溫陽貼貼敷涌泉穴對慢性心力衰竭病人血清UCP2、外泌體及外泌體內miR-320水平的影響

楊瑞霞 何亞州 郭雨西 唐孝 張安東

基金項目?廣西壯族自治區教育廳廣西高校中青年教師科研基礎能力提升項目（No.2020KY07018）；廣西中醫藥大學校級課題（No.019MS038）

作者單位?廣西國際壯醫醫院（南寧 ?530201）

通訊作者?何亞州，E-mail：hezhouzhou888@foxmail.com

引用信息?楊瑞霞，何亞州，郭雨西，等.溫陽貼貼敷涌泉穴對慢性心力衰竭病人血清UCP2、外泌體及外泌體內miR-320水平的影響［J］.中西醫結合心腦血管病雜志，2024，22（7）：1287-1291.

摘要?目的：探討溫陽貼貼敷涌泉穴對慢性心力衰竭（CHF）病人解偶聯蛋白-2（UCP2）、血清外泌體及外泌體內miR-320水平的影響，挖掘其作用機制。方法：選取60例CHF病人，隨機分為對照組、電針組、穴位貼敷組，每組20例。對照組以西藥治療，電針組、穴位貼敷組分別在西藥治療的基礎上加用電針、溫陽貼刺激涌泉穴。試劑盒法提取血清外泌體，免疫印跡（Western Blot）法檢測CD63、CD81、TSG101、Alix蛋白表達， 納米顆粒跟蹤分析（NTA）檢測徑粒大小。使用酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測病人血清中UCP2、氨基末端腦鈉肽前體（NT-proBNP）表達水平及外泌體分泌量，實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-PCR）檢測外泌體內miR-320水平。對NT-proBNP、UCP2、外泌體分泌量、miR-320進行相關性分析。結果：CD63、CD81、TSG101、Alix蛋白陽性表達，NTA徑粒分析顯示符合外泌體徑粒大小。穴位貼敷組NT-proBNP、UCP2、miR-320表達水平高于電針組與對照組（P＜0.05）；穴位貼敷組外泌體分泌量高于電針組與對照組（P＜0.05）。NT-proBNP與UCP2、miR-320呈正相關（P＜0.01），與外泌體分泌量呈負相關（P＜0.01）；UCP2與miR-320呈正相關（P＜0.01），與外泌體分泌量呈負相關（P＜0.01）；外泌體分泌量與miR-320呈負相關（P＜0.01）。結論：溫陽貼的治療CHF的機制可能與外泌體、miR-320的調控以及UCP2介導的心肌能量代謝相關。

關鍵詞?慢性心力衰竭；溫陽貼；涌泉穴；解偶聯蛋白-2；外泌體；miR-320

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.07.023

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是臨床上多種心血管疾病的最終轉歸，隨著時代的發展、科技的進步，臨床中對CHF的治療手段不斷得到豐富，但其居高不下的發病率及再住院率給個人及社會帶來了巨大的經濟負擔，也給病人及家屬帶來了極大的精神壓力，為此迫切需要探尋一種新的治療模式，以期降低CHF病人發病率，改善病人生活質量［1］。CHF在中醫學中屬“水腫”“喘證”等范疇，病機多為機體陰陽失調，心陽不振致水飲凌心，痰結、血瘀、水飲為標，素體陽虛為根本，治療上多予溫補心陽、利水養心為法。在現有的治療模式中，主要有西藥結合中藥湯劑、針灸、穴位貼敷等治療方法，其中，穴位貼敷法以其良好的療效及簡便的操作在CHF的中西醫結合臨床診療中占據重要的位置。本課題組前期研究表明，CHF病人miR-320水平明顯升高，且這些microRNA主要來源于外泌體中，miR-320水平的上調，加重了心肌纖維化，影響了CHF的發展過程［2］。同時，本課題組通過前期臨床觀察發現，使用溫陽貼貼敷涌泉穴，能有效改善病人癥狀及心功能情況，但潛在機制尚不明確，故本研究以溫陽貼貼敷CHF病人側涌泉穴，探討其對CHF病人解偶聯蛋白-2（uncoupling protein 2，UCP2）、血清外泌體及外泌體內含miR-320水平的影響，進一步分析溫陽貼對CHF的作用及治療機制。

