而控制外泌體釋放。有研究[21]發現在缺氧條件下,卵巢癌細胞通過STAT3通路調節Rab7和Rab27a蛋白,促進外泌體釋放,增強腫瘤侵襲性。上述研究提示Rab蛋白家族是影響外泌體分泌的重要調控因子。

2 外泌體與特應性皮炎

特應性皮炎是一種易反復發作的慢性炎癥性皮膚病,以皮膚干燥、瘙癢和濕疹樣皮損為典型表現。AD發病率在全球范圍內不斷增高,各年齡段均可發病[22]。AD發病機制尚未完全明確,可能與遺傳易感性、Th2型炎癥反應、皮膚屏障功能障礙、環境變化等因素有關[23],近期研究[24,25,26,27,28]表明外泌體可能參與AD發病,并具有治療AD皮膚炎癥的潛在價值。

Zhu等[24]提取AD患兒和健康對照組的血漿來源外泌體,將不同濃度的AD患兒外泌體與角質形成細胞(keratinocyte,KC)共培養后發現各組KC增殖率降低、凋亡率升高,以20 g/L外泌體組變化最顯著;進一步檢測發現20 g/L外泌體組刺激KC后表達的角蛋白K6(KC活化標記物)、K10(KC分化標記物),以及胸腺基質淋巴生成素(TSLP)、IL-33水平明顯高于對照組。韓悅等[25]將不同濃度健康人外泌體與KC共培養,較空白對照組,KC增殖水平明顯降低和凋亡水平明顯增高,并確定40 g/L為最佳蛋白濃度;與其余對照組相比,AD組外泌體與KC共培養后,發現K16(KC活化標記物)、K10、IVL(KC分化標記物)、TSLP、IL-25、IL-33、CXCL2表達上調。KC是表皮中數量最多的細胞,也是建立表皮屏障和免疫穩態的關鍵細胞,當KC出現活化、增殖、分化等異常,可促發免疫反應,炎癥因子分泌增加,加劇皮膚炎癥損傷[29]。上述研究提示外泌體可能通過調控KC的活化、分化、增殖、凋亡和相關炎性細胞因子分泌,破壞表皮屏障,引發免疫反應,參與AD發病。

Wang等[26]發現與對照組相比,經間充質干細胞來源外泌體(MSC-ex)治療的AD小鼠模型皮損愈合更快,治療后皮損組織病理示表皮厚度恢復正常、淋巴細胞浸潤減少、真皮血管增生等表現;MSC-ex抑制外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)增殖,促進PBMC向調節性T細胞(Regulatory T cells,Treg)分化,Treg細胞比例增加。Treg細胞是維持AD患者免疫穩態的重要細胞之一,研究[30]發現AD患者外周血Treg細胞比例降低,提高Treg細胞水平可抑制效應T細胞異常活化、維持自身免疫耐受、控制炎癥反應等,最終控制AD發病。MSC-ex可以通過提高Treg細胞比例調節免疫平衡、減輕AD皮損炎癥細胞浸潤、修復表皮和真皮等方式加速皮損愈合。

Cho等[27]對AD小鼠模型注射人脂肪間充質干細胞來源外泌體(ASC-exosomes),治療后小鼠皮損肥大細胞浸潤減少,血清IgE水平和嗜酸性粒細胞數量明顯降低,以及IL-4、IL-31、IL-23和TNF-α水平下調。Shin等[28]同樣研究證實ASC-exosome治療能顯著改善小鼠的AD樣皮損,降低皮膚IL-4、IL-5、IL-13、TNF-α、TSLP等炎癥介質水平;脂質定量分析發現治療后小鼠表皮神經酰胺含量顯著增加。神經酰胺是角質層主要脂質成分之一,可維護表皮脂質結構和滲透屏障功能,AD患者表皮神經酰胺含量降低,角質層脂質成分失調,引起表皮滲透屏障功能損傷[31]。ASC-exosome不僅通過降低細胞因子分泌來抑制皮膚炎癥,還通過調節皮膚脂質代謝,促進神經酰胺產生來修復屏障,以此提供了一種無細胞治療AD的新手段。

3 外泌體與銀屑病

銀屑病是一種以紅斑、斑塊、鱗屑,伴瘙癢為特征的慢性、終身性、炎癥性皮膚病,包括尋常型銀屑病、紅皮病型銀屑病、膿皰型銀屑病、關節病型銀屑病等多種類型,全球超1億人患病[32]。皮膚創傷、感染、紫外線、精神壓力、高脂血癥、高血壓等因素均可能影響銀屑病的發生發展,遺傳易感性和自身免疫紊亂是銀屑病的主要病因[33,34]。角質形成細胞異常分化增殖以及免疫細胞浸潤是銀屑病的典型特征[35],研究[36,37]發現外泌體可能通過介導角質形成細胞與免疫細胞間通訊參與銀屑病發病。

