人參皂苷生物合成相關的尿苷二磷酸依賴的糖基轉移酶研究進展

童 婧，楊德盈，張 倩，李志新，董子舒，劉紅寧*，黃 佳*

人參皂苷生物合成相關的尿苷二磷酸依賴的糖基轉移酶研究進展

童 婧1，楊德盈2#，張 倩1，李志新1，董子舒1，劉紅寧1*，黃 佳1*

1. 江西中醫藥大學高等研究院，中醫基礎理論分化發展研究中心，江西省中醫病因生物學重點實驗室，江西 南昌 330004 2. 廣東醫科大學附屬醫院，廣東 湛江 524001

人參皂苷是一類具有豐富藥理活性的重要天然產物，常見的類型包括達瑪烷型（protopanaxadiol type，PPD-type/proto-panaxatriol type，PPT-type）、齊墩果烷型（oleanane type，OA-type）和奧克悌隆型（ocotillol type，OCT-type），可廣泛應用于醫藥、農業和工業生產等領域。尿苷二磷酸（Uridine diphosphate，UDP）依賴的糖基轉移酶（UDP-glycosyltransferases，UGTs）是催化人參皂苷生成的關鍵酶，對人參皂苷結構的形成及藥理作用的發揮具有重要意義。綜述了人參皂苷的分布、結構多樣性和生物合成途徑，并基于幾種常見人參皂苷類型重點闡述了與糖基化反應相關的UGTs，以期為人參皂苷生物合成相關研究提供參考。

糖基化；糖基轉移酶；人參皂苷；天然產物；達瑪烷型；齊墩果烷型；生物合成

人參屬植物屬于五加科多年生草本植物，包含8種（人參、西洋參、三七、假人參、姜狀三七、竹節參、屏邊三七和三小葉人參）和3變種（狹葉竹節參、珠子參和羽葉參），主要分布在東亞地區[1]。其中在中國，人參屬植物集中分布在東北三省，以吉林為重要產區，其產量約占全國85%，每年可達3萬t，產值高達600億元[2]。人參皂苷是人參屬植物的主要活性成分，屬于三萜類糖苷化合物。幾千年來，人參、西洋參及三七等一直作為傳統中藥材、食品和膳食補充劑而被廣泛使用[3]?，F代藥理學研究表明，人參皂苷具有抗炎、抗腫瘤、解熱鎮痛、增強免疫力和改善心血管等藥理活性[4]。除用于食品、醫藥和保健品外，人參皂苷作為底料來源還被廣泛應用于化妝品生產[5]，而在農業活動中，植物體內的人參皂苷能夠吸引傳粉昆蟲輔助授粉或對動物有拒食作用[6]。由于較高的藥理價值和廣泛的生物活性，人參皂苷在諸多應用方面具有廣闊的商業前景。然而作為人參皂苷的主要來源，人參的野生資源逐漸匱乏，質量也受連作障礙、病蟲害的影響逐漸下降[7]。同時，部分極具藥理活性的人參皂苷，如稀有人參皂苷Rg3、人參皂苷Rh2等，在植物中含量極低，難以滿足臨床應用和工農業生產的需求[7]。近年來，隨著植物次生代謝途徑及其關鍵酶的研究不斷深入，采用合成生物學技術異源合成人參皂苷是一種環保高效的方法[8-11]。由尿苷二磷酸（Uridine diphosphate，UDP）依賴的糖基轉移酶（UDP-glycosyltransferases，UGTs）介導的糖基化是人參皂苷生物合成途徑的最后一步，對人參皂苷的藥理活性和結構多樣性具有重要作用[12]。因此，本文總結了參與人參皂苷生物合成相關的UGTs，為進一步闡明人參皂苷生物合成途徑和合成生物學在人參皂苷生產中的應用提供參考。

1 人參皂苷在植物中的分布和結構多樣性

1.1 分布

截至目前，從11種人參屬植物中分離出約300種人參皂苷，僅在人參的根、葉、花和果實中就已發現了200余種[13-14]。現常應用高效液相色譜（HPLC）與質譜聯用技術檢測植物中人參皂苷化合物及轉錄組水平，以分析影響人參皂苷質量和分布的因素。

1.1.1 人參皂苷的種類和含量與物種有關 Yan等[15]基于HPLC特征圖譜比較人參屬藥材人參、西洋參和三七的成分及其含量，發現三者體內含有許多共有成分，如人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rb3、人參皂苷Rd等，但各單體成分含量存在差異。例如，人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rd、人參皂苷Rb14個共有單體成分含量均以三七最高，西洋參次之，人參最少。除共有成分外，它們也各含特征成分，如人參含人參皂苷Rf，西洋參含擬人參皂苷F11，三七含三七皂苷R1、三七皂苷R2[16-19]。

