天香丹抑制P2X7/NLRP3表達改善動脈粥樣硬化的作用機制研究

白銀雪 張夏夏 吳丹丹 任珊 安冬青

摘要?目的：探討天香丹對動脈粥樣硬化小鼠嘌呤能配體門控離子通道7（P2X7）、核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（NLRP3）的影響。方法：選取8周齡無特定病原體（SPF）級雄性載脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠30只，予以高脂飼料喂養12周，造模成功后隨機分為模型組、阿托伐他汀組、天香丹組，每組10只；另選取C57BL/6J小鼠10只予普通飼料喂養，設為空白對照組。酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測血清白細胞介素（IL）-18、IL-1β、腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）的水平；免疫組化檢測組織中P2X7、NLRP3的表達。結果：ELISA結果顯示：與空白對照組相比，模型組IL-18、IL-1β、ATP水平升高（P＜0.05）；與模型組相比，阿托伐他汀組、天香丹組IL-18、IL-1β、ATP水平降低（P＜0.05）。免疫組化結果顯示：與空白對照組相比，模型組P2X7、NLRP3表達均明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，阿托伐他汀組、天香丹組P2X7、NLRP3表達均明顯降低（P＜0.05）。結論：天香丹改善動脈粥樣硬化與調節鉀穩態抑制炎癥小體的激活有關。

關鍵詞?動脈粥樣硬化；天香丹；核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3；嘌呤能配體門控離子通道7；腺嘌呤核苷三磷酸；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.07.010

The Effect of Tianxiangdan on ?Atherosclerosis by Inhibiting P2X7/NLRP3 Expression

BAI Yinxue， ZHANG Xiaxia， WU Dandan， REN Shan， AN Dongqing

Xinjiang Medical University， Key Laboratory of Xinjiang Famous Physicians and Characteristic Prescriptions， Urumchi 830054， Xinjiang， China

Corresponding Author?AN Dongqing， E-mail： andongqing3@gmail.com

Abstract?Objective：To investigate the effect of Tianxiangdan on purinergic ligand-gated ion channel 7（ P2X7 ） and nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3（ NLRP3） in atherosclerotic mice.Methods：Thirty 8-week-old SPF male ApoE-/-?mice were selected and fed with high-fat diet for 12 weeks.After successful modeling，they were randomly divided into model group，statin group，and Tianxiangdan group，with 10 mice in each group.Ten C57BL/6J mice were fed with normal diet as blank control group.The levels of interleukin（IL）-18，IL-1β，and adenosine triphosphate（ATP） in serum were detected by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.The expression of P2X7 and NLRP3 in tissues was detected by immunohistochemistry.Results：ELISA results displayed that compared with the blank group，the levels of IL-18，IL-1β，and ATP in model group ?increased（P＜0.05）.Compared with the model group，the levels of IL-18， IL-1β，and ATP in statin group and Tianxiangdan group decreased（P＜0.05）.The results of immunohistochemistry showed that the expression of P2X7 and NLRP3 in model group was significantly higher than that in blank group（ P＜0.05）.The expression of P2X7 and NLRP3 in the statin group and Tianxiangdan group ?decreased compared with the model group（P＜0.05）.Conclusion：The improvement of atherosclerosis by Tianxiangdan is related to regulating potassium homeostasis and inhibiting the activation of inflammasome.

Keywords??atherosclerosis; Tianxiangdan; nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3， NLRP3; purinergic ligand-gated ion channel 7， P2X7; adenosine triphosphate; experimental study

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，As）是心血管疾病的重要病理基礎，是全世界心血管疾病死亡的重要

基金項目?國家自然科學基金項目（No.82060861）；新疆維吾爾自治區重點實驗室項目（No.2020D04006）；新疆維吾爾自治區重大科技專項項目（No.2022A03019）

作者單位?新疆醫科大學，新疆名醫名方與特色方劑學重點實驗室（烏魯木齊 830054）

通訊作者?安冬青，E-mail：andongqing3@gmail.com

引用信息?白銀雪，張夏夏，吳丹丹，等.天香丹抑制P2X7/NLRP3表達改善動脈粥樣硬化的作用機制研究［J］.中西醫結合心腦血管病雜志，2024，22（7）：1225-1228.

