miR-23a-3p、ZNF395水平與妊娠期高血壓病人胎兒生長受限的關系

朱麗 劉麗芳

基金項目?深圳市寶安區科技計劃基礎研究項目（No.20200514112429001）

作者單位?1.深圳市中西醫結合醫院（廣東深圳 ?518000），E-mail：a13712296366@126.com；2.贛南醫學院附屬第一醫院

引用信息?朱麗，劉麗芳.miR-23a-3p、ZNF395水平與妊娠期高血壓病人胎兒生長受限的關系［J］.中西醫結合心腦血管病雜志，2024，22（7）：1306-1309.

摘要?目的：探討妊娠期高血壓病人胎盤組織微小RNA-23a-3p（miR-23a-3p）、鋅指蛋白395（ZNF395）水平與胎兒生長受限的關系。方法：選取120例妊娠期高血壓病人作為研究對象，根據孕期胎兒生長狀況將其分為正常對照組（95例）和胎兒生長受限組（25例）。采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）法檢測胎盤組織中miR-23a-3p表達水平，免疫組化法檢測ZNF395蛋白表達水平，收集新生兒體重、胎盤重量等一般資料；采用Pearson法及Spearman法分析胎兒生長受限病人胎盤組織miR-23a-3p、ZNF395水平與新生兒體重、胎盤重量的相關性；采用單因素及多因素Logistic回歸分析胎兒生長受限的影響因素。結果：胎兒生長受限組胎盤組織ZNF395蛋白陽性率、新生兒體重、胎盤重量低于正常對照組，miR-23a-3p水平高于正常對照組（P＜0.05）。胎兒生長受限病人胎盤組織miR-23a-3p與ZNF395水平呈負相關（P＜0.05）；新生兒體重、胎盤重量與miR-23a-3p呈負相關（P＜0.05），與ZNF395呈正相關（P＜0.05）。miR-23a-3p是胎兒生長受限的獨立危險因素（P＜0.05），ZNF395是胎兒生長受限的保護因素（P＜0.05）。結論：胎兒生長受限病人胎盤組織中miR-23a-3p高表達，ZNF395低表達，miR-23a-3p可能通過下調ZNF395表達影響胎兒生長發育。

關鍵詞?妊娠期高血壓；胎盤組織；胎兒生長受限；微小RNA-23a-3p；鋅指蛋白395

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.07.027

胎兒生長受限是產科常見妊娠合并癥之一，指胎兒在母體內因各種因素導致其生長受到限制而未能到達其應表現出的生長速率，從而使胎兒致殘率和病死率增高，甚至會增加胎兒成年后的患病率［1］。妊娠期高血壓孕產婦易合并胎兒生長受限，故近年來已引起高度關注［2］。滋養細胞侵入異常、胎盤血供異常均是影響胎兒生長發育的因素［3］。微小RNA-23a-3p（miR-23a-3p）參與細胞發育的各個階段，其中包括增殖、侵襲、遷移、凋亡［4］。鋅指蛋白395（zinc finger protein 395，ZNF395）可參與腫瘤進展，且有研究表明ZNF395與胎兒生長發育有關［5-6］。本研究前期通過生物信息學預測網站miRDB（http：//mirdb.org/cgi-bin/search.cgi）預測發現，miR-23a-3p與ZNF395存在靶向結合位點。推測miR-23a-3p可能通過靶向ZNF395調控胎兒生長發育。因此，本研究主要探討妊娠期高血壓病人胎盤組織miR-23a-3p、ZNF395水平與胎兒生長受限的關系，以期為胎兒生長受限提供基因修飾靶點。

1?對象與方法

1.1?一般資料

選取我院2020年6月—2022年6月收治的120例妊娠期高血壓病人作為研究對象，年齡25～33（29.06±3.46）歲。根據胎兒生長狀況將孕婦分為正常對照組（95例）和胎兒生長受限組（25例）。納入標準：1）符合妊娠期高血壓診斷標準［7］，胎兒生長受限組符合胎兒生長受限診斷標準（新生兒體重不足同期新生兒體重平均值的90%或足月分娩新生兒體重低于2.5 kg）［8］，正常對照組以《婦產科學》相關標準為參考（足月新生兒體重＞2.5 kg且＜4.0 kg）；2）孕周≥37周；3）病歷資料齊全；4）均為單胎頭位妊娠。排除標準：1）胎兒伴有宮內感染性疾病或先天性心臟病等疾病；2）孕婦妊娠期間存在飲酒及吸煙史，或依從性較差者；3）孕婦妊娠期間合并前置胎盤、膽汁淤積等其他妊娠內科合并癥。本研究經我院臨床研究倫理委員會批準，符合倫理學標準，病人知情同意并簽署知情同意書。

