基于電子感官系統和GC-IMS技術的大黃飲片基原辨識研究Δ

楊碩 ，徐中利 ，趙新芝 ，石典花 ，4，戴衍朋 ，4，畢鈺 ，辛義周 （.山東中醫藥大學藥學院，濟南 5004；.山東省平邑縣中醫醫院，山東 平邑 700；.山東省中醫藥研究院，濟南 5004；4.國家中醫藥管理局中藥蜜制和制炭炮制技術與原理重點研究室，濟南 5004；5.山東中醫藥大學附屬醫院藥學部，濟南 5004）

大黃始載于《神農本草經》，為蓼科植物掌葉大黃RheumpalmatumL.、唐古特大黃RheumtanguticumMaxim.ex Balf.或藥用大黃RheumofficinaleBaill.的干燥根和根莖[1]，主要含蒽醌類、蒽酮類、茋類、鞣質類、苯丁酮類等成分，具有瀉下、抗炎、保肝、利尿、抗腫瘤等藥理作用[2]。研究發現，唐古特大黃、掌葉大黃、藥用大黃中各類成分含量存在差異，唐古特大黃中蒽酮、鞣質及黃烷醇類成分含量均高于藥用大黃及掌葉大黃，掌葉大黃的游離蒽醌類成分含量普遍高于唐古特大黃及藥用大黃，提示不同基原大黃飲片的主治功能可能不同[3]。2020年版《中國藥典》（一部）收載的含大黃及其炮制品的中成藥制劑有100多種，不同基原大黃飲片對中醫臨床、中成藥組方及其療效均有一定影響，因此有效辨識大黃基原對指導大黃臨床精準應用具有重要意義。

目前，國內外有關大黃基原鑒定的主要方法包括原植物外觀鑒定[4]、性狀鑒定[5]、高效液相色譜指紋圖譜鑒定[6]、分子生物學鑒定[7]等。其中，性狀和顯微鑒定對大黃植物或藥材特征完整性要求較高，需依靠長期經驗積累才能進行有效鑒別，而經過深加工的大黃飲片及中成藥，形態特征被破壞使得鑒定難度明顯增加。有研究證明，葉綠體基因間隔區rps16-trnQ、psaA-ycf3等均可作為特異DNA條形碼用于大黃基原的鑒定[8]，但此法操作及分析復雜。

近年來隨著電子舌、電子鼻等電子感官系統以及氣相-離子遷移譜（gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS）的應用，對藥品滋味及氣味的評判逐漸準確化[9]。研究報道顯示，電子鼻技術已被用于不同基原郁金飲片氣味特征的分析與鑒別[10]，電子舌技術已被用于川牛膝滋味的分析與鑒別[11]，GC-IMS技術結合化學計量學方法可證明當歸酒洗品、酒浸品、酒炙品中的揮發性成分存在差異[12]。基于此，本研究采用電子感官系統和GC-IMS技術分析不同基原大黃飲片滋味、氣味以及揮發性有機物差異，建立快速辨識大黃飲片基原的方法，為大黃飲片基原辨識和質量控制提供新方法和思路。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器包括SA-402B型電子舌（日本Insent公司）、PEN3型電子鼻（德國Airsense公司）、FlavourSpec?型風味分析儀（德國G.A.S.公司）、XS205 10－5DU型電子天平[梅特勒托利多儀器（上海）有限公司]、KQ-200VDE型三頻數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、FW-80型高速萬能粉碎機（北京市永光明醫療儀器有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

大黃飲片共8批（所選的樣本均是大黃主產地甘肅、湖北的代表性樣本[13]），經濟南市中藥協會宋希貴主任藥師鑒定分別為蓼科植物掌葉大黃R.palmatumL.、唐古特大黃R.tanguticumMaxim.ex Balf.或藥用大黃R.officinaleBaill.的干燥根和根莖。3種基原大黃飲片的樣品信息見表1。