1.1.2 人參皂苷的含量與栽培時間和生長環境有關 Xie等[20]采用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜（UPLC-QTOF-MS）和多元統計分析技術，對不同參齡和生長環境的人參屬植物人參、三七、西洋參和高麗參進行代謝譜分析，得到的UPLC-QTOF-MS光譜和數據反映植物質量信息的同時，進一步證明了人參皂苷可在同一植物物種內因地理位置和栽培年齡不同而發生細微變化。

1.1.3 人參皂苷在人參中的積累和分布具有組織特異性且在人參根中的分布呈現異質性 Zhang等[21]通過UPLC-二極管陣列檢測器（PDA）測定人參3個器官和4個組織中8種主要人參皂苷含量，發現葉片中皂苷積累最多，根莖次之，根中最少，但總體上隨栽培年限而增加，尤其在根中周皮內皂苷含量是其他組織的2倍以上。

在一定程度上，不同品種、組織、栽培年齡和環境條件下的人參皂苷呈現出規律性分布。因此，了解不同物種、不同培養方式及不同部位人參皂苷的分布對尋找關鍵合成酶、闡明人參皂苷合成途徑和解析調控機制具有重要意義。

1.2 結構多樣性

根據苷元不同，人參皂苷可分為達瑪烷型（dammarane type，DM-type）、齊墩果烷型（oleanolic acid type，OA-type）和奧克悌隆型（ocotillol type，OCT-type，圖1）。在自然界中齊墩果烷型和奧克悌隆型含量相對較少，齊墩果烷型主要為人參皂苷Ro（1），奧克悌隆型主要包括擬人參皂苷F11（2）和人參皂苷MR2（3）[22]。在生物體內以達瑪烷型為主，按C3、C6、C20位上糖基位置、數量和類型的差異分為原人參二醇型（protopanaxadiol type，PPD-type）和原人參三醇型（protopanaxatriol type，PPT-type）。PPD型人參皂苷由UGTs催化PPD型人參皂苷元C3-、C20-OH糖基化而形成，包括人參皂苷Rb1（4）、Rd（5）、Rb2（6）、Rb3（7）等；PPT型人參皂苷則由UGTs催化PPT型人參皂苷元C6-、C20-OH糖基化而形成，包括人參皂苷Rg1（8）、人參皂苷Rf（9）、人參皂苷Re（10）、人參皂苷Rg2（11）、三七皂苷R1（12）、三七皂苷R2（13）等[23]。目前已鑒定的稀有人參皂苷（圖1）也基本屬于達瑪烷型人參皂苷，包括PPD型，如人參皂苷Rg3（14）、人參皂苷Rh2（15）、人參皂苷F2（16）、CK（17）、Gyp17（18）、Gyp75（19）；PPT型，如人參皂苷F1（20）、人參皂苷Rh1（21）。此外，還有一類結構較為特殊的稀有人參皂苷—多雙鍵型稀有人參皂苷，主要包括人參皂苷Rg5（22）、人參皂苷Rh3（23）、人參皂苷Rh4（24）、人參皂苷Rk1（25）、人參皂苷Rk2（26）、人參皂苷Rk3（27）等，在一定程度上豐富了人參皂苷的化學結構和藥理活性[11]。

A-PPD型人參皂苷，PPT型人參皂苷；B-含多雙鍵Ⅰ類稀有人參皂苷，含多雙鍵Ⅱ類稀有人參皂苷；C-齊墩果烷型人參皂苷，奧克悌隆型人參皂苷

2 人參皂苷生物合成途徑

人參皂苷與其他三萜類化合物生物合成途徑類似，均起始于異戊烯焦磷酸（isopentenyl pyrophosphate，IPP）及其異構體二甲基烯丙基焦磷酸（dimethylallyl diphosphate，DMAPP）。IPP和DMAPP可由乙酰輔酶A經胞質中的甲羥戊酸途徑（mevalonate pathway，MVA）或丙酮酸和甘油醛3-磷酸經質體中的2--甲基--赤蘚糖醇-4-磷酸途徑（2--methyl--erythritol-4-phosphate，MEP）合成，人參皂苷的形成以MVA途徑為主。首先，2分子IPP和一分子DMAPP在法尼基焦磷酸合酶（farnesyl pyrophosphate synthase，FPPS）作用下合成法尼基焦磷酸（farnesyl diphosphate，FPP），然后2分子FPP在角鯊烯合酶（squalene synthase，SQS）作用下經“頭尾縮合”形成角鯊烯（squalene，SQ），隨后在鯊烯環氧化酶（squalene epoxidase，SQE）作用下形成2,3-氧化鯊烯（2,3-oxidosqualene），再經不同氧化角鯊烯環化酶（oxidosqualene cyclases，OSCs）進一步催化得到不同的人參皂苷骨架。

