馬里苷對酒精性脂肪肝的保護作用及機制Δ

牛廣豪 ，徐俊馳 ，顧利青 ，許英 ，顧宇人 ，宋華峰 #[.蘇州市第五人民醫院（蘇州大學附屬傳染病醫院）臨床試驗機構辦公室，江蘇 蘇州 5000；.蘇州市第五人民醫院（蘇州大學附屬傳染病醫院）檢驗中心，江蘇蘇州 5000]

長期大量飲酒會引起酒精性脂肪肝（alcoholic fatty liver，AFL）[1]。AFL的發病機制非常復雜，由多種因素共同參與。其中，氧化應激和脂代謝異常在AFL的發生發展過程中具有重要作用[2]。過氧化物酶體增殖物激活受體α（peroxisome proliferator-activated receptor α，PPARα）是抑制肝臟脂質生成的關鍵蛋白，上調PPARα表達可以改善肝臟的脂代謝異常，減輕脂肪堆積[3]。研究表明，AFL的發生可能與PPARα調控的脂代謝通路抑制密切相關[4]。

馬里苷的化學名為奧卡寧-4′-O-葡萄糖苷，是一種查爾酮類化合物，在兩色金雞菊頭狀花序的水和乙醇提取部位中含量最高[5]。近年來國內外研究發現，馬里苷具有較多有益的藥理活性，如改善糖脂代謝[6]、抗炎和抗氧化應激[7]等。同時有研究表明，馬里苷可減緩糖尿病所造成的肝臟損傷[8]。本課題組前期研究已經證實，在缺氧誘導的心肌肥大細胞中，馬里苷可以通過上調PPARα的表達進而改善其脂代謝異常[9]。鑒于馬里苷對肝損傷的減緩作用以及其抗氧化應激和改善PPARα介導的脂質代謝異常的藥理活性，本研究擬通過建立體內和體外AFL模型，探討馬里苷對AFL的影響，并從氧化應激和PPARα介導的脂質代謝2個角度探究其抗AFL的可能作用機制，為進一步研究馬里苷的藥理作用提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器有：Infinite M1000 Pro型全波長多功能酶標儀（瑞士Tecan公司），FJ-200型高速分散均質機（美國LI-COR公司），Power PAC 2000型電泳儀、ChemiDoc XRS 型自動凝膠成像系統、電泳槽（美國Bio-Rad公司），Fresco 21型高速微量臺式冷凍離心機（美國Thermo Fisher Scientific公司），CX31型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 主要藥品與試劑

本研究所用的主要藥品與試劑有：馬里苷標準品（上海源葉生物科技有限公司，批號B29210，純度≥98%），MK886（PPARα抑制劑）標準品（上海Med Chem Express公司，批號HY-14166，純度≥99.7%），高度白酒（北京紅星股份有限公司，酒精度：52%vol），油紅O染色試劑盒（德國Sigma公司，批號MAK194），考馬斯亮藍蛋白、甘油三酯（triglyceride，TG）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號分別為20230403、20230412、20230415、20230514），兔源PPARα抗體、兔源肉堿棕櫚酰轉移酶1（carnitine palmitoyltransferase-1，CPT-1）抗體、兔源二脂酰甘油酰基轉移酶（diacylgly- cerol acyltransferase，DGAT）抗體和兔源β-肌動蛋白（β-actin）抗體（英國Abcam公司，批號分別為ab314112、ab220789、ab100982、ab8226），辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（武漢Proteintech公司，批號SA02502），ECL化學發光液（上海天能生命科學有限公司，批號180-5001）。

1.3 動物

實驗動物為SPF級健康雄性昆明小鼠，共37只，體重20～22 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，實驗動物生產許可證號為SCXK（滬）2022-0004。小鼠購入后，飼養于蘇州大學SPF級動物房內，飼養環境溫度為（22±2） ℃、相對濕度為 55%、12 h 光照/12 h 黑暗循環。實驗動物所有操作均嚴格按照蘇州大學動物倫理委員會標準執行（倫理批件號：SUDA20230622A01）。

1.4 細胞

大鼠BRL肝細胞購自中國科學院細胞庫。將細胞接種于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養基中，并在飽和濕度、5%CO2、37 ℃培養箱中培養。

