芍藥苷對(duì)糖尿病周圍神經(jīng)病變狀態(tài)下線粒體輸入途徑蛋白TOM20的作用

劉東齊，閆仕祺，劉浩龍，楊鑫偉*

芍藥苷對(duì)糖尿病周圍神經(jīng)病變狀態(tài)下線粒體輸入途徑蛋白TOM20的作用

劉東齊1，閆仕祺1，劉浩龍2，楊鑫偉1*

1. 首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，中醫(yī)絡(luò)病研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100069 2. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院，北京 100020

探究芍藥苷對(duì)糖尿病周圍神經(jīng)病變（diabetic peripheral neuropathy，DPN）大鼠坐骨神經(jīng)和高糖環(huán)境下雪旺細(xì)胞（Schwann cells，SCs）線粒體輸入途徑蛋白線粒體外膜轉(zhuǎn)位酶20（translocase of outer mitochondrial membrane 20，TOM20）的影響。以25、100、150 mmol/L葡萄糖分別干預(yù)RSC96雪旺細(xì)胞株12、24、48 h，用高內(nèi)涵分析法檢測(cè)TOM20和線粒體硫氧還蛋白2（mitochondrial thioredoxin 2，Trx2）的表達(dá)；設(shè)置對(duì)照組（給予25 mmol/L葡萄糖）、TOM20 siRNA組、TOM20 siRNA＋芍藥苷24 h組和TOM20 siRNA＋芍藥苷48 h組，轉(zhuǎn)染TOM20 siRNA后給予10 mmol/L芍藥苷分別干預(yù)24、48 h，利用Western blotting檢測(cè)TOM20和Trx2蛋白表達(dá)；設(shè)置對(duì)照組（給予25 mmol/L葡萄糖）、高糖組（給予150 mmol/L葡萄糖）和芍藥苷組（給予150 mmol/L葡萄糖和10 mmol/L芍藥苷），利用高內(nèi)涵分析法檢測(cè)TOM20和Trx2蛋白表達(dá)。制備DPN大鼠模型，給予白芍總苷后，利用免疫熒光法檢測(cè)大鼠坐骨神經(jīng)中TOM20和Trx2蛋白表達(dá)。高內(nèi)涵分析結(jié)果顯示，150 mmol/L葡萄糖干預(yù)12、24 h后，TOM20和Trx2蛋白表達(dá)水平均顯著降低（＜0.05、0.01），且2種蛋白的表達(dá)變化存在相關(guān)性。與對(duì)照組比較，高糖組TOM20和Trx2蛋白表達(dá)均顯著降低（＜0.01）；與高糖組比較，芍藥苷組TOM20和Trx2蛋白表達(dá)均顯著升高（＜0.01）。Western blotting結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，TOM20 siRNA組TOM20和Trx2蛋白表達(dá)水平均顯著降低（＜0.05、0.01）；與TOM20 siRNA組比較，芍藥苷干預(yù)24、48 h后TOM20和Trx2蛋白表達(dá)水平均顯著升高（＜0.05、0.01）。與對(duì)照組比較，模型組大鼠坐骨神經(jīng)中TOM20和Trx2蛋白表達(dá)均顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，白芍總苷組TOM20和Trx2蛋白表達(dá)均顯著升高（＜0.01）。芍藥苷能夠通過上調(diào)SCs以及大鼠坐骨神經(jīng)中TOM20蛋白的表達(dá)，促進(jìn)Trx2蛋白的線粒體輸入，從而有效對(duì)抗線粒體氧化應(yīng)激干預(yù)DPN。

芍藥苷；雪旺細(xì)胞；糖尿病周圍神經(jīng)病變；線粒體膜外轉(zhuǎn)位酶20；線粒體硫氧還蛋白

根據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)盟的最新數(shù)據(jù)顯示，目前全球有5.37億成人患有糖尿病，其中至少50%的患者會(huì)發(fā)展為糖尿病周圍神經(jīng)病變（diabetic peripheral neuropathy，DPN）[1]。DPN患者表現(xiàn)為神經(jīng)性疼痛、肢體感覺喪失以及足潰瘍和下肢截肢的風(fēng)險(xiǎn)增加，但目前臨床上仍缺少針對(duì)DPN發(fā)病機(jī)制的有效療法[2]。現(xiàn)今使用的主流抗氧化應(yīng)激藥物α-硫辛酸雖具有較好的療效，但有可能提高2型糖尿病患者細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感度，導(dǎo)致患者的血糖過低[3]。故而闡明DPN的發(fā)病機(jī)制，尋找更為有效的治療藥物是目前亟待解決的問題。