1?資料與方法

1.1?臨床資料

參照《中國心力衰竭診斷和治療指南2018》［1］及《慢性心力衰竭中西醫結合診療專家共識》中的診斷標準，選取2020年6月—12月在我院住院治療的CHF（陽虛型）病人60例，隨機分為對照組、電針組與穴位貼敷組，各20例。本研究經廣西國際壯醫醫院倫理委員會審核批準，同時已詳細告知病人本研究的研究目的、方法及相關事項，病人表示同意，并簽署臨床科研項目受試者知情同意書。

1.2?治療方法

對照組：依照《中國心力衰竭診斷和治療指南2018》［1］，在一般治療基礎上，給予CHF常規西藥治療，不使用任何中壯藥、中成藥、中藥針劑等中壯醫治療措施。電針組：在對照組治療的基礎上加用電針刺激雙側涌泉穴。操作如下：病人取仰臥位，常規消毒雙足底皮膚后將理療電極片貼敷于涌泉穴，連接電針儀并調節刺激強度至病人能耐受為度，治療時間為30 min，每日1次，每周5次。穴位貼敷組：在對照組治療基礎上加用溫陽貼貼敷雙側涌泉穴，操作如下：以等量的黃芪、艾草、肉桂藥粉以姜汁調和成糊狀，取適量攤于無菌敷貼內側面，常規消毒病人雙足底皮膚后，貼敷于病人雙側涌泉穴，每晚睡前敷1次，每次8 h。療程均為4周。

1.3?實驗室指標檢測

1）血清樣本制備：待各組病人療程結束后抽取病人靜脈血5 mL，4 ℃條件下靜置2 h后，3 500 r/min低溫離心15 min分離血清，轉移至儲存管備用。2）試劑盒法提取血清外泌體：取血清3 mL，經0.8 μm針頭過濾器過濾除去細胞碎片，轉移至新儲存管中。使用Qiagen外泌體提取試劑盒提取外泌體，相關操作按說明書進行。 3）外泌體鑒定：使用免疫印跡（Western Blot）法檢測外泌體特異性蛋白 CD63、CD81、TSG101、Alix。 提取總蛋白，電泳、轉膜，脫脂牛奶封閉120 min，一抗孵育（1∶1 000），4 ℃孵育過夜。 二 抗（1∶2 000）孵育120 min，TBST洗滌5次，顯影、分析。外泌體樣本經磷酸緩沖鹽溶液（PBS）稀釋后使用納米顆粒追蹤分析（NTA）進行徑粒分析。4）酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測血清氨基末端腦鈉肽前體（NT-proBNP）、UCP2及外泌體分泌水平：按照試劑盒說明書的方法進行操作。5）實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-PCR）檢測外泌體內miR-320水平：提取總RNA，逆轉錄后擴增，miR-320引物序列為GCTGGGTTGAGAGGGCGA，以U6為外參，外參序列為CTCGCTTCGGCAGCACA，應用2－△Ct法計算miR-320的相對表達量，△Ct＝ CtmiR-320－CtmiR-U6。

1.4?主要儀器及試劑

試劑：ExoEasy Maxi Kit（Qiagen，76064）；miRNA提取試劑盒（Qiagen，217004）；

Western Blot一抗：Anti-TSG101、Anti-CD63、Anti-CD81、Anti-Alix（Abcam，ab125011、ab134045、ab155760、ab76608）；Anti-GAPDH（北京中杉金橋，TA-08）；山羊抗兔的二抗（北京博奧森，ZB2301）；UCP2 ELISA試劑盒（北京方程生物科技有限公司）；外泌體ELISA定量試劑盒（EXO-ELIS）；miRcute miRNA isolation Kit（天根生物科技有限公司，DP501）。