2 方法

2.1 動物實驗

2.1.1 小鼠AFL模型建立及分組、給藥

在進行正式實驗前，小鼠進行環境適應性飼養2 d。然后按體重將小鼠隨機分為正常對照組（n＝9）、模型組（n＝10）和馬里苷75、150 mg/kg組（n＝9，給藥劑量根據相關文獻報道[10―11]及本課題組前期預實驗結果確定；以0.5%羧甲基纖維素鈉溶液為溶劑進行藥液配制，馬里苷母液質量濃度分別為3.75、7.5 mg/mL）。馬里苷75、150 mg/kg組小鼠灌胃相應劑量的馬里苷藥液（0.02 mL/g），正常對照組和模型組小鼠灌胃等體積0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，每天1次，持續30 d。每天完成給藥30 min后，模型組和各給藥組小鼠均采用高度白酒灌胃30 d的方法建立AFL小鼠模型[12]：初始灌胃劑量為0.01 mL/g，并在7 d內將劑量逐漸加大到0.015 mL/g；正常對照組小鼠灌胃相應劑量雙蒸水。實驗第30天取1只模型組小鼠，采用蘇木素-伊紅（HE）染色后觀察其肝組織病理改變，以肝細胞出現脂滴沉積、脂肪空泡變性為造模成功判定標準。

2.1.2 取材及肝組織中TG、MDA和SOD水平測定

末次給藥后，小鼠禁食不禁水12 h，稱重。經眼球取血后，脫頸處死小鼠。取出小鼠肝臟，用冷生理鹽水沖洗，濾紙吸干后，取大約0.3 g肝組織，加2.7 mL生理鹽水制成10%肝組織勻漿，以4 000 r/min離心10 min；取上清，按照試劑盒說明書操作，測定肝組織中TG、MDA和SOD水平。另取部分肝組織置于10%甲醛溶液中固定，剩余肝組織置于－80 ℃冰箱中保存備用。

2.1.3 肝組織病理形態學觀察

采用HE染色法進行觀察。取“2.1.2”項下經10%甲醛溶液固定的肝組織（每只小鼠取的部位相同），常規操作制備石蠟切片（厚度4 μm）后行HE染色，在顯微鏡下觀察肝組織脂肪浸潤情況。

2.1.4 肝組織中PPARα、CPT-1和DGAT蛋白表達檢測

采用Western blot法進行檢測。取“2.1.2”項下凍存的肝組織（每組取3只小鼠樣本），采用RIPA裂解液超聲提取組織中總蛋白，測定總蛋白濃度后，調整樣品體積，使各組上樣量保持一致。將蛋白高溫變性后，配制10%分離膠，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（電壓80 V、電泳時間 20 min，電壓 120 V、電泳時間 40 min），之后按90 V、90 min的轉膜條件轉移至NC膜，用5%脫脂奶粉封閉90 min；加入PPARα、CPT-1、DGAT和β-actin一抗（PPARα的稀釋度為1∶500，CPT-1的稀釋度為1∶300，DGAT和β-actin的稀釋度為1∶1 000），4 ℃孵育過夜。洗膜后，加入對應二抗，室溫孵育1 h。ECL 化學發光顯影，采用 ChemiDoc XRS 凝膠成像系統進行信號掃描，利用Image J軟件進行圖像分析獲取蛋白條帶灰度值，以目的蛋白與內參蛋白（β-actin）條帶灰度值的比值表示目的蛋白的表達水平。

2.2 細胞實驗

2.2.1 馬里苷對大鼠BRL肝細胞活力的影響

為篩選馬里苷后續實驗干預的濃度和時間，采用MTT法測定馬里苷對正常BRL肝細胞活力的影響。取對數生長期的細胞，接種于96孔板中（鋪板密度為1×105個/mL），置于CO2培養箱內培養 24 h 后，將細胞分為正常對照組、1‰二甲基亞砜（DMSO）組和馬里苷3、6、12 μmol/L組（濃度參考文獻[9]設置，以1‰DMSO為溶劑進行藥液配制），每組設置3個復孔。各組細胞分別經空白培養基、含1‰DMSO的培養基、含藥培養基處理24 h后，每個細胞培養孔加入20 μL MTT溶液作用4 h，吸取上清液，加入100 μL DMSO作用15 min后，利用全波長酶標儀測定490 nm波長下吸光度值，計算細胞相對活力：細胞相對活力＝（實驗孔吸光度值－空白孔吸光度值）/（對照孔吸光度值－空白孔吸光度值）×100%。實驗重復3次。