表1 樣品信息

2 方法

2.1 電子舌技術測定大黃飲片滋味信息

將大黃飲片粉碎過四號篩，精密稱取大黃飲片粉末4 g，精密加入去離子水100 mL，超聲（功率100 W，頻率45 kHz）提取30 min，取上清液，作為待測樣品溶液。將電子舌傳感器（AAE、CT0、CA0、C00、AE1）與參比電極分別于基準液（30 mmol/L氯化鉀+0.3 mmol/L酒石酸）和3.33 mol/L氯化鉀溶液中活化24 h后安裝，用參比溶液校正，于室溫25 ℃下測定樣品鮮味、咸味、酸味、苦味、澀味以及豐富度。傳感器C00和AE1經參比溶液簡單清洗，測定殘留的滋味（即苦味回味和澀味回味）。數據采集時間30 s，采集4個周期，第1個周期數據波動較大，為了提高數據精度，數據分析時刪除第1個周期數據，使用第2～4個周期的測量數據。利用電子舌自帶分析軟件Taste analysis application作雷達圖對比分析；使用Origin 2021軟件作傳感器響應值柱狀圖分析并建立判別因子分析（discriminant factor analysis，DFA）鑒別模型；使用SIMCA軟件建立主成分分析（principal component analysis，PCA）鑒別模型；使用SPSS軟件建立Fisher判別模型。

2.2 電子鼻技術測定大黃飲片氣味信息

將大黃飲片粉碎過四號篩，精密稱取大黃飲片粉末5 g于分析小瓶中，密封后在80 ℃水浴中孵育15 min，再將進樣針頭插入分析小瓶中進行氣味數據采集。測定條件為：傳感器自清洗時間60 s，樣品準備時間5 s，分析時間120 s，進樣流量400 mL/min。每個樣品重復測定3次。利用電子鼻系統自帶軟件進行Loading分析；使用Origin 2021作顏色映射瀑布圖分析；使用SIMCA軟件作偏最小二乘法判別分析（partial least squaresdiscriminant analysis，PLS-DA）、正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA），并進行變量重要性投影值（variable importance in projection，VIP）分析。

2.3 GC-IMS技術檢測大黃飲片中揮發性有機物信息

將大黃飲片粉碎過四號篩，精密稱取粉末1.0 g，置于20 mL頂空瓶中，80 ℃水浴孵育15 min后進樣測定。采用FlavourSpec?型風味分析儀進行分析，根據前期中藥測定的常規經驗參數及優選結果確定檢測條件。IMS檢測條件如下：溫度45 ℃，漂移管長度5 cm，管內線性電壓400 V/cm；漂移氣為N2（純度≥99.999%），流速150 mL/min。GC檢測條件如下：色譜柱為MXT-WAX柱（30 m×0.53 mm，1.0 μm），分析時間30 min，柱溫60 ℃；載氣為N2（純度≥99.999%），流速2 mL/min（0～2 min）、2～10 mL/min（2～5 min）、10～100 mL/min（5～25 min）、100 mL/min（25～30 min）。進樣條件如下：進樣體積100 μL；進樣針溫度85 ℃；孵化轉速500 r/min。通過儀器配套分析軟件Vocal及其插件，分別作二維俯視圖和指紋圖譜；使用SIMCA 14.1軟件進行PCA、PLS-DA分析。

3 結果

3.1 電子舌滋味測定結果

由于TGT1樣品各滋味值和豐富度均較高，故本研究以TGT1為參比得到其余樣品味覺值，正值表示滋味值比TGT1強，負值表示滋味值比TGT1弱。由雷達圖和柱狀圖（圖1A、圖1B）可見，唐古特大黃的澀味（astringency）及澀的回味（aftertaste-A）最強，掌葉大黃次之，藥用大黃最弱；掌葉大黃的苦味（bitterness）及苦的回味（aftertaste-B）最強，藥用大黃次之，唐古特大黃最弱。由PCA、DFA圖（圖1C、圖1D）可見，藥用大黃、掌葉大黃和唐古特大黃各自聚集在一起，說明不同基原大黃飲片間滋味差異大，同基原間相似度較高，可較好區分不同基原大黃飲片。