1.2?主要試劑與儀器

免疫組化試劑盒（貨號：YDDEF001）購自上海羽哚生物科技有限公司；ZNF395抗體（貨號：340163.000）購自艾美捷科技有限公司；RNA提取試劑盒（貨號：R1200-100）購自北京索萊寶科技有限公司；qPCR SYBR Green Master Mix（貨號：YB11201ES03）購自上海鈺博生物科技有限公司；反轉錄試劑盒（貨號：YT9036）購自北京伊塔生物科技有限公司；實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）儀（型號：CFX384）購自美國Bio-Rad公司。

1.3?研究方法

1.3.1?樣品采集及保存

采集受試者新鮮胎盤，無菌操作取胎盤滋養層組織1 cm×1 cm×1 cm（臍帶附著處至胎盤另一面中央區1/2處），放入經焦炭酸二乙酯處理的冷凍管中，保存待測。

1.3.2?miR-23a-3p表達水平測定

采用RNA提取試劑盒及反轉錄試劑盒提取胎盤組織總RNA后反轉錄為cDNA，具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。采用qRT-PCR儀對miR-23a-3p及其內參進行擴增，引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見表1。反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環。qRT-PCR反應體系：cDNA（50 ng/μL）2 μL，正反向引物（10 μmol/L）各0.8 μL，qPCR SYBR Green Master Mix 10 μL，雙蒸水（ddH2O）6.4 μL。每份樣品均設3個重復孔，采用2－△△CT法計算胎盤組織miR-23a-3p相對表達量。

1.3.3?ZNF395蛋白水平測定

將胎盤組織標本采用4%多聚甲醛固定、石蠟包埋、連續切片，采用免疫組織化學法檢測胎盤組織ZNF395蛋白表達水平，具體染色方法按照通用免疫組化試劑盒說明書進行操作。隨機選5個高倍鏡視野觀察（計數200個細胞），由2名高年資的病理醫師采用半定量法進行評分，按陽性細胞比例計分，陽性細胞比例0～＜26%計1分，26%～＜51%計2分，51%～75%計3分，＞75%計4分；按染色強度計分：棕褐色計3分，棕黃色計2分，淺黃色計1分，無色計0分。2次評分乘積≤2分為陰性表達，＞2分為陽性表達。

1.4?統計學處理

采用SPSS 25.0統計軟件分析數據。定量資料符合正態分布，用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較行t檢驗；定性資料采用例數、百分比（%）表示，組間比較行χ2檢驗；采用Pearson法及Spearman法分析胎兒生長受限病人胎盤組織miR-23a-3p、ZNF395水平與新生兒體重、胎盤重量的相關性；采用單因素及多因素Logistic回歸分析法分析胎兒生長受限的影響因素。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2?結?果

2.1?兩組臨床資料比較

兩組孕婦年齡、孕前體質指數（BMI）、孕中期BMI增加、孕周、分娩史、新生兒性別、孕期羊水量異常情況比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。詳見表2。

2.2?兩組新生兒體重及胎盤重量比較

胎兒生長受限組新生兒體重、胎盤重量低于正常對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。詳見表3。

2.3?兩組胎盤組織miR-23a-3p、ZNF395蛋白水平比較

胎兒生長受限組胎盤組織miR-23a-3p水平高于正常對照組，ZNF395蛋白陽性率低于正常對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。詳見表4。

2.4?胎兒生長受限病人胎盤組織中miR-23a-3p、ZNF395水平與新生兒體重、胎盤重量的相關性

相關分析結果顯示，胎兒生長受限病人胎盤組織miR-23a-3p與ZNF395水平呈負相關（r＝－0.582，P＜0.05）；新生兒體重、胎盤重量與miR-23a-3p呈負相關（r值分別為－0.504，－0.527，P均＜0.05），與ZNF395 呈正相關（r值分別為0.489，0.513，P均＜0.05）。