在人參屬植物中，已鑒定出2種OSC參與人參皂苷生物合成：一為達瑪烯二醇合酶（dammarenediol synthase，DS），負責形成達瑪烷型骨架—達瑪烯二醇（dammarenediol，DM），隨后在原人參二醇合酶（PPDS，CYP716A47）作用下生成PPD，再經原人參三醇合酶（PPTS，CYP716A54）催化形成PPT[24-25]；另一種為β-香樹素合酶（β-amyrin synthase，β-AS），負責形成齊墩果烷型骨架—β-香樹脂醇（β-amyrin），該骨架經齊墩果酸合酶（oleanolic acid synthase，OAS）催化可形成齊墩果酸[26]。奧克悌隆型骨架則可經2種途徑形成：由2,3-氧化鯊烯通過SQE催化環氧化生成的2,3,22,23-二氧化角鯊烯（2,3,22,23-dioxidosqualene，DOC），進一步經OSC、CYP450催化生成奧克悌隆型人參皂苷元或者由PPD在SQE、CYP的催化作用下生成[27-28]。

人參皂苷上游生物合成途徑已基本闡明，下游途徑則包括細胞色素P450酶（cytochromeP450，CYP450）催化羥基化生成人參皂苷元，UDP糖基轉移酶（UDP-glycosyltransferases，UGTs）進一步催化糖基化形成多種人參皂苷[29-30]，見圖2。

3 人參皂苷生物合成相關UGTs

目前已分離鑒定得到的糖基轉移酶（glycosyltransferases，GTs）數量龐大，種類繁多，廣泛存在于有機體中。根據已收集的GTs氨基酸序列的一致性，碳水化合物活性酶數據庫（CAZy，http://www.cazy.org/）將GTs分為116個家族，其中GT1是最大的一個家族，能以UDP-葡萄糖（UDP-glucose，UDP-Glc）、UDP-木糖（UDP-xylose，UDP-Xyl）、UDP-鼠李糖（UDP-rhamnose，UDP-Rha）、UDP-阿拉伯糖（UDP-arabinose，UDP-Ara）和葡萄糖醛酸（UDP-glucuronic acid，UDP-GlcA）等為糖供體，也被稱為UGTs。目前，UGT71、UGT73、UGT74、UGT85、UGT91和UGT94家族中多個UGTs已被鑒定具有催化合成人參皂苷的生物活性[31]。參與人參皂苷生物合成相關的UGTs見表1。已完成功能驗證的UGTs主要集中在達瑪烷型人參皂苷，并且糖供體以UDP-葡萄糖為主，UDP-木糖、UDP-鼠李糖的研究相對較少，具有較大研究潛力。

G3P-油醛-3-磷酸；GPP-香葉基焦磷酸；IPP-異戊烯基焦磷酸；DMAPP-二甲基烯丙基焦磷酸；FPP-法尼基焦磷酸；SQS-鯊烯合酶；SQ-鯊烯；SQE-鯊烯環氧酶；2,3-氧化鯊烯；DS-達瑪烯二醇合酶；DM-達瑪烯二醇；PPDS-原人參二醇合酶；PPTS-原人參三醇合酶；UGTs-UDP-葡萄糖基轉移酶；β-AS-β-香樹素合酶；OAS-齊墩果酸合酶；DOC-2,3,22,23-二氧化角鯊烯；CYP450-細胞色素P450酶。

表1 公共數據庫獲得的參與人參皂苷糖基化的UGTs

3.1 植物UGTs

3.1.1 達瑪烷型 達瑪烷型人參皂苷是五加科植物人參C. A. Mey.、西洋參L、三七(Burkill) F. H. Chen ex C. H. Chow和葫蘆科植物絞股藍(Thunb.) Makino的主要活性成分。目前已從人參屬植物中鑒定出數10種參與達瑪烷型人參皂苷生物合成的UGTs，主要集中在UGT71、UGT74和UGT94家族，見圖3。

圖3 植物UGTs催化達瑪烷型人參皂苷元的糖基化反應

人參中已分離并鑒定的UGTs，催化人參皂苷的羥基發生糖基化時大多數表現出明顯的區域選擇性，但可以接受不同的底物作為糖受體。Jung等[32]對人參轉錄組進行測序和重新組裝，表征出具有明顯區域選擇性的糖基轉移酶PgUGT74AE2，只在C3-OH催化PPD和CK分別生成人參皂苷Rh2和F2。張婷婷等[33]發現PgUGT74AE2還能以PPT為底物，特異性地催化C3-OH發生糖基化，生成一種新型原人參三醇型皂苷3--β--吡喃葡萄糖-達瑪-24-烯-3β, 6α, 12β, 20()-三醇。Wang等[34]通過相關表達序列和cDNA數據庫克隆出UGTPg1（PgUGT71A53），該酶具有區域選擇性，僅催化人參皂苷的C20-OH發生糖基化。同時Yan等[35]發現UGTPg1能以PPD、Rh2、Rg3和PPT為底物，分別生成人參皂苷CK、F2、Rd和F1。與底物雜泛性不同，少數UGTs則具有受體特異性。Wang等[34]克隆出具有受體特異性的糖基轉移酶UGTPg45（PgUGT74AE4），僅能以PPD為底物，特異性地催化C3-OH發生糖基化，生成人參皂苷Rh2。此外，人參中氨基酸序列高度相似的UGTs，功能并不完全相同甚至基本不同。Lu等[36]發現PgUGT71A29與UGTPg1在氨基酸水平上高度相似，PgUGT71A29除了能催化人參皂苷Rh1的C20-OH發生糖基化生成人參皂苷Rg1外，還能催化人參皂苷Rd的C20--Glc發生糖基化生成人參皂苷Rb1。Wei等[37]從人參中分離出2個與UGTPg1高度相似的UGTs：UGTPg100（PgUGT71A54）能催化PPT的C6-OH發生糖基化生成人參皂苷Rh1；UGTPg101（PgUGT71A55）除了催化PPD和PPT的C20-OH發生糖基化生成人參皂苷CK及F1外，還能進一步催化F1的C6-OH發生糖基化生成人參皂苷Rg1。