脫髓鞘是DPN的主要病理改變之一，而雪旺細(xì)胞（Schwann cells，SCs）作為周圍神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘形成細(xì)胞，在維持周圍神經(jīng)結(jié)構(gòu)和功能方面發(fā)揮至關(guān)重要的作用[4-5]。現(xiàn)代研究認(rèn)為，氧化應(yīng)激所引起的SCs線粒體功能障礙是DPN的主要發(fā)病機(jī)制之一[6-7]。線粒體蛋白由99%的核編碼蛋白和1%的線粒體編碼蛋白組成。其中線粒體基因組編碼內(nèi)膜氧化磷酸化機(jī)制的幾個(gè)疏水核心亞基，而核編碼蛋白則面向所有4個(gè)線粒體亞室（外膜、膜間空間、內(nèi)膜和基質(zhì)）。大多數(shù)核編碼的線粒體前蛋白是通過氨基末端前序定向途徑這一線粒體蛋白輸入機(jī)制進(jìn)入線粒體。前體蛋白在端導(dǎo)向序列線粒體靶向信號(hào)肽的作用下，依次通過線粒體外膜轉(zhuǎn)位酶（translocase of outer mitochondrial membrane，TOM）復(fù)合物和線粒體內(nèi)膜轉(zhuǎn)位酶（translocase of inner mitochondrial membrane，TIM）復(fù)合物轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體基質(zhì)。其中，定位于線粒體外膜的TOM20，被認(rèn)為是線粒體蛋白輸入的啟動(dòng)子[8-10]。線粒體硫氧還蛋白2（mitochondrial thioredoxin 2，Trx2）在抗氧化應(yīng)激和維持線粒體功能方面發(fā)揮重要作用。Trx2是一種小分子（相對(duì)分子質(zhì)量約1.2×104）的氧化還原蛋白，能夠直接清除線粒體中的活性氧（reactive oxygen species，ROS）。同時(shí)，Trx2的線粒體相互作用網(wǎng)絡(luò)（目前已鑒定出53個(gè)蛋白）參與線粒體完整性、線粒體內(nèi)蛋白質(zhì)合成與折疊、氨基酸和脂質(zhì)代謝、糖酵解、三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化等[11]。而線粒體中的Trx2蛋白依賴于TOM20介導(dǎo)的線粒體蛋白輸入機(jī)制轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體基質(zhì)，而后通過線粒體蛋白加工發(fā)揮抗氧化應(yīng)激等功能[12-14]。

課題組前期研究證實(shí)，芍藥苷能夠通過上調(diào)核因子E2相關(guān)因子2的核轉(zhuǎn)位，增加血紅素氧合酶1、γ‐谷氨酰半胱氨酸合成酶表達(dá)，從而降低高糖環(huán)境下SCs氧化應(yīng)激，糾正線粒體動(dòng)力學(xué)失衡，升高SCs線粒體膜電位，通過改善線粒體結(jié)構(gòu)和功能發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡作用[15-16]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，芍藥苷及白芍總苷（芍藥苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞90%）能夠增加DPN大鼠坐骨神經(jīng)和高糖環(huán)境下SCs中成熟型Trx2和前體Trx2的表達(dá)，直接或間接降低氧化應(yīng)激，改善線粒體功能，降低坐骨神經(jīng)脫髓鞘，改善大鼠的神經(jīng)傳導(dǎo)速度，干預(yù)DPN[17]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，芍藥苷具有抗炎、抗氧化、止痛、促進(jìn)SCs增殖以改善周圍神經(jīng)功能等作用，具有治療DPN的潛力，但其作用機(jī)制尚未闡明[18-19]。課題組通過SCs線粒體的4D-label free蛋白組學(xué)篩選發(fā)現(xiàn)，在高糖環(huán)境下TOM20表達(dá)降低。本研究重點(diǎn)探究芍藥苷是否通過TOM20依賴的線粒體輸入途徑介導(dǎo)Trx2的線粒體輸入和加工，從而發(fā)揮改善線粒體功能而干預(yù)DPN。