危險因素之一，As易損斑塊的破裂是引發急性心血管事件的主要原因［1］。核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）炎癥體的激活是影響As易損斑塊的重要因素［2］。研究表明，細胞外的腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）可激活嘌呤能配體門控離子通道7（purinergic ligand-gated ion channel 7，P2X7）受體，介導鉀外流，導致NLRP3炎癥體激活［3-6］，NLRP3炎癥體激活后可通過誘發炎癥反應參與As的發生與發展［7］。鉀離子通道拮抗劑可抑制鉀外流，調控炎癥小體的激活而改善As，但目前只用于實驗研究，臨床應用有待進一步的發展，尋找鉀離子通道拮抗劑迫在眉睫。As屬于中醫學“胸痹”“心痛”“真心痛”等疾病范疇。基本病機為本虛標實，治當以通補開泄為法。天香丹是依據通補開泄法理論治療胸痹的經驗方。前期研究表明，天香丹可通過調控核轉錄因子-κB（NF-κB）信號通路，下調白細胞介素（IL）-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎性因子水平，控制炎癥反應，穩定易損斑塊，有效改善As［8-9］。本研究建立As小鼠模型，使用天香丹進行干預，探究天香丹對P2X7/NLRP3通路及相關炎性因子的影響，為中醫藥治療As提供實驗依據。

1?材料與方法

1.1?動物

8周齡無特定病原體（SPF）級雄性載脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠30只，從北京維通利華公司購入；普通C57BL/6J小鼠10只，從新疆醫科大學動物實驗中心購入；體質量（18.00±2.00）g，共同飼養于新疆醫科大學動物實驗中心屏障環境中。

1.2?實驗分組及給藥

30只SPF級雄性 ApoE-/-小鼠，10只 C57BL/6 小鼠共同在屏障環境中適應性喂養1周。C57BL/6 小鼠以普通飼料喂養，作為空白對照組；ApoE-/-小鼠給予高脂飲食（基礎飼料＋21%豬油＋0.15%膽固醇），喂養12 周建立As模型；將 ApoE-/-小鼠

按照隨機數字表法分為模型組（蒸餾水）、阿托伐他汀組［3 mg/（kg·d）］與天香丹組［2.73g/（kg·d）］，每組 10 只。藥物劑量［g/（kg·d）］＝9.1×成人臨床常藥量［g/（kg·d）］。灌胃體積＝0.2 mL/10 g。每日定時灌胃 1 次，連續灌胃 8 周，根據體質量調整用藥劑量。所有小鼠自由飲水、飲食，不限制活動。

1.3?藥物與試劑

基礎飼料和高脂飼料（21.00%脂肪、0.15%膽固醇、78.85%基礎飼料）購于北京科澳協力飼料有限公司，生產許可證號為SCXK（京）2020-0010；天香丹顆粒（每包9 g，批號：210540，新齊康藥業股份有限公司生產）；阿托伐他汀鈣片（20 mg，28片，批號：EE0898，輝瑞制藥有限公司生產）；小鼠腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）酶聯免疫吸附法（ELISA）試劑盒（貨號YX-012016M）、小鼠IL-18ELISA試劑盒（貨號YX-E21218）、小鼠IL-1β ELISA試劑盒（貨號YX-E28912）由上海優選生物科技有限公司生產；免二步法試劑盒（貨號PV-6001）、封閉用羊血清（貨號ZLI-9022）由中杉金橋公司生產；DBA顯色試劑盒（貨號ab64238）、P2X7 抗體（貨號AB259942）由Abcam公司生產；NLRP3抗體（貨號DF7438）由Affinity生物科學有限公司生產。

1.4?儀器

高速離心機（德國Sigma公司生產，型號：Sigma3-18KS）；酶標儀（美國賽默飛公司生產，型號：MULTISKANGO）；真空干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司生產，型號：DZF-6090）。

1.5?ELISA法檢測血清IL-18、IL-1β、ATP水平

采集每組6只小鼠血清，離心后取上清，根據ELISA試劑盒說明書進行操作，于波長450 nm處分別測定各孔的吸光度值。獲得的光密度（OD）值用Origin2021軟件進行分析。