上述UGTs主要催化單個糖基轉移至人參皂苷或苷元的羥基，但大多數人參皂苷會在同一羥基上經連續糖基化反應延長糖鏈。Jung等[32,38]發現PgUGT94Q2（UGTPg29）能進一步在Rh2和F2的C3--Glc上進行糖基化，分別生成人參皂苷Rg3和Rd，這是首個被鑒定出能夠催化人參皂苷糖鏈延伸的糖基轉移酶。除UGT94Q2外，Yang等[39]通過分析UGT94家族的多樣性，表征出一系列能在糖鏈上進行糖基化生成多糖苷的UGT94Qs：PgUGT94Q15能催化人參皂苷Rh2的C3--Glc發生糖基化生成人參皂苷Rg3；PgUGT94Q3能催化人參皂苷Rh1的C6--Glc和人參皂苷Rh2的C3--Glc發生糖基化，分別生成人參皂苷Rf、Rg3；PgUGT94Q6能催化人參皂苷Rh2的C3--Glc發生糖基化生成人參皂苷Rg3，同時能催化人參皂苷Rd、CK的C20--Glc發生糖基化分別生成人參皂苷Rb1、絞股藍皂苷LXXV。除以葡萄糖作為糖供體外，Li等[40]從人參中鑒定出PgUGT94Q13能以鼠李糖為糖供體，在人參皂苷Rh1和人參皂苷Rg1的C6--Glc上進行糖基化，分別生成人參皂苷Rg2和人參皂苷Re，從而解決了人參皂苷Rg2和人參皂苷Re完整的生物合成途徑。

西洋參的活性成分在生物合成過程中同樣涉及多種UGTs。Lu等[41-42]從西洋參中分離得到2個催化PPD型人參皂苷的UGTs：Pq3--UGT1能夠催化PPD的C3-OH發生糖基化，生成人參皂苷Rh2；Pq3-O-UGT2能夠在人參皂苷Rh2、F2的C3--Glc上進行糖基化，生成人參皂苷Rg3、Rd。Feng等[43-44]通過克隆得到2個催化PPT型人參皂苷的UGTs：Pq-PPT-6,20--UGT1能催化PPT的C20-OH發生糖基化生成人參皂苷F1，又能進一步催化F1的C6-OH生成人參皂苷Rg1；Pq-PPT-6--UGT能催化PPT的C6-OH發生糖基化生成人參皂苷Rh1。

三七中也含有豐富的人參皂苷，如人參皂苷Rf、Rg1、Rg2、Re、Rd、Rb1等，UGTs對這些皂苷起著重要的修飾作用。Yue等[45]從三七懸浮細胞中分離純化得到UGRdGT，該酶催化人參皂苷Rd的C20--Glc發生糖基化形成Rb1。Jiang等[46]從三七基因組中鑒定出5個參與人參皂苷生物合成的糖基轉移酶（PnUGT1-PnUGT5）：PnUGT1能催化PPD和PPT的C20-OH發生糖基化，分別生成人參皂苷CK、F1，與人參UGTPg100和UGTPg101功能一致；PnUGT3能催化PPT和F1的C6-OH發生糖基化，分別生成人參皂苷Rh1和人參皂苷Rg1，與人參中UGTPg1和UGTPg101功能一致；PnUGT5能催化PPD的C3-OH發生糖基化生成人參皂苷Rh2，PnUGT2和PnUGT4則能進一步催化人參皂苷Rh2的C3--Glc發生糖基化生成人參皂苷Rg3，與人參中UGTPg45和UGTPg29功能一致。除以葡萄糖為糖供體外，Hou等[47]還在三七中發現了以鼠李糖為糖供體的糖基轉移酶PnUGT94M1，能在人參皂苷Rh1、Rg1的C6--Glc上進行糖基化，分別生成人參皂苷Re、人參皂苷Rg2，此前這2種人參皂苷完整的生物合成途徑僅在人參中得到解析，該酶的發現為人參皂苷的體外合成提供了新思路。此外，三七中部分糖基轉移酶表現出明顯的糖供體雜泛性。Li等[48]從人參和三七中獲得10個UGTs（PgUGT94Q12、PgUGT94Q13、PnUGT94Q14、PnUGT94Q27、PgUGT94Q10-V1、PgUGT94Q11-V1、PgUGT94Q11-V2、PnUGT94Q14-V1、PnUGT94Q14-V2、PnUGT94Q14-V3），均能以UDP-Xyl為糖供體催化人參皂苷Rg1和人參皂苷Rh1的C6--Glc發生糖基化分別生成三七皂苷NgR1和NgR2，同時能以UDP-Glc為糖供體生成人參皂苷20--Glc-Rf和Rf，其中以PgUGT94Q13效率較高。Li等[49]通過體外酶促反應證實三七中UGTPn87能以UDP-Glc為糖供體在PPD的C3-、C20--Glc上進行糖基化，同時還能以UDP-Xyl為糖供體。