圖1 電子舌滋味檢測數據分析結果

根據3種基原大黃飲片的滋味數據，利用SPSS軟件建立Fisher判別模型[14]，觀察值X1為酸味值、X2為苦味值、X3為澀味值、X4為苦味回味值、X5為澀味回味值、X6為鮮味值、X7為豐富度、X8為咸味值，Y1、Y2表示判別函數值。建立的判別函數為Y1=52.671+2.452X1+0.06X2+0.411X3－1.135X4+2.460X5－4.317X6+5.667X7－3.644X8、Y2＝－57.078+1.403X1+1.788X2+0.272X3－2.50X4+1.087X5+9.608X6－9.516X7+1.144X8。其中，唐古特大黃飲片檢測數據代入后判別函數值Y1＞0、Y2＞0，藥用大黃飲片檢測數據代入后判別函數值Y1＜0、Y2＜0，掌葉大黃飲片檢測數據代入后判別函數值Y1＜0、Y2＞0。因此，可通過根據電子舌檢測數據建立的Fisher判別模型對大黃飲片基原進行快速辨識。

3.2 電子鼻氣味信息測定結果

電子鼻10個傳感器對不同的化合物敏感，Loading分析結果（圖2A）顯示，不同基原大黃飲片氣味差異成分主要是S7（無機硫化物）、S9（芳香成分有機硫化物）、S6（甲烷等短鏈烷烴）、S8（醇醚醛酮類）、S2（氮氧化合物）。選取差異最大的S7（無機硫化物）120 s內的實時響應值繪制顏色映射瀑布圖（圖2B），結果顯示，3種基原大黃飲片存在明顯差異。PLS-DA、OPLS-DA（圖2C、圖2D）結果顯示：在PLS-DA中，主成分1占比為98.2%，主成分2占比為1.21%，可信度為95%；在OPLS-DA中，主成分1占比為97.50%，主成分2占比為1.03%，可信度為95%；圖中不同基原大黃飲片間無重疊，聚集在不同區域，說明不同基原大黃飲片氣味差異明顯。同時對模型進行驗證，設定檢驗數為200次，R2和Q2為該模型評價指標（分別代表其可解釋度和預測能力），結果（圖2E）左邊的R2點和Q2點均低于右邊，表明未產生過擬合，模型可靠。根據VIP篩選3種基原大黃差異性氣味成分，其中VIP大于1的表明對差異貢獻大，反之則表明對差異貢獻小[15]。結果（圖2F）顯示，3種基原大黃飲片差異主要來自S7（無機硫化物）、S9（芳香成分有機硫化物）、S6（甲烷等短鏈烷烴）、S8（醇醚醛酮類），而S1（芳香成分，苯類）、S2（氮氧化合物）、S3（氨水，芳香成分）、S4（氫氣）、S5（烷烴芳香成分）、S10（長鏈烷烴類）的影響小，與Loading分析結果一致。

圖2 電子鼻氣味檢測數據分析結果

3.3 GC-IMS揮發性有機物測定結果

8批大黃飲片中共檢測出83個揮發性有機物信息，包括醛類成分22個、酯類成分14個、酮類成分14個、醇類成分14個、酸類成分7個、萜烯類成分6個以及其他類成分6個。GC-IMS俯視圖（圖3）中橫坐標處紅色豎線為RIP峰（反應離子峰），RIP峰兩側的每個點代表1種揮發性有機物。顏色代表物質的濃度，白色表示濃度較小，紅色表示濃度較大，顏色越深表示濃度越大。結果顯示，藥用大黃飲片中的揮發性有機物濃度明顯小于其他2種基原飲片，并且唐古特大黃飲片在保留時間200～400 s之間的出峰數量以及峰強度均多/高于其他2種基原飲片，掌葉大黃飲片在保留時間600～700 s之間的峰強度高于其他2種基原飲片，這為后續鑒別不同基原的大黃飲片提供了可能。