1.6?免疫組化檢測組織中P2X7、NLRP3表達

每組取6只小鼠腹主動脈石蠟切片，脫蠟和水化后，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗3次，每次5 min；檸檬酸鈉修復20 min，冷卻至室溫；PBS洗3次，每次2 min；擦干組織周圍液體，在組織上滴加過氧化氫溶液（H2O2），避光放置15 min，以滅活內源性過氧化物酶；PBS洗3次，每次2 min；隨后滴加山羊血清置于37 ℃孵育箱內30 min；甩凈封閉液，滴加稀釋的一抗，4 ℃過夜；取出放置室溫，PBS洗3次，每次2 min；甩凈PBS后滴加二抗置于37 ℃孵育箱內20 min；PBS洗5次，每次2 min；擦干組織周圍液體滴加DBA顯色液，自來水沖洗；蘇木素復染，水化和透明后，中性樹膠封片。在顯微鏡下隨機選取5個視野，采用Image pro plus軟件進行分析。

1.7?統計學處理

采用SPSS 27.0統計軟件進行統計分析。數據以均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，多樣本均數比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2?結?果

2.1?各組血清ATP水平比較

與空白對照組比較，模型組ATP水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，阿托伐他汀組、天香丹組ATP水平明顯降低（P＜0.05）。詳見表1。

2.2?各組P2X7、NLRP3表達水平比較

與空白對照組比較，模型組P2X7、NLRP3表達均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，阿托伐他汀組、天香丹組P2X7、NLRP3表達均明顯降低（P＜0.05）。詳見圖1、表2。

2.3?各組血清IL-18、IL-1β水平比較

與空白對照組相比，模型組IL-18、IL-1β水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，阿托伐他汀組、天香丹組IL-18、IL-1β水平明顯降低（P＜0.05）。詳見表3。

3?討?論

As是一種發生于血管壁的慢性炎癥性病理變化，以脂質沉積和免疫細胞浸潤為特征［10］，As引發的冠心病、心肌梗死、腦卒中等心腦血管疾病是我國首位致死性疾病，嚴重危害廣大人民群眾的身體健康和生命安全［10-11］。鉀作為重要的電解質之一，在維持細胞正常代謝與酸堿平衡、細胞膜的應激性和心肌的正常功能中發揮重要作用。鉀通道ATP主要分布于心肌和血管平滑肌細胞內膜上［12］。研究表明，P2X7受體是廣泛表達于各種免疫細胞中的ATP門控陽離子選擇性通道，升高的細胞外ATP激活P2X7受體［3-6］。研究顯示，鉀離子的相關蛋白P2X7受體在人頸動脈斑塊與冠狀動脈狹窄中的表達顯著增加［13-14］。

NLRP3炎癥小體是脂質驅動血管炎癥反應的關鍵因素，在As的發生和發展中起著根本性的作用［15］。細胞內離子穩態的紊亂是NLRP3炎癥小體激活的重要細胞應激信號。鉀外流被認為在NLRP3炎癥小體激活中具有重要作用，幾種NLRP3激活劑可降低細胞內鉀濃度；相比之下，增加細胞外鉀濃度可抑制所有受試NLRP3激活劑的炎癥小體激活［16-17］。NLRP3炎癥小體被激活后，能夠促進產生大量炎性因子IL-1β和IL-18，造成易損斑塊破裂，加重As的發展進程［18］。因此，調節鉀穩態抑制NLRP3的激活對As的發生、發展極其重要。

中醫將As大致歸于“胸痹”“心痛”“心痹”“卒心痛”等范疇，

As的基本病機為本虛標實，因虛致實，因實益虛。心氣損傷，統血無能，以致瘀血內生；氣虛及陽，陽虛則寒或陽虛飲停，以氣滯、血瘀、痰濁、寒凝相兼為患。天香丹具有益氣活血、辛通開泄的功效，方中君藥紅景天補氣養血，活血化瘀；臣藥丹參益氣活血、通經止痛，降香化瘀止血、理氣止痛，新塔花寧心安神、疏風散熱；四藥合用益氣活血、補虛通絡。

本研究發現As模型組小鼠血清ATP含量明顯升高，證實As發生時，細胞中鉀離子紊亂，引發炎癥反應，增加血管中脂質沉積，促進As的發生發展。與模型組相比，天香丹組P2X7、NLRP3蛋白的表達均明顯降低，血清炎性因子IL-18、IL-1β水平降低，表明天香丹可以調節鉀紊亂，減少炎癥發生，減輕脂質沉積，進而改善As的狀況。

綜上所述，天香丹改善As可能與調節鉀穩態而抑制炎癥小體的激活有關。

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（收稿日期：2023-08-30）

（本文編輯王麗）