絞股藍為葫蘆科植物，其主要活性成分為絞股藍皂苷，但大部分絞股藍皂苷與人參皂苷非常相似，Huang等[50]通過基因組共性分析和轉錄組測序發現絞股藍皂苷Ⅲ、Ⅳ、Ⅷ、Ⅻ分別與人參皂苷Rb1、Rb3、Rd、F2同源。不僅如此，絞股藍中人參皂苷的含量是人參的5倍且易培養，是個很好的替代資源，因此研究絞股藍中參與人參皂苷生物合成的UGTs具有重要意義。Rahimi等[51]從絞股藍中分離出GpUGT23，能夠催化人參皂苷CK、F2、Rd和F1的C20--Glc發生糖基化，分別生成絞股藍皂苷LXXV、XVII、人參皂苷Rb1和三七皂苷U。除上述已完成功能驗證的UGTs外，絞股藍中大多數參與人參皂苷生物合成的UGTs仍未實現功能表征。Liang等[52]通過絞股藍轉錄組的雜交測序，推測出GpUGT35是絞股藍皂苷生物合成的主要候選酶，屬于UGT94家族，與PgUGT94Q2同源性高達50%。Zhang等[53]通過轉錄組和蛋白組初步推定UGT73B、UGT76B1、UGT74F2、UGT91C1和UGT91A1參與人參皂苷次生代謝，其中UGT74F2、UGT91A1和UGT91C1具有較高活性，但相關功能機制有待進一步探討。

3.1.2 齊墩果烷型 齊墩果烷型人參皂苷屬于五環三萜類皂苷，以竹節參為代表，包括齊墩果酸、人參皂苷Ro及人參皂苷Ro合成途徑中的4種中間代謝物（金盞花皂苷E、齊墩果酸-28--葡萄糖苷、姜狀三七皂苷R1和竹節參皂Ⅳa）。

在齊墩果烷型人參皂苷生物合成途徑中，UGTs可催化人參皂苷元C3-OH和C28-COOH發生一步或連續多步糖基化反應。Tang等[54]從竹節參和日本參中鑒定了4個編碼OAGT（、、和）的基因，均能對齊墩果酸的C3-OH進行葡萄糖醛酸化生成金盞花皂苷E。Zhang等[55]在人參中發現2個UGTs：PgUGT8能催化齊墩果酸、金盞花皂苷E、人參皂苷R1的C28-COOH發生葡萄糖醛酸化，分別生成齊墩果酸-28--葡萄糖苷、竹節參皂苷Ⅳa和人參皂苷Ro；PgUGT18能夠催化金盞花皂苷E、竹節參皂Ⅳa的C3--Glc發生糖基化，分別生成人參皂苷R1和人參皂苷Ro。Meesapyodsuk等[56]在王不留行中發現與PgUGT8同源的糖基轉移酶UGT74M1能催化絲石竹酸的C28-COOH形成葡萄糖酯。Yang等[39]在人參中發現UGT94Q15、UGT94Q15-V1和UGT94Q22-V1均可在齊墩果酸 3--葡萄糖苷的C3--Glc上進行糖基化，生成齊墩果酸3--二葡萄糖苷，其中UGT94Q15-V1還可催化金盞花皂苷E的C3--GlcA發生糖基化生成姜狀三七皂苷R1。Tang等[57]從竹節參中鑒定出2個參與齊墩果烷型人參皂苷生物合成的糖基轉移酶：PjmUGT1能催化金盞花皂苷E和姜狀三七皂苷R1的C28-COOH發生糖基化，分別生成竹節參皂苷Ⅳa和人參皂苷Ro；PjmUGT2能催化金盞花皂苷E和竹節參皂苷Ⅳa的C3--Glc發生糖基化，分別生成姜狀三七皂苷R1和人參皂苷Ro。Augustin等[58]從歐洲山芥的cDNA文庫中篩選得到BvUGT1，能催化齊墩果酸發生糖基化，隨后分離得到3個P型UGTs（UGT73C9、UGT73C10和UGT73C12）和2個G型UGTs（UGT73C11和UGT73C13）。其中UGT73C10和UGT73C11能作用于C3-OH且催化活性和特異性較高，催化產物中幾乎只有3-單葡萄糖苷；UGT73C12和UGT73C13能作用于C28-COOH但催化活性和特異性較低，催化產物可形成少量3,28-二葡萄糖苷，在一定條件下UGT73C13還可產生齊墩果酸三糖苷；UGT73C9則無催化活性。Erthmann等[59]從歐洲山芥中選擇相關基因異種表達后篩選得到6個UGT73Cs：UGT73C21、UGT73C22、UGT73C23、UGT73C25、UGT73C26和UGT73C27，其中UGT73C21、UGT73C26、UGT73C27僅能催化齊墩果酸C3-OH發生糖基化，而UGT73C22、UGT73C23、UGT73C25可作用于齊墩果酸C28-COOH。Ji等[60]從梅葉冬青轉錄組中克隆出UGT74AG5，能特異性地催化齊墩果酸C28-COOH發生糖基化，生成齊墩果酸28--葡萄糖苷，見圖4。