2.2.2 馬里苷對乙醇誘導的肝細胞損傷的影響

取對數生長期的細胞，接種于6孔板中（鋪板密度為1×104個/mL）。實驗分為正常對照組、模型組、模型+1‰DMSO組和馬里苷3、6、12 μmol/L組，每組設3個復孔。參考文獻[13]方法并進行改良后建立酒精性肝細胞損傷模型：用0.5%乙醇、0.01%硫酸亞鐵和0.1 μmol/L油酸刺激大鼠BRL肝細胞24 h致脂質堆積（采用油紅O染色法觀察肝細胞內脂滴的分布，觀察到脂滴提示造模成功）。馬里苷各濃度組在造模同時給予不同濃度的馬里苷作用24 h。收集細胞，按照試劑盒說明書操作，測定肝細胞中TG、MDA和SOD水平，并參照“2.1.4”項下方法測定細胞中PPARα、CPT-1和DGAT的蛋白表達。實驗重復3次。

2.2.3 MK886干預后馬里苷對乙醇損傷肝細胞中PPARα、CPT-1和DGAT蛋白表達的影響

為進一步驗證馬里苷是否通過調控PPARα發揮作用，采用MK886處理細胞。取對數生長期的細胞，接種于6孔板中（鋪板密度為1×104個/mL）。實驗分為正常對照組、模型組、模型+MK886組、模型+MK886+馬里苷12 μmol/L組，每組設3個復孔。MK886的給藥濃度參考文獻[14]設定為10 μmol/L，馬里苷給藥濃度根據“2.2.2”項下結果設定。正常對照組不處理，模型組按“2.2.2”項下方法建立酒精性肝細胞損傷模型，模型+MK886組造模的同時加入MK886，模型+MK886+馬里苷12 μmol/L組造模的同時加入MK886和馬里苷。培養24 h后收集各組細胞，按照“2.1.4”項下方法測定細胞中PPARα、CPT-1和DGAT的蛋白表達。實驗重復3次。

2.3 統計學方法

采用GraphPad Prism軟件作圖和進行數據統計分析。符合正態分布的計量資料以±s表示，采用單因素方差分析和LSD-t法進行組間比較。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 動物實驗結果

3.1.1 馬里苷對小鼠肝組織中TG、MDA和SOD水平的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠肝組織中TG、MDA水平顯著升高（P＜0.01），SOD水平顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，馬里苷75、150 mg/kg組小鼠肝組織中TG、MDA水平顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），SOD水平顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。結果見表1。

表1 各組小鼠肝組織中TG、MDA和SOD水平測定結果（±s，n＝9）

表1 各組小鼠肝組織中TG、MDA和SOD水平測定結果（±s，n＝9）

a：與正常對照組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與模型組比較，P＜0.01。

SOD/（U/mg prot）220.73±45.13 163.49±8.91a 178.47±17.12b 193.30±26.88c組別正常對照組模型組馬里苷75 mg/kg組馬里苷150 mg/kg組TG/（mg/g）7.33±2.72 20.31±3.17a 14.95±3.26b 10.73±1.71c MDA/（nmol/mg prot）1.72±0.57 2.58±0.28a 1.99±0.40b 1.75±0.39c

3.1.2 馬里苷對小鼠肝組織病理形態學的影響

正常對照組小鼠肝組織中肝細胞排列有序、整齊，肝小葉結構正常，肝細胞未見脂肪變性、炎癥細胞浸潤現象。模型組小鼠肝組織中肝細胞排列紊亂，肝小葉結構被破壞，分布有彌散性的脂質空泡。馬里苷不同劑量組小鼠肝組織中脂肪變性的程度較模型組明顯減輕，肝細胞的排列漸趨正常，肝小葉的結構有所恢復，尤以馬里苷150 mg/kg組的改善更為明顯。結果見圖1。

圖1 各組小鼠肝組織HE染色病理形態學觀察圖

3.1.3 馬里苷對小鼠肝組織中PPARα、CPT-1和DGAT蛋白表達的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠肝組織中PPARα、CPT-1的蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01），DGAT蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，馬里苷75、150 mg/kg組小鼠肝組織中PPARα、CPT-1蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），DGAT蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。結果見圖2和表2。