Jiang等[36]通過IL-17、IL-22等銀屑病相關因子處理角質形成細胞,從中提取外泌體,發現角質形成細胞外泌體可以顯著誘導中性粒細胞發生炎性細胞死亡(NETosis),還通過NF-kB和p38 MAPK信號通路促進中性粒細胞增殖活化,使IL-6、IL-8和TNF-a的表達水平增高;在銀屑病小鼠模型中予以外泌體分泌抑制劑GW4869后發現皮損中角質形成細胞增殖減少、中性粒細胞浸潤降低,而皮下注射角質形成細胞外泌體后,小鼠皮損炎癥程度加重。Shao等[37]發現泛發性膿皰型銀屑病患者中性粒細胞外泌體能激活MAPK和NF-kB通路,誘導角質形成細胞高表達IL-1β、IL-18、IL-36G、TNF-a等介質,而經過GW4869處理過的中性粒細胞上清液則不能誘導角質形成細胞高表達上述因子;角質形成細胞在外泌體的刺激下分泌趨化因子,進一步誘導中性粒細胞遷移,加強皮膚炎癥浸潤。中性粒細胞與角質形成細胞都是參與銀屑病發病的關鍵細胞,在各種損傷刺激下,角質形成細胞釋放趨化因子,誘導中性粒細胞由血液循環聚集至皮膚炎癥部位,進一步產生活性氧物質、脫顆粒和形成中性粒細胞胞外陷阱(Nets),上述過程可造成生物大分子、細胞等出現氧化損傷,引起炎癥介質分泌,反之促進角質形成細胞增殖和血管增生,加劇皮膚炎癥反應[38]。上述研究提示外泌體在角質形成細胞和中性粒細胞之間傳遞信息,使兩者相互作用,破壞皮膚免疫失調,引起銀屑病皮損。

Zhang等[39]通過人臍帶間充質干細胞外泌體(hucMSCs-Exo)治療銀屑病小鼠模型,小鼠皮損嚴重程度和炎癥浸潤程度均低于對照組,并抑制皮損中IL-17、IL-23和CCL20表達;將hucMSCs-Exo與樹突狀細胞共培養,發現外泌體可抑制樹突狀細胞的成熟、活化以及降低IL-23產生。Zhang等[40]在銀屑病小鼠模型中予以MSC-ex治療后,外泌體組小鼠皮膚中IL-17和IL-23的含量較對照組降低。有研究[41]用表達細胞因子信號抑制因子(Suppressor of cytokine signaling1,SOCS1)的重組腺病毒感染樹突狀細胞,從中分離外泌體,與咪喹莫特組小鼠相比,咪喹莫特+外泌體治療組小鼠皮膚紅斑、鱗屑明顯更少,組織病理顯示真皮淋巴細胞浸潤減少,皮損中IL-17A和IL-23表達降低,治療機制可能與外泌體中SOCS1蛋白通過JAK/STAT信號通路抑制Th17細胞分化,減少IL-17A分泌有關。IL-17/IL-23軸在銀屑病發病機制中發揮作用,也是治療的關鍵靶點,銀屑病患者皮損顯著高表達IL-23,樹突狀細胞是IL-23的主要來源之一,IL-23可促進Th17細胞分化增殖,產生IL-17、IL-22等細胞因子,進一步作用于角質形成細胞、成纖維細胞等靶細胞,誘導其他炎癥因子產生,共同加重銀屑病樣皮膚病變[42]。外泌體可能通過抑制IL-17和IL-23的產生發揮免疫調節作用。

4 外泌體與口腔扁平苔蘚

扁平苔蘚(lichen planus,LP)是一種原因復雜的自身免疫性、炎癥性皮膚病,可累及全身各處皮膚、黏膜或指/趾甲,臨床以紫紅色多角形扁平丘疹伴瘙癢為典型皮膚表現,其中口腔扁平苔蘚(oral lichen planus,OLP)影響0.5%～1.5%人口,以頰黏膜Wickham紋為特征性表現,具有潛在惡性轉化或感染可能[43]。LP發病機制由T細胞、NK細胞、樹突狀細胞、角質形成細胞等多種細胞參與,以細胞毒性T細胞為主要介導細胞[44]。

Yang等[45]發現OLP患者T細胞來源外泌體(T-exos)中IL-7、IL-10、IL-12、IL-17的表達水平明顯增高,經T-exos處理的角質形成細胞凋亡率提高,并出現細胞大小不均、胞質空泡化、細胞碎片增多等形態改變。T細胞可能通過釋放外泌體,提高炎癥介質水平來介導OLP免疫反應;外泌體中TNF-α可能與角質形成細胞表面受體結合,激活caspase級聯反應導致口腔角質形成細胞凋亡。Peng等[46]將OLP患者血漿來源外泌體與T細胞共培養,發現外泌體可以促進T細胞增殖、遷移并抑制其凋亡,檢測發現上清液中IFN-γ水平增高,外泌體可能通過調節T細胞介導的免疫反應來參與OLP發病。有研究[47]同樣發現T-exos不僅上調T細胞IL-10、IL-17表達,還可促進巨噬細胞、中性粒細胞等其他免疫細胞分泌巨噬細胞炎癥蛋白(MIP)-1α/β,MIP-1α/β進一步與T細胞表面受體CCR1/5結合,誘導外周T細胞遷移至病變部位,加重OLP口腔黏膜淋巴細胞浸潤。外泌體可能通過作用于淋巴細胞、角質形成細胞等免疫細胞,以上調炎癥介質表達或調控細胞生物功能的方式參與OLP發病。