1 材料

1.1 動(dòng)物和細(xì)胞

SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量180～220 g，8周齡，購(gòu)自維通利華動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)SCXK（京）2021-0003，飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室[SYXK（京）2019-00207）]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)AEEI-2022-191）。

RSC96細(xì)胞株（貨號(hào)CL-0199）購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 藥品與試劑

芍藥苷（批號(hào)B21148，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；白芍總苷膠囊（國(guó)藥準(zhǔn)字H20055058，批號(hào)210609）購(gòu)自寧波立華制藥有限公司；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ，批號(hào)242-648-8，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）購(gòu)自北京克爾慧科技有限公司；TOM20 siRNA（批號(hào)P202302230043）購(gòu)自廣州銳博生物技術(shù)有限公司；-葡萄糖（批號(hào)G8270）、DAPI（批號(hào)D9542）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；DMEM高糖培養(yǎng)基（批號(hào)PM150210）購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司；澳洲胎牛血清（批號(hào)10099-141）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；0.25%胰酶（批號(hào)T1360）、青鏈霉素混合液（批號(hào)P1400）、PBS緩沖液（批號(hào)P1020-500）、高效RIPA組織/細(xì)胞快速裂解液（批號(hào)R0010）、PMSF（批號(hào)R0100）、蛋白上樣緩沖液（含DTT，批號(hào)P1015）、封閉用驢血清（批號(hào)SL050）、抗熒光衰減封片劑（含DAPI，批號(hào)S2110）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；Triton?X-100（批號(hào)0694-100 mL）、牛血清白蛋白（批號(hào)0332-100G）購(gòu)自美國(guó)Amresco公司；重組TOM20抗體（批號(hào)ab186735）、重組Trx2抗體（批號(hào)ab185544）、Alexa Fluor?488標(biāo)記的猴抗兔IgG二抗（批號(hào)150061）、Alexa Fluor?594標(biāo)記的猴抗小鼠IgG二抗（批號(hào)150108）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；S-100β多克隆抗體（批號(hào)15146-1-AP）、FlexAble CoraLite?Plus 488兔IgG抗體標(biāo)記試劑盒（批號(hào)KFA001）、FlexAble CoraLite?Plus 555兔IgG抗體標(biāo)記試劑盒（批號(hào)KFA002）、FlexAble CoraLite?Plus 647兔IgG抗體標(biāo)記試劑盒（批號(hào)KFA003）購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司；蛋白酶抑制劑（批號(hào)4693116001）、磷酸酶抑制劑（批號(hào)4906845001）購(gòu)自瑞士Roche公司；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（批號(hào)P0012A）、SDS（批號(hào)ST627）購(gòu)自Beyotime公司；Tris（批號(hào)1115GR500）、甘氨酸（批號(hào)1275GR500）購(gòu)自BioFroxx公司；脫脂奶粉（批號(hào)232100）購(gòu)自美國(guó)BD公司；三色預(yù)染蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)A3A2362）購(gòu)自艾科瑞生物公司；超敏發(fā)光液（批號(hào)WBKLS0100）購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；異氟烷（批號(hào)2022101601）購(gòu)自瑞沃德生命科技有限公司。

1.3 儀器

DV215CD型電子天平（美國(guó)OHAUS公司）；AC2-4E1型二級(jí)生物安全柜（新加坡ESCO公司）；INC153型二氧化碳培養(yǎng)箱（德國(guó)Memmert公司）；PowerPac?基礎(chǔ)電泳儀電源、Mini-PROTEAN?Tetra電泳槽、Trans-Blot?轉(zhuǎn)印槽（美國(guó)Bio-Rad公司）；FUSION FX凝膠&化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)（法國(guó)Vilber公司）；ULT-2186-4-V49型超低溫冰箱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；3K15型低溫離心機(jī)（美國(guó)Sigma公司）；Eppendorf ThermoMixer?C恒溫混勻儀（德國(guó)Eppendorf公司）；Allegra X-30型冷凍離心機(jī)（美國(guó)Beckman公司）；TE300型倒置熒光顯微鏡（日本Nikon公司）；DHG-9245A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海恒一精密儀器有限公司）；Opera Phenix Plus高內(nèi)涵篩選系統(tǒng)（美國(guó)PerkinElmer公司）；Matrx VIP 3000?Veterinary Vaporizer氣體麻醉機(jī)（美國(guó)Midmark公司）。