圖3 不同基原大黃飲片GC-IMS俯視圖譜

依據特征峰選取原則，通過GC-IMS將選取的不同基原大黃飲片中不同揮發性有機物對應的特征峰區域進行排序對照，得到指紋圖譜（圖4），可直觀快速地看出揮發性有機物在不同基原大黃飲片中的特異性以及樣品之間的差異。結果顯示，藥用大黃飲片中含量高于其他2種基原飲片的主要特征物質有2-乙酰基呋喃、正己酸乙酯等；掌葉大黃飲片中含量高于其他2種基原飲片的主要特征物質有4-甲基-3戊烯-2-酮[二聚體]、乙酸甲酯[二聚體]等；唐古特大黃飲片中含量高于其他2種基原的主要特征物質有1-戊醇、叔丁醇[單體]、庚醛[單體]等。通過分析、計算不同基原大黃飲片的所有揮發性物質峰強度信息，建立大黃飲片基原的判別標準：當2-乙酰基呋喃峰強度是異丁酸[二聚體]峰強度的3～19倍時為藥用大黃飲片；當4-甲基-3戊烯-2-酮[二聚體]是四氫呋喃[二聚體]峰強度的2～9倍、3-羥基-2-丁酮[二聚體]峰強度是四氫呋喃[二聚體]峰強度的5～14倍時為掌葉大黃飲片；當2-己烯醛[單體]峰強度是仲丁醇[單體]峰強度的5～11倍、正戊醛[二聚體]峰強度是仲丁醇[單體]峰強度的13～21倍、1-戊醇峰強度是仲丁醇[單體]峰強度的5～9倍、1-戊烯-3-酮峰強度是仲丁醇[單體]峰強度的8～17倍時為唐古特大黃飲片。

圖4 不同基原大黃飲片GC-IMS指紋圖譜

對不同基原大黃飲片揮發性有機物峰強度信息進行PCA和PLS-DA，結果（圖5）顯示，藥用大黃、掌葉大黃和唐古特大黃各自聚集，說明不同基原大黃飲片間氣味差異大，相同基原間相似度較高，可較好地區分不同基原大黃飲片。

4 討論

電子舌檢測結果表明，不同基原大黃飲片滋味差異主要表現在苦味、澀味及苦和澀的回味，且唐古特大黃飲片澀味最強，掌葉大黃飲片苦味最強。文獻研究表明，澀味差異的產生與鞣質類成分含量相關，而苦味差異的產生與其蒽醌類、萜類、生物堿類成分含量相關[16]。另有研究證實，唐古特大黃的鞣質類成分含量高于藥用大黃及掌葉大黃，而掌葉大黃的游離蒽醌類成分含量高于唐古特大黃及藥用大黃。因此電子舌檢測結果將上述研究報道進行了有效串聯，也進一步證實了不同基原大黃飲片所含化學成分存在明顯差異，提示其臨床應用應有所區分。

電子鼻檢測發現，不同基原大黃飲片氣味差異成分主要是無機硫化物、芳香成分有機硫化物、甲烷等短鏈烷烴、醇醚醛酮類化合物；而GC-IMS檢測發現，不同基原大黃飲片的差異揮發性氣味物質主要是醇醛酮酸類成分，表明GC-IMS與電子鼻檢測結果具有較強相關性，同時也進一步說明了醇醛酮類成分是3種基原大黃飲片間的主要差異氣味物質。

綜上，本研究采用的電子舌、電子鼻及GC-IMS技術可有效分析3種不同基原大黃飲片的滋味差異、氣味組成及揮發性物質差異，并結合化學計量學分析建立了多種大黃飲片基原鑒別模型以及基原判別標準，可用于快速區分大黃飲片的基原，為豐富和發展大黃飲片傳統經驗鑒別增添了新的思路。但由于GC-IMS定性分析軟件內置的NIST、IMS數據庫中化合物數量有限，有12個信號峰尚未定性表征，下一步可以結合氣相色譜質譜聯用技術對其數據庫進行擴充，進一步完善大黃飲片不同基原的氣味差異，為大黃飲片基原精準鑒定及臨床使用提供更多數據支撐。