5 外泌體與大皰性類天皰瘡

大皰性類天皰瘡(bullous pemphigoid,BP)是一種常見的自身免疫性皰病,以軀干、四肢紅斑基礎上的緊張性大皰或水皰伴明顯瘙癢為典型表現,黏膜較少受累,通常影響老年人[48]。高齡、神經和精神系統疾病、藥物(如利尿劑、抗生素、鎮痛藥、降糖藥等)、其他皮膚疾病(如扁平苔蘚、銀屑病等)等可能是BP的危險因素[49]。BP的組織病理特點是表皮下水皰,伴有真皮內大量炎癥細胞浸潤,其病變主要是由存在于皮膚基底膜帶半橋粒中的致病性抗原BP230、BP180與自身抗體結合而引起,抗原抗體結合后激活補體系統,使肥大細胞、中性粒細胞等活化、脫顆粒,釋放金屬蛋白酶、彈性蛋白酶、趨化因子等物質,導致表皮、真皮分離,形成表皮下水皰[50]。

為探索BP患者水皰液加重皮膚損傷的機制,Fang等[51]從BP患者水皰液中提取外泌體,發現外泌體可能通過激活ERK1/2和STAT3信號通路使角質形成細胞產生IL-6、TNF-α和CXCL8,CXCL8發揮趨化作用促使中性粒細胞遷移至皮損部位;外泌體質譜分析沒有發現BP180或BP230,但檢測到外泌體中含有少量抗體片段和補體成分。外泌體可能通過上調炎癥介質表達和誘導炎癥細胞浸潤,加劇BP皮損。

6 外泌體與蕁麻疹

蕁麻疹是一種臨床常見的過敏性、炎癥性皮膚疾病,以風團和不同程度瘙癢為特征,伴或不伴血管性水腫,皮損易反復發作,通常在24小時內消退。蕁麻疹發病機制非常復雜,肥大細胞是關鍵效應細胞,各種原因引起肥大細胞活化、脫顆粒,釋放組胺、細胞因子、趨化因子等一系列炎癥介質,引起血管通透性增加、平滑肌收縮和腺體分泌增加,從而引發風團。對于引發肥大細胞活化脫顆粒的機制未完全明確,現有研究[52]提出IgE、抗IgE的IgG自身抗體、補體(如C3a、C5a等)、前列腺素、蛋白酶、神經肽等物質可通過作用于肥大細胞表面受體,誘導肥大細胞脫顆粒參與發病。

為進一步探索引起肥大細胞活化的因素,Fang等[53]從慢性自發性蕁麻疹(chronic spontaneous urticaria,CSU)患者和健康志愿者的血漿中提取外泌體,體外刺激人肥大細胞株HMC-1,發現HMC-1脫顆粒,釋放組胺、細胞因子(包括IL6、TNFα、IL4)、類胰蛋白酶、趨化因子(包括CXCL1、CXCL5、CCL-2)、血管內皮生長因子等多種介質,且抗組胺治療無效患者所釋放的介質水平明顯高于抗組胺治療有效患者和健康對照;外泌體提高HMC-1表面Toll樣受體(TLR)2/4表達和MAPK磷酸化,考慮外泌體通過激活TLR2、TLR4和MAPK通路誘導肥大細胞活化,抗組胺治療無效患者可能存在其他機制使組胺分泌量顯著增高而加重病情。

7 小結

綜上所述,不同細胞來源的外泌體參與特應性皮炎、銀屑病、口腔扁平苔蘚、大皰性類天皰瘡、蕁麻疹等炎癥性皮膚疾病的發生發展。外泌體通過調節細胞分化、增殖、活化、凋亡等生物學過程,影響皮膚正常生理功能,使其發生病理改變;通過激活信號通路,增加炎癥介質表達,促發皮膚炎癥反應;通過介導細胞間通訊,上調趨化因子誘導免疫細胞遷移,加劇皮損炎癥浸潤;還可作為減輕炎癥損傷、抑制皮膚炎癥進展的新型治療方式。對于外泌體中不同生物活性物質在炎癥性皮膚疾病中的作用以及外泌體的具體調控機制還需要進一步研究,以早日明確外泌體在炎癥性皮膚疾病診斷和治療上的價值。