圖4 植物UGTs催化的齊墩果烷型和奧克梯隆型人參皂苷元的糖基化反應

3.1.3 奧克悌隆型 奧克悌隆型是人參皂苷的一個亞型，由達瑪烷骨架和四氫呋喃環構成，通常在C3和C6位形成糖苷，是一類較罕見的人參皂苷，根據其C20和C24位絕對構型的不同可分為(20,24)-/ (20,24)-/(20,24)-/(20,24)-奧克悌隆型人參皂苷。與其他人參皂苷類型相比，奧克悌隆型人參皂苷集中分布在西洋參及金平人參中，包括PF11，RT2、RT4、RT5、Vina-ginsenoside R1（VR1）、VR2、VR5、VR6、Majonoside R1（MR1）、MR2和Yesanchinoside A、Yesanchinoside B、Yesanchinoside C[61]，但自然界中含量相對較低。目前主要通過半合成方法，氧化環合次級達瑪烷型人參皂苷得到奧克梯型人參皂苷，例如Wang等[62]將達瑪烷型人參皂苷Rg2、Rg3分別轉化為擬人參皂苷F11、GQ。此外，生物合成技術的發展為奧克悌隆型人參皂苷的異源合成提供了更簡便的可行思路。

然而，目前人們對奧克悌隆型人參皂苷生物合成糖基轉移酶知之甚少。Zhuang等[63]通過對金平人參轉錄組進行測序，推測并發現了4組基因：unigene0045236與三七中PnUGT1基因序列相同，unigene0071620與歐洲山芥中UGT73C11、UGT73C10基因序列高度同源，unigene0063740、unigene0063744與UGT74M1關系密切。近年來，Peng等[64]通過體外酶促反應，從金平人參中確定了2類參與奧克悌隆型人參皂苷MR2生物合成的關鍵UGTs：PvfUGT1能催化20(),24()-擬人參皂苷元Ⅱ和20(),24()-擬人參皂苷元I的C6-OH發生糖基化，分別生成假人參皂苷RT4和RT5；PvfUGT2能以木糖為糖供體，特異性地在C6--Glc催化RT4和RT5生成20(),24()-MR2，見圖4。

此外，PvfUGT2與PgUGT94Q13、UGTPn12、UGTPn87具有高度同源性，但因關鍵氨基酸殘基的差異而表現出不同功能，相關催化機制有待進一步研究。

3.2 動物UGTs

UGTs也普遍存在于動物體內，在藥物解毒和藥物清除等方面發揮著重要作用[65-66]。Li等[67]通過重組同工酶分析，在人肝微粒體中發現了能夠實現PPD葡萄糖醛酸化的糖基轉移酶：UGT1A4能在C3-OH催化PPD生成PPD-3--β--葡萄糖醛酸苷，且活性最高，UGT1A3次之。Chen等[68]對絞股藍皂苷（與PPD結構相似）進行代謝分析，進一步證明UGT1A4能催化C3-OH發生葡萄糖醛酸化（圖5）。目前動物來源的UGTs報道相對較少，且主要集中在葡萄糖醛酸化。