2 方法

2.1 體外實(shí)驗(yàn)

2.1.1 細(xì)胞培養(yǎng) RSC96細(xì)胞用DMEM完全培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.1.2 高內(nèi)涵分析 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RSC96細(xì)胞，制備成細(xì)胞懸液。用DMEM完全培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整至4×104個(gè)/mL，按100 μL/孔接種于96孔板中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。吸棄培養(yǎng)基，加入不同濃度（25、100、150 mmol/L）葡萄糖分別干預(yù)12、24、48 h。

另取接種RSC96細(xì)胞的96孔板，設(shè)置對(duì)照組、高糖組和芍藥苷組，對(duì)照組加入25 mmol/L葡萄糖干預(yù)24 h，高糖組和芍藥苷組加入150 mmol/L葡萄糖干預(yù)24 h，芍藥苷組同時(shí)加入10 mmol/L芍藥苷干預(yù)24 h。

吸棄培養(yǎng)基，加入4%多聚甲醛室溫固定并用PBS緩沖液浸洗細(xì)胞。0.1% Triton-X 100/PBS冰浴上透膜，PBS緩沖液浸洗細(xì)胞。加入3%牛血清白蛋白/PBS封閉，分別滴加TOM20和Trx2一抗，4 ℃孵育16 h；PBS緩沖液浸洗細(xì)胞。滴加相應(yīng)熒光二抗，室溫孵育2 h，PBS緩沖液浸洗細(xì)胞。加入DAPI工作液，室溫孵育，用PBS緩沖液浸洗細(xì)胞。每孔加入新鮮PBS緩沖液。96孔板送至清華大學(xué)藥學(xué)院藥物活性篩選平臺(tái)，應(yīng)用Opera Phenix高內(nèi)涵篩選系統(tǒng)對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行定量分析。利用SPSS軟件對(duì)2種蛋白進(jìn)行相關(guān)性分析。

2.1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RSC96細(xì)胞，制備成細(xì)胞懸液，用DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整至2.5×105個(gè)/mL。取4個(gè)6 cm的培養(yǎng)皿，分別加入3.8 mL DMEM完全培養(yǎng)基和200 μL細(xì)胞懸液，分別標(biāo)記為對(duì)照組、TOM20 siRNA組、TOM20 siRNA＋芍藥苷24 h組、TOM20 siRNA＋芍藥苷48 h組，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，100 nmol/L siRNA干預(yù)72 h阻斷效果最佳。根據(jù)TOM20 siRNA說(shuō)明書制備終濃度為100 nmol/L的轉(zhuǎn)染復(fù)合物，隨后避光孵育15 min。吸棄培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基，各組加入3.716 mL DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，TOM20 siRNA組、TOM20 siRNA＋芍藥苷24 h組、TOM20 siRNA＋芍藥苷48 h組分別加入284 μL轉(zhuǎn)染復(fù)合物，對(duì)照組加入含25 mmol/L葡萄糖的284 μL DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，每組加入0.4 mL胎牛血清。TOM20 siRNA＋芍藥苷24 h組、TOM20 siRNA＋芍藥苷48 h組分別于加入轉(zhuǎn)染復(fù)合物后24、48 h加入0.4 μL 10 mmol/L芍藥苷。待TOM20 siRNA干預(yù)72 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.1.4 Western blotting檢測(cè)TOM20及Trx2蛋白表達(dá) 按“2.1.3”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞并給藥，收集細(xì)胞，加入裂解液提取蛋白，蛋白樣品經(jīng)12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入5%脫脂牛奶，室溫封閉2 h，加入TBST洗滌液，于搖床上振蕩洗膜；分別加入Trx2、TOM20和β-actin一抗，孵育16 h，加入TBST洗滌液于搖床上振蕩洗膜。加入相應(yīng)二抗孵育1 h，加入TBST洗滌液于搖床上振蕩洗膜。滴加發(fā)光液顯影，用Image J軟件進(jìn)行定量分析。