圖2 各組小鼠肝組織中PPARα、CPT-1、DGAT蛋白表達的電泳圖

表2 各組小鼠肝組織中PPARα、CPT-1、DGAT蛋白表達水平測定結果（±s，n＝3）

表2 各組小鼠肝組織中PPARα、CPT-1、DGAT蛋白表達水平測定結果（±s，n＝3）

a：與正常對照組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與模型組比較，P＜0.01。

DGAT/β-actin 0.15±0.02 0.22±0.23a 0.19±0.01b 0.15±0.01c組別正常對照組模型組馬里苷75 mg/kg組馬里苷150 mg/kg組PPARα/β-actin 1.15±0.20 0.39±0.04a 0.64±0.05b 0.98±0.12c CPT-1/β-actin 0.96±0.11 0.55±0.09a 0.82±0.06c 0.83±0.12c

3.2 細胞實驗結果

3.2.1 馬里苷對正常大鼠BRL肝細胞活力的影響

與正常對照組[相對細胞活力為（100.00±0.00）%，n＝3]比較，1‰DMSO組和馬里苷3、6、12 μmol/L組作用24 h后，細胞活力[分別為（99.21±6.42）%、（99.02±5.39）%、（96.24±5.98）%、（96.83±9.43）%，n＝3]均無顯著變化（P＞0.05），因此該濃度可以用于后續實驗。

3.2.2 馬里苷對肝細胞脂質生成的影響

與正常對照組比較，模型組細胞中有較多被染成紅色的脂滴，其分布在靠近細胞膜的區域，使整個細胞呈現出“印戒”狀；與模型組比較，3、6、12 μmol/L馬里苷作用后可顯著減少細胞中紅色脂滴分布，細胞輪廓變得清晰，且以馬里苷12 μmol/L組細胞紅色脂滴減少最明顯。結果見圖3。

圖3 各組細胞的油紅O染色觀察結果

3.2.3 馬里苷對肝細胞中TG、MDA和SOD水平的影響

與正常對照組比較，模型組細胞中TG、MDA水平顯著升高（P＜0.01），SOD水平顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，模型+1‰DMSO組細胞中上述指標差異均無統計學意義（P＞0.05）；馬里苷3、6、12 μmol/L組細胞中TG、MDA水平均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），SOD水平均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。結果見表3。

表3 各組細胞中TG、MDA和SOD水平測定結果（±s，n＝3）

表3 各組細胞中TG、MDA和SOD水平測定結果（±s，n＝3）

a：與正常對照組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與模型組比較，P＜0.01。

SOD/（U/mg prot）56.98±6.89 23.37±6.41a 29.20±2.05 37.43±6.57b 43.30±6.55c 47.01±4.01c組別正常對照組模型組模型+1‰DMSO組馬里苷3 μmol/L組馬里苷6 μmol/L組馬里苷12 μmol/L組TG/（mg/g prot）1.23±0.12 2.86±0.40a 2.34±0.52 1.74±0.22b 1.58±0.17c 1.55±0.15c MDA/（nmol/mg prot）1.34±0.13 3.50±0.62a 3.32±0.65 2.24±0.38b 1.82±0.21c 1.52±0.11c

3.2.4 馬里苷對肝細胞PPARα、CPT-1和DGAT蛋白表達的影響

與正常對照組比較，模型組細胞中PPARα、CPT-1蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01），DGAT蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，模型+1‰DMSO組細胞中上述指標水平差異均無統計學意義（P＞0.05）；馬里苷3、6、12 μmol/L組細胞中PPARα、CPT-1蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），DGAT蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。結果見圖4和表4。

圖4 各組細胞中PPARα、CPT-1、DGAT蛋白表達的電泳圖

表4 各組細胞中PPARα、CPT-1、DGAT蛋白表達水平測定結果（±s，n＝3）

表4 各組細胞中PPARα、CPT-1、DGAT蛋白表達水平測定結果（±s，n＝3）

a：與正常對照組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與模型組比較，P＜0.01。

DGAT/β-actin 0.20±0.02 1.02±0.09a 1.13±0.10 0.78±0.09b 0.64±0.08c 0.27±0.05c組別正常對照組模型組模型+1‰DMSO組馬里苷3 μmol/L組馬里苷6 μmol/L組馬里苷12 μmol/L組PPARα/β-actin 0.78±0.05 0.25±0.05a 0.33±0.06 0.59±0.04b 0.60±0.09b 0.75±0.04c CPT-1/β-actin 0.23±0.05 0.12±0.02a 0.11±0.02 0.16±0.01b 0.18±0.02c 0.20±0.01c