儀器：離心機（Centrifuge 5415D，Eppendorf）；生物分光光度計（BioPhotometer，Eppendorf）；熒光定量PCR儀（CFX Connect，TM BIO-RAD）；電泳儀（DYCZ-24DN，北京六一公司生產）；半干轉膜儀（WSE-4040、AE6675L，ATTO）；恒溫水浴槽（HHS-8金壇醫療）；酶標儀（Thermo，美國）；納米顆粒跟蹤分析儀（ZetaView，德國Particle Metrix）。

1.5?統計學處理

采用SPSS25.0軟件進行統計分析。符合正態分布的定量資料采用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，相關性分析采用Pearson分析法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2?結?果

2.1?外泌體鑒定

本研究使用Western Blot分別鑒定了所獲樣本中外泌體表面的標志性蛋白CD63、CD81、TSG101、Alix，結果均呈陽性。使用NTA徑粒分析樣本顆粒徑粒分布情況，結果顯示所獲樣本顆粒大小在80～200 nm之間，符合外泌體徑粒大小。詳見圖1、圖2。

2.2?3組治療后NT-proBNP、UCP2、外泌體定量、miR-320水平比較

穴位貼敷組治療后NT-proBNP表達水平低于電針組與對照組（P＜0.05），電針組低于對照組（P＜0.05）。穴位貼敷組治療后UCP2表達水平低于電針組與對照組（P＜0.05），電針組低于對照組（P＜0.05）。穴位貼敷組治療后外泌體分泌量高于電針組與對照組（P＜0.05），電針組與對照組差異無統計學意義（P＞0.05）。穴位貼敷組治療后miR-320表達水平低于電針組與對照組（P＜0.05），電針組低于對照組（P＜0.05）。詳見表1。

2.3?NT-proBNP、UCP2、外泌體定量、miR-320水平的相關性

NT-proBNP與UCP2、miR-320呈正相關（r＝0.67，P＜0.01；r＝0.70，P＜0.01），與外泌體分泌量呈負相關（r＝－0.61，P＜0.01）；UCP2與miR-320呈正相關（r＝0.40，P＜0.01），與外泌體分泌量呈負相關（r＝－0.37，P＜0.01）；外泌體分泌量與miR-320呈負相關（r＝－0.69，P＜0.01）。詳見圖3。

3?討?論

解偶聯蛋白（uncoupling protein，UCP）是線粒體內膜上的內膜蛋白，其可以在生物學過程中將氧化及磷酸化進程脫偶聯，減少三磷酸腺苷（ATP）的正常生成［3］。研究顯示，在哺乳動物中，UCP具有6種亞型（UCP1-6），而UCP2在心臟、腎臟、肝臟及骨骼肌等器官組織中廣泛表達［4］。UCP2基因位于人類第11號染色體上，基因長度為8.4 kb，有8個外顯子編碼309個氨基酸和6個跨膜蛋白，目前已發現其參與機體多種生理及病理過程，UCP2影響心肌細胞中的能量代謝過程可能是調控CHF的潛在作用機制［5］。

心肌細胞中含有大量的線粒體，正常情況下線粒體為心肌細胞提供必須的能量，而當心肌細胞處在病理狀態時，大量的線粒體隨之發生功能障礙［6］，最終導致心肌能量代謝紊亂。研究證實，當心力衰竭發生時，心肌細胞中ATP含量會明顯下降，而UCP2及脂肪酸濃度明顯上升［7］，心肌細胞的ATP需求得不到滿足成為心力衰竭時心肌細胞能量代謝障礙的中心矛盾。然而，UCP2水平上升使氧化及磷酸化過程脫偶聯，降低線粒體膜電位，同時促進無氧糖酵解，繼續增加脂肪酸含量，形成惡性循環，進一步使ATP合成減少，甚至發生酸中毒，加重心力衰竭程度［8］，UCP2參與了CHF的發生、發展過程。