2.2 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

2.2.1 大鼠造模 造模前檢測(cè)大鼠空腹血糖，剔除血糖不符合要求的大鼠后，隨機(jī)分為對(duì)照組（8只）和造模組（16只）。用0.1 mol/L無(wú)菌枸櫞酸緩沖液（pH 4.4）配制成1% STZ的溶液，造模組大鼠ip STZ（60 mg/kg）。1周后空腹血糖≥16.7 mmol/L視為高血糖模型造模成功，連續(xù)飼養(yǎng)12周。期間每2周測(cè)定1次大鼠空腹血糖，空腹血糖≥25.5 mmol/L的大鼠sc胰島素以降低死亡率。每4周測(cè)定鼠尾熱敏感性和足底機(jī)械敏感性，監(jiān)測(cè)周圍神經(jīng)病變情況。高血糖持續(xù)12周，以熱痛閾值、坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度及坐骨神經(jīng)病理變化脫髓鞘形成確定DPN模型造模成功。

2.2.2 分組及給藥 將成模大鼠隨機(jī)分為模型組和白芍總苷（5.6 mg/kg）組，每組8只。白芍總苷以生理鹽水配制成質(zhì)量濃度為2 mg/mL的藥液，白芍總苷組ig藥液，對(duì)照組和模型組ig等體積的生理鹽水，1次/d，連續(xù)給藥12周。大鼠末次給藥1 h后，采用氣體麻醉機(jī)，異氟烷氣體麻醉，隨后立刻進(jìn)行坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度測(cè)試，腹主動(dòng)脈取血后大鼠自然死亡，取大鼠坐骨神經(jīng)進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

2.2.3 免疫熒光法測(cè)定坐骨神經(jīng)中TOM20及Trx2蛋白表達(dá) 取大鼠坐骨神經(jīng)進(jìn)行石蠟包埋切片，切片厚度5 μm。各組隨機(jī)選取9只大鼠，每只制備1個(gè)坐骨神經(jīng)組織切片，組織切片經(jīng)脫蠟、水化后，使用微波法進(jìn)行抗原修復(fù)。采用驢血清室溫封閉1 h，配制TOM20、Trx2以及S-100β抗體染料混合物，4 ℃孵育過夜（16 h以上），滴加含DAPI封片劑室溫孵育，送至首都醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)與測(cè)試中心形態(tài)學(xué)研究測(cè)試室，應(yīng)用熒光顯微鏡（倒置）于40倍鏡下觀察坐骨神經(jīng)組織的形態(tài)并拍照，每個(gè)樣本隨機(jī)選取6個(gè)不同區(qū)域，用Image J軟件計(jì)算熒光強(qiáng)度并進(jìn)行共定位分析。TOM20以紅色熒光為陽(yáng)性表達(dá)，激發(fā)波長(zhǎng)為555 nm；Trx2以綠色熒光為陽(yáng)性表達(dá)，激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm；S100β以紫色為陽(yáng)性表達(dá)，激發(fā)波長(zhǎng)為647 nm。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 高糖環(huán)境對(duì)RSC96細(xì)胞中TOM20和Trx2蛋白表達(dá)的影響

為確定高糖濃度對(duì)RSC96細(xì)胞TOM20及Trx2蛋白表達(dá)的影響，RSC96細(xì)胞給予不同濃度（25、100、150 mmol/L）葡萄糖分別干預(yù)12、24、48 h。如圖1所示，與25 mmol/L葡萄糖組比較，給予高糖干預(yù)12、24 h，150 mmol/L葡萄糖組Trx2和TOM20蛋白表達(dá)水平均顯著降低（＜0.05、0.01）。給予高糖干預(yù)24 h，100 mmol/L葡萄糖組Trx2蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.05）。而給予高糖干預(yù)72 h后，與25 mmol/L葡萄糖組比較，100、150 mmol/L葡萄糖組Trx2和TOM20蛋白表達(dá)水平均無(wú)顯著差異。表明一定程度的葡萄糖濃度及適當(dāng)?shù)母深A(yù)時(shí)間能顯著影響RSC96細(xì)胞線粒體內(nèi)Trx2及TOM20蛋白的表達(dá)量，其中以150 mmol/L葡萄糖干預(yù)24 h的影響最為顯著。進(jìn)一步對(duì)24 h組的Trx2和TOM20數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)Trx2和TOM20在高糖環(huán)境下的表達(dá)具有相關(guān)性（相關(guān)系數(shù)為0.790，＜0.01）。