圖5 人源UGT催化的人參苷元糖基化反應

3.3 微生物UGTs

除植物與動物外，近年來也不斷有研究報道細菌和真菌中含有新的UGTs，如枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、鼠李糖乳酸桿菌等。其中枯草芽孢桿菌主要負責人參皂苷的糖基化反應：Luo等[69]從枯草芽孢桿菌CCTCC AB 2012913中克隆并鑒定出YjiC1，能催化人參皂苷Rh1的C3-OH發生糖基化，合成非天然人參皂苷3--β--吡喃葡萄糖-6--β--吡喃葡萄糖-20()-原人參三醇（3--β--Glc-6--β--Glc-PPT），這是首個從枯草芽孢桿菌中鑒定出來的糖基轉移酶。Liang等[70]從枯草芽孢桿菌CTCC 63501中克隆得到UGT109A1，除催化DM的C3-、C20-OH生成非天然人參皂苷3--β--吡喃葡萄糖-達瑪-24-烯-3β,20()-二醇（3β--Glc-DM）、3,20-di--β--吡喃葡萄糖-達瑪-24-烯-3β,20()-二醇（3β,20-二--Glc-DM）外，還能催化PPD/PPT的C3-、C12-OH發生糖基化生成3,12-二--β--吡喃葡萄糖-達瑪-24-烯-3β,12β,20()-三醇（3β,12β-二--Glc-PPD）和3,12-di--β--吡喃葡萄糖-達瑪-24-烯-3β,6,12β,20()-四醇（3β,12β-二--Glc-PPT）。這是首次在自然界中發現能夠催化人參皂苷C12-OH糖基化的UGTs。Zhang等[71]進一步研究UGT109A1對PPT型人參皂苷Re、Rf、Rh1和R1的作用，發現在人參皂苷Re、R1的C12-OH上無糖基化產物，這或許與C20--Glc的阻礙有關，相關機制有待深入研究。Dai等[72-73]從枯草芽孢桿菌168中分離出與UGT109A1氨基酸序列相似度高達94.39%的糖基轉移酶Bs-YjiC，能催化PPD的C3-OH發生糖基化生成天然人參皂苷Rh2及催化PPD的C3-、C12-OH生成非天然人參皂苷F12；催化PPT的C6-OH發生糖基化生成天然人參皂苷Rh1，也能催化PPT的C3-、C6-和/或C12-OH生成4種非天然人參皂苷(3--β--Glc-PPT、3--β--Glc-6--β--Glc-PPT、3--β--Glc-12--β--Glc-PPT、3--β--Glc-6--β--Glc-12--β--Glc-PPT)。Hu等[74]還首次發現Bs-YjiC能選擇性地催化人參皂苷Rg3的C12-OH發生糖基化，生成非天然人參皂苷Rd12。與UGT109A1嚴格的糖供體特異性不同，Dai等[75]發現糖基轉移酶Bs-YjiC表現出糖供體雜泛性，能以UDP-葡萄糖、UDP-半乳糖（UDP-galacose，UDP-Gal）和UDP-葡萄糖醛酸為供體催化人參皂苷發生糖基化。除枯草芽孢桿菌外，Wang等[76]從鼠李糖乳酸桿菌中鑒定出糖基轉移酶LRGT，能連續催化人參皂苷Rh2的C3--Glc發生糖基化，生成2種新型人參皂苷：葡萄糖基人參皂苷Rh2，該分子式和相對分子質量與人參皂苷Rg3相同，在人參皂苷Rh2的C3--Glc以C6-C1鍵連接單個葡萄糖基，是人參皂苷Rg3的異構體（C2-C1）；二葡萄糖基人參皂苷Rh2則在人參皂苷Rh2的C3-OH以C6-C1鍵連接2個葡萄糖基。Zhuang等[77]在釀酒酵母中發現UGT51能催化PPD的C3-OH發生糖基化，生成人參皂苷Rh2（圖6）。內生細菌與真菌內不斷被發現與鑒定的UGTs，極大促進了新型人參皂苷生物合成途徑的完善，為體外大規模合成新型人參皂苷提供了更多新的思路。

4 合成生物學在人參皂苷生產中的應用

利用合成生物學技術高效生產人參皂苷的核心是對其生物合成途徑中的關鍵酶進行挖掘。近年來，隨著催化人參皂苷生物合成的糖基轉移酶逐步被發現，基于合成生物學原理，設計和改造微生物，異源合成天然或非天然產物被認為是較有潛力的替代方法。Zhou等[78]在合成PPD的酵母菌株中過表達和基因，生產出效價為7.0 mg/L的非天然人參皂苷3β,12β-二--Glc-PPT，并發現的K73A突變可顯著提高3β,12β-二--Glc-PPD產量。Wang等[79]通過體內定向進化提高了UGTPg45的受體特異性和催化活性，將其引入釀酒酵母細胞工廠中，相同PPD底盤細胞中人參皂苷Rh2的產量提高了70%。Li等[48]通過蛋白工程技術系統優化了高產PPT的酵母菌株，能為異源生物合成途徑增加前體供應，導入PgUGTA54基因后建立了生產人參皂苷Rg1、三七皂苷R1、三七皂苷R2的細胞工廠，得到的產物滴度分別為1.95、1.62、1.25 g/L。由此可見，以釀酒酵母、解脂耶氏酵母等為底盤細胞，引入UGT基因是酵母細胞工程生產人參皂苷的一種有效方法，具有反應條件簡單溫和，催化效率和區域選擇性較高及成本相對較低等優勢[80-81]。