2.5?胎兒生長受限影響因素的單因素及多因素Logistic回歸分析

以是否存在胎兒生長受限為因變量，以miR-23a-3p、ZNF395、年齡、孕前BMI、孕中期BMI增加、孕周、分娩史、新生兒性別、孕期羊水量異常為自變量，進行單因素Logistic回歸分析，以單因素分析結果中差異有統計學意義的指標miR-23a-3p、ZNF395、孕期羊水量異常為自變量，進行多因素Logistic回歸分析，結果顯示，miR-23a-3p是影響胎兒生長受限的獨立危險因素（P＜0.05），ZNF395是影響胎兒生長受限的保護因素（P＜0.05）。詳見表5、表6。

3?討?論

妊娠期高血壓是婦產科常見病和多發病，其病因尚未完全闡明，但重度妊娠期高血壓病人體內小動脈存在痙攣的情況，會導致胎盤血流灌注不足進而致使胎兒宮內生長受限［9-10］。胎兒生長受限不僅對新生兒生長發育造成影響，還可能會對心血管及大腦等系統發育產生不利影響，增加孕產婦痛苦，嚴重影響優生優育，同時給家庭和社會帶來嚴重的醫療負擔［11-12］。因此，尋找相關基因修飾靶點，進而及時采取個體化治療措施，可能是改善胎兒生長受限、降低疾病發生率的有效措施。

miRNA主要通過與靶基因特異性配對結合，在轉錄后水平負性調控靶基因表達［13］。miR-23表達參與骨骼肌的發育［14］。miR-23a是miR-23的一種亞型，也是腫瘤研究中的明星分子，一般作為致癌基因促進癌細胞生長、侵襲轉移［15-16］。ZNF395是鋅指蛋白家族的成員，是一個核質穿梭轉錄因子，最初被鑒定為調控人乳頭狀瘤病毒的轉錄因子，參與細胞生長和凋亡［17-18］。根據胎兒生長受限診斷標準將本研究中120例妊娠期高血壓孕婦分為胎兒生長受限組和正常對照組，結果顯示，胎兒生長受限組胎盤組織miR-23a-3p水平高于正常對照組，ZNF395蛋白陽性率水平低于正常對照組，且miR-23a-3p是胎兒生長受限的獨立危險因素，ZNF395是胎兒生長受限的保護因素。ZNF395表達趨勢與曹文紅等［6］研究結果一致。提示胎盤組織中miR-23a-3p、ZNF395的表達差異可能與胎兒生長受限的發生具有一定的相關性，其機制可能為部分妊娠期高血壓病人血流高阻低排導致子宮有效灌注壓降低，內皮細胞受損，miR-23a-3p表達量升高，miR-23a-3p在轉錄后水平負性調控靶基因ZNF395使其低表達，進而影響滋養細胞的正常侵入和遷移，造成胚胎發育異常，最終影響胎兒生長發育，導致胎兒生長受限；亦或是miR-23a-3p通過抑制ZNF395表達，影響子宮血流動力學，影響胎盤血供，進而影響胎兒生長。此外，相關性分析結果顯示，胎兒生長受限病人胎盤組織miR-23a-3p與ZNF395水平呈負相關，且二者與新生兒體重、胎盤重量均有相關性。進一步提示miR-23a-3p可能是通過抑制ZNF395表達，抑制胎盤尤其是滋養細胞的發育，進而造成胎兒發育受限。提示臨床研究中應密切監測妊娠期高血壓孕婦胎兒的宮內情況及miR-23a-3p、ZNF395水平。

綜上所述，胎兒生長受限病人胎盤組織中miR-23a-3p表達水平升高，ZNF395表達水平降低，二者均與新生兒體重、胎盤重量相關，且是胎兒生長受限的影響因素。miR-23a-3p可能通過負向調控ZNF395表達參與胎兒生長受限過程，miR-23a-3p、ZNF395可能是改善胎兒生長受限的基因修飾靶點。但仍需進一步加大樣本量來驗證miR-23a-3p、ZNF395基因的臨床應用價值及其影響胎兒生長受限的分子基礎。

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（收稿日期：2022-07-21）

（本文編輯王麗）