與同時(shí)間點(diǎn)25 mmol·L?1葡萄糖組比較：*P＜0.05 **P＜0.01。

3.2 TOM20調(diào)節(jié)RSC96細(xì)胞的Trx2線粒體輸入及芍藥苷的調(diào)節(jié)作用

為進(jìn)一步確定Trx2的線粒體輸入機(jī)制是否與TOM20有關(guān)以及芍藥苷是否通過上調(diào)TOM20蛋白的表達(dá)來(lái)促進(jìn)Trx2的線粒體輸入，采用TOM20 siRNA降低TOM20的表達(dá)，并觀察Trx2的表達(dá)。如圖2所示，與對(duì)照組比較，TOM20 siRNA組TOM20和Trx2蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.05、0.01）。而與TOM20 siRNA組比較，芍藥苷干預(yù)24、48 h后，Trx2和TOM20蛋白表達(dá)水平均顯著升高（＜0.05、0.01）。表明Trx2的線粒體輸入可能與TOM20蛋白有關(guān)，且芍藥苷能通過上調(diào)TOM20蛋白的表達(dá)量來(lái)促進(jìn)TOM20蛋白的線粒體輸入。

3.3 芍藥苷對(duì)高糖環(huán)境下RSC96細(xì)胞中TOM20和Trx2表達(dá)的影響

如圖3所示，與對(duì)照組比較，高糖組TOM20和Trx2蛋白表達(dá)水平均顯著降低（＜0.01）；與高糖組比較，芍藥苷組TOM20和Trx2蛋白表達(dá)水平均顯著升高（＜0.01）。表明芍藥苷能夠促進(jìn)高糖環(huán)境下RSC96細(xì)胞中TOM20蛋白的表達(dá)，從而增加Trx2線粒體蛋白輸入。

與對(duì)照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01；與TOM20 siRNA組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01。

與對(duì)照組比較：**P＜0.01；與高糖組比較：##P＜0.01。

3.4 白芍總苷對(duì)DPN大鼠坐骨神經(jīng)中TOM20和Trx2表達(dá)的影響

為驗(yàn)證芍藥苷增加DPN大鼠坐骨神經(jīng)中Trx2的線粒體運(yùn)輸是否通過調(diào)控TOM20蛋白的表達(dá)，選取DPN大鼠坐骨神經(jīng)進(jìn)行免疫熒光三標(biāo)法，其中S-100β蛋白作為SCs標(biāo)記物。如圖4所示，與對(duì)照組比較，模型組TOM20及Trx2蛋白表達(dá)均顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，白芍總苷組TOM20及Trx2蛋白表達(dá)均顯著升高（＜0.01）。表明白芍總苷能夠促進(jìn)DPN大鼠坐骨神經(jīng)TOM20蛋白的表達(dá)，從而增加Trx2的線粒體運(yùn)輸。

與對(duì)照組比較：**P＜0.01；與模型組比較：##P＜0.01。

4 討論

高糖環(huán)境誘導(dǎo)的線粒體氧化應(yīng)激，被認(rèn)為是導(dǎo)致SCs凋亡，坐骨神經(jīng)脫髓鞘，最終引發(fā)DPN的主要發(fā)病機(jī)制之一。本研究結(jié)果表明，芍藥苷具有通過上調(diào)SCs以及大鼠坐骨神經(jīng)中TOM20蛋白的表達(dá)，促進(jìn)Trx2的線粒體輸入從而降低氧化應(yīng)激，干預(yù)DPN的潛在價(jià)值。

在闡明了芍藥苷能夠通過上調(diào)TOM20蛋白的表達(dá)來(lái)促進(jìn)Trx2的線粒體輸入后，進(jìn)一步對(duì)TOM20依賴的線粒體輸入途徑或其影響線粒體功能的作用機(jī)制進(jìn)行分析。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病小鼠在乙醛脫氫酶2（aldehyde dehydrogenase-2，）基因在過表達(dá)和敲減的情況下會(huì)影響TOM20蛋白的表達(dá)量，但對(duì)于正常小鼠則沒有影響[20]；Zhu等[21]通過建立膿毒癥小鼠模型，利用免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞中TOM20蛋白的含量，發(fā)現(xiàn)在蛋白激酶Cα（protein kinase Cα type，PRKCA）過表達(dá)的情況下能夠促進(jìn)膿毒癥患者的線粒體自噬，主要表現(xiàn)為TOM20蛋白與微管相關(guān)蛋白輕鏈3（microtubule-associated protein light chain3，LC3）蛋白的共定位以及表達(dá)量增加；You等[22]利用香煙提取物處理BEAS-2B細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)泛素特異性蛋白水解酶19（ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 19，USP19）敲低的細(xì)胞中TOM20蛋白表達(dá)升高，從而降低了FUNDC1和LC3-II/I的表達(dá)，提高了細(xì)胞存活率。

根據(jù)前期SCs線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)的結(jié)果，已鑒定SCs線粒體蛋白1 072個(gè)，其中高糖環(huán)境誘導(dǎo)的差異蛋白392個(gè)，包括348個(gè)蛋白的表達(dá)顯著上調(diào)，44個(gè)蛋白的表達(dá)顯著降低。在課題組前期組學(xué)結(jié)果中，也觀測(cè)了USP19、ALDH2、PRKCA蛋白的表達(dá)發(fā)生了顯著性變化。而對(duì)于芍藥苷是否通過調(diào)控這幾種蛋白的表達(dá)來(lái)影響TOM20蛋白尚未可知，是可以進(jìn)一步探索的問題。同時(shí)，在查閱文獻(xiàn)以及STRING數(shù)據(jù)庫(kù)時(shí)發(fā)現(xiàn)線粒體動(dòng)力相關(guān)蛋白1（dynamin-related protein 1，Drp1）[23]、FUNDC1[24]、NR1D1[25]、PINK1[26]等蛋白也能夠一定程度上調(diào)控TOM20蛋白的表達(dá)，但比較遺憾的是課題組前期組學(xué)數(shù)據(jù)中尚未觀測(cè)到以上幾種蛋白或是并未出現(xiàn)顯著性差異。究其原因可能是SCs線粒體提取與鑒定、線粒體蛋白定位等的復(fù)雜性。

TOM20除了作為線粒體輸入蛋白，還主要作為檢測(cè)線粒體自噬以及細(xì)胞衰老的標(biāo)志物。Li等[27]通過LC3‐II/I和p62在TOM20和LAMP1之間的表達(dá)和共定位，證實(shí)了線粒體去乙酰化酶sirtuin 3（SIRT3）顯著調(diào)節(jié)肝纖維化中的線粒體自噬。Victorelli等[28]證實(shí)了線粒體外膜通透性增加是細(xì)胞衰老的重要特征，而在輻射誘導(dǎo)的衰老細(xì)胞以及復(fù)制性衰老細(xì)胞中，細(xì)胞色素C與TOM20蛋白的共定位減少。大量研究表明，線粒體可以通過自噬來(lái)消融受損的線粒體，以起到抑制線粒體ROS氧化應(yīng)激的作用[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，高糖環(huán)境下TOM20蛋白的表達(dá)顯著降低，故而認(rèn)為SCs在高糖環(huán)境下氧化應(yīng)激可能也與線粒體自噬減弱有關(guān)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect of paeoniflorin on TOM20 of mitochondrial import pathway in diabetic peripheral neuropathy

LIU Dongqi1, YAN Shiqi1, LIU Haolong2, YANG Xinwei1

1. Beijing Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Research on Collaterals, School of Traditional Chinese Medicine, Capital Medical University, Beijing 100069, China 2. Beijing Chao-Yang Hospital, Capital Medical University, Beijing 100020, China

To investigate the effect of paeoniflorin (PF) on the protein involved in mitochondrial import pathway mitochondrial translocase of outer mitochondrial membrane 20 (TOM20) in the sciatic nerve of diabetic peripheral neuropathy (DPN) rats and high glucose environment of Schwann cells (SCs).RSC96 cells was used to intervene with 25, 100 and 150 mmol/L glucose for 12, 24 and 48 h, respectively, and the expressions of TOM20 and mitochondrial thioredoxin 2 (Trx2) were detected by high content analysis; Control group (25 mmol/L glucose), TOM20 siRNA group, TOM20 siRNA + paeoniflorin 24 h group, and TOM20 siRNA + paeoniflorin 48 h group were set up. After transfection with TOM20 siRNA, 10 mmol/L paeoniflorin was given for 24, 48 h, respectively, Western blotting was used to detect TOM20 and Trx2 protein expressions; Control group (25 mmol/L glucose), high glucose group (150 mmol/L glucose), and paeoniflorin group (150 mmol/L glucose + 10 mmol/L paeoniflorin) were set up, high connotation analysis was used to