圖6 原核生物UGTs催化的人參苷元糖基化反應

不僅如此，隨著UGTs晶體結構不斷被解析，相關功能的特異性和雜泛性已能從結構生物學角度得到初步闡明。UGTs的N端和C端分別是識別受體底物和糖供體的2個Rossmann折疊。N端的保守基序（即UGTs的配體結合口袋）與UGTs識別底物、催化位點有關，例如UGT71、74和94家族的N端均含有一個保守基序以確保與特定底物結合，并且有研究表明替換或突變配體結合口袋的殘基及交換結構域可以改善UGTs的催化性能及底特異性[3, 82]。C端的高度保守序列（PSPG基序）被認為是激活糖結合的位點，其中第44位谷氨酰胺對葡萄糖具有一定偏好性，而半乳糖轉移酶活性則需要組氨酸[12, 83]。盡管單個殘基在識別糖供體時可能起著決定性作用，但通常需要多個氨基酸進行識別，因此研究不同偏好的UGTs結構有助于加深對糖供體特異性的了解。這都為UGTs提高特異性或催化活性以量產人參皂苷奠定理論基礎。

隨著人參皂苷的生物合成途徑被逐漸解析，關鍵UGTs的研究發現和功能表征越發深入，蛋白質工程、合成生物學和代謝工程技術進一步優化，微生物細胞工廠極有可能成為人參皂苷大規模生物合成的突破點。

5 結語與展望

糖基化在人參皂苷的生物合成過程中起著重要的修飾作用，能夠提高產物生物活性，豐富其結構多樣性。UGTs的不斷發現及對其種類和功能的深入研究，可有效厘清各種類型人參皂苷的生源途徑。除用于生源途徑解析外，基于合成生物學技術，只需將糖基轉移酶基因導入異源底盤微生物中便可實現目標人參皂苷的從頭合成。目前基于基因測序技術和生物信息學分析的迅速發展，已有相當一部分UGTs實現功能表征，但UGTs數量龐大、種類繁多，已完成功能鑒定的糖基轉移酶與之相比極其有限，仍需發現新的UGTs來合成人參皂苷[84]。此外，在人參皂苷生物合成過程中，大多數UGTs可以催化不同底物發生糖基化，在微生物異源系統中設計合成人參皂苷時，提高UGTs的催化效率和特異性仍是關鍵。

目前，糖基化合物定性主要通過質譜分析、核磁共振等方法對糖基化修飾的類型及位置展開分析，其中-糖苷最為常見，-糖苷次之，-和-糖苷較少，研究的關鍵在于盡可能全面地對大量未知代謝物進行結構闡明，提高質譜檢測的靈敏度仍是優化糖基化合物定性的可行方案之一。同時聯用非靶向代謝組學方法有助于對代謝物及植物次生代謝途徑進行深入挖掘，從而高效助力合成生物學的發展。隨著基因組測序、代謝工程及合成生物學等技術不斷優化，多種方法學的創新融合，不僅能更全面地解析UGTs的催化功能，而且在糖基化合物定性的準確性等方面有較大提高[85]。同時人參皂苷生物合成途徑中UGTs活性的提升和底盤細胞的改造，有望進一步提高微生物細胞工廠異源合成人參皂苷的效率和產量，使人參皂苷的工業化生產成為可能。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Uridine diphosphate-dependent glycosyltransferase related to ginsenoside biosynthesis

TONG Jing1, YANG Deying2, ZHANG Qian1, LI Zhixin1, DONG Zishu1, LIU Hongning1, HUANG Jia1

1. Research Center for Differentiation and Development of TCM Basic Theory, Jiangxi Province Key Laboratory of TCM Etiopathogenisis, Institute for Advanced Study,Jiangxi University of Chinese Medicine, Nanchang 330004 China 2. Affiliated Hospital of Guangdong Medical University, Zhanjiang 524001 China

Ginsenosides are a class of important natural products with rich pharmacological activities, including dammarane type (protopanaxadiol type, PPD-type/proto-panaxatriol type, PPT-type), oleanane type (OA-type) and ocotillol type (OCT-type), which can be widely used in the fields of medicine, agriculture and industrial production. Uridine diphosphate (UDP)- dependent glycosyltransferases (UGTs) are the key enzymes that catalyze the production of ginsenosides, and play an important role in their chemical structure formations and pharmacological functions. This review summarized the distributions, structural diversities and biosynthesis pathways of ginsenosides. In addition, according to the types of several common ginsenosides, we emphasized the UGTs related to glycosylation reactions to provide reference for ginsenoside biosynthesis.

glycosylation; glycosyltransferase; ginsenosides; natural products; dammarane type; oleanane type; biosynthesis

R286.2

A

0253 - 2670(2024)09 - 3202 - 15

10.7501/j.issn.0253-2670.2024.09.033

2023-10-02

江西省教育廳科技計劃青年項目（GJJ2200973）；江西中醫藥大學博士科研啟動基金課題（2022BSZR001）；江西省衛生健康委員會科技計劃項目（202311138）

童 婧，本科生，研究方向為中藥活性天然產物生物合成。E-mail: 2644533042@qq.com

楊德盈，中藥學博士，研究方向為藥物化學。E-mail: yangdeying987@163.com

通信作者：劉紅寧，教授，從事中藥藥劑學研究。E-mail: 19820002@jxutcm.edu.cn

黃 佳，講師，從事中藥活性天然產物生物合成研究。E-mail: novelleo@163.com

[責任編輯 時圣明]