miRNAs及外泌體目前已被發現在多種生物學過程中起關鍵作用，如氧化應激、細胞生成、凋亡、自噬、免疫調控等［9-12］，而其對CHF的調控作用也正逐步被挖掘。研究表明，發生心力衰竭時，機體分泌的外泌體中的miRNAs將會出現差異性表達，而這些差異性表達的miRNA或許會參與疾病的發生及發展過程，如促進心肌纖維化、心臟結構重塑、增強或抑制心肌細胞的凋亡等［13-16］。其中，心肌纖維化是貫穿于CHF發病過程的重要因素，是CHF防治的重要靶點之一。在前期研究中，發現來源于外泌體的miR-320可通過磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路調控心肌纖維化，且miR-320水平與心肌纖維化嚴重程度呈正相關，因此，推測miR-320可以通過調控心肌纖維化影響CHF的發生、發展。本研究在西藥治療的基礎上加用溫陽貼貼敷涌泉穴，觀察其對CHF病人NT-proBNP、UPC2、miR-320表達水平及外泌體定量的影響，并分析了各指標之間的相關性，結果表明外泌體分泌量可能與CHF的嚴重程度呈負相關，結合前期研究，推測在病理狀態下，血清中外泌體大量進入細胞內，使心肌細胞中miR-320上調，同時影響UPC2介導的心肌能量代謝過程，從而引起心肌纖維化的發生，進而導致CHF。

心力衰竭歸屬于中醫學“水腫”“喘證”等范疇，屬本虛標實之證，病因以“水”“虛”“瘀”為主，病機多以心陽、心氣虛衰，至水飲內停、凌心，治則多以溫陽利水、益氣活血為法［17］。心陽不足為心衰的主要因素，故溫陽法成為心衰病的重要治則之一。心為君主之官，主血脈，屬火，為陽中之陽，而腎臟主水及納氣，屬水，為人體陰陽之根本，與心衰病的關系尤為密切。心為君火，腎為相火，君火在上，如明照當空，相火在下，系陽氣之根。心在上，腎在下，上位者降為和，下位者，升為順，心之陰陽須降于腎，充養腎陰、腎陽；腎之陰陽需上升至心，以溫養心之陰陽。兩臟陰陽之間上下交通，相互依存，才能維持陰陽動態平衡，即水火既濟，心腎相交，如《慎齋遺書》有云：“心腎相交，全憑升降……升降者水火。”發生心衰時，則為心腎陽氣互資障礙，陰陽紊亂［18］，因此，心衰病雖病位在心，但治療中對腎陽的溫補不可忽視。

穴位貼敷治療是中醫外治法中的重要組成部分，其通過藥物貼敷特定穴位，讓藥性緩緩釋放，通過經絡疏通氣血、調理陰陽從而達到治療疾病的作用［19］。研究表明，穴位貼敷療法在多種心血管疾病的治療中有著較好的療效［20-22］。溫陽貼由肉桂、黃芪、艾草組成，肉桂其性大熱，味辛、甘，歸腎、脾、心、肝經，具有活血通經、補火助陽、引火歸元、散寒止痛、溫通經脈的功效。黃芪味甘，性微溫，歸肺、脾、肝、腎經，具有益氣固表、升陽舉陷之功，是補氣佳品。艾草味苦、辛，性溫，歸肝、脾、腎經，具有溫經驅寒之功效，佐以姜汁調和意在增強溫通之效。涌泉穴歸屬足少陰腎經，是本經脈氣所出之井穴，“井”者視為萬物始生也，故以溫陽貼貼敷雙側涌泉穴，旨在徐徐資腎陽，使腎經之氣如涌泉濤濤，上達臟腑，溫通散寒。本課題組在前期臨床觀察中發現溫陽貼貼敷涌泉穴可有效改善CHF病人的心功能，但相關機制并不明確，本研究結果表明，或許與外泌體、miR-320的調控機制以及UCP2介導的心肌能量代謝機制相關，有望進一步的深入研究以挖掘CHF防治的新靶點。

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（收稿日期：2022-08-24）

（本文編輯王麗）