3.2.5 MK886干預后馬里苷對乙醇損傷肝細胞中PPARα、CPT-1和DGAT蛋白表達的影響

與正常對照組比較，模型組和模型+MK886組細胞中PPARα、CPT-1蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01），DGAT蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，模型+MK886+馬里苷12 μmol/L組細胞中上述指標水平差異均無統計學意義（P＞0.05），表明在用MK886預處理后，馬里苷對乙醇誘導肝細胞中PPARα、CPT-1和DGAT蛋白表達的影響消失。結果見圖5、表5。

圖5 MK886干預后肝細胞中PPARα、CPT-1和DGAT蛋白表達的電泳圖

表5 MK886干預后肝細胞中PPARα、CPT-1和DGAT蛋白表達水平測定結果（±s，n＝3）

表5 MK886干預后肝細胞中PPARα、CPT-1和DGAT蛋白表達水平測定結果（±s，n＝3）

a：與正常對照組比較，P＜0.01。

組別正常對照組模型組模型+MK886組模型+MK886+馬里苷12 μmol/L組DGAT/β-actin 1.15±0.08 1.95±0.06a 2.07±0.08a 1.93±0.09 PPARα/β-actin 1.03±0.11 0.38±0.05a 0.23±0.05a 0.23±0.05 CPT-1/β-actin 0.72±0.19 0.30±0.11a 0.20±0.02a 0.21±0.03

4 討論

乙醇可能會影響肝臟脂質代謝，并導致肝臟脂質蓄積和脂肪變性[15―16]。在本研究中，動物實驗采取小鼠連續灌胃高度白酒30 d，細胞實驗采取0.5%乙醇、0.01%硫酸亞鐵和0.1 μmol/L油酸誘導大鼠BRL肝細胞損傷來進行藥效研究。結果顯示，在動物和細胞模型中均檢測到肝細胞中TG水平顯著增加，而在給予馬里苷后，細胞中TG水平均顯著下降，表明馬里苷可拮抗乙醇引起的肝臟脂肪堆積。

研究表明，乙醇蓄積可導致活性氧自由基的大量產生，進而誘發機體的氧化應激和脂質過氧化反應，最終導致肝細胞損傷。而乙醇蓄積不但會引起活性氧自由基的大量產生，還會降低機體的抗氧化能力[17]。在本研究中，筆者檢測了小鼠肝組織中MDA、SOD水平。結果發現，在馬里苷作用后，小鼠肝組織中MDA水平顯著降低，SOD水平顯著升高；同時，在乙醇誘導的肝細胞中也檢測到馬里苷的上述作用。由此可知，馬里苷可通過提高機體的抗氧化酶水平，增加對活性氧自由基的清除能力，從而減輕氧化應激引起的肝損傷。

PPARα是調節脂質代謝的一種重要的轉錄因子，主要在肝臟表達[18]。在乙醇蓄積的情況下，肝組織中PPARα表達被抑制，從而導致脂質代謝異常，使肝臟受損[3]。PPARα可通過調控其靶基因CPT-1和DGAT表達，在肝臟脂質代謝中發揮重要作用[19―20]。CPT-1是調控脂肪酸β氧化的關鍵酶，DGAT則是調控TG合成的關鍵酶，這2種酶的異常表達會導致脂質合成增加。在本研究中，動物實驗和細胞實驗結果均表明，乙醇誘導肝細胞損傷后會抑制PPARα蛋白表達，且CPT-1蛋白表達也隨之下調，但DGAT蛋白表達卻上調，這表明PPARα參與了乙醇引起的肝脂質代謝紊亂；而馬里苷可上調乙醇誘導肝細胞中PPARα、CPT-1蛋白的表達，下調DGAT蛋白的表達。為了進一步驗證馬里苷對PPARα的靶向調控作用，本研究在采用MK886對肝細胞進行預處理后，觀察到馬里苷對細胞中PPARα、CPT-1和DGAT的調控作用被阻斷，證實了馬里苷改善乙醇誘導肝臟脂肪變性的作用可能是通過調控PPARα信號通路實現的。

綜上所述，馬里苷對AFL具有保護作用，其作用機制可能為增加肝臟的SOD水平以抑制乙醇引起的氧化應激，也可能是通過增強PPARα的表達進而調控其介導的脂質代謝相關靶蛋白CPT-1和DGAT的表達，但其更多的作用機制仍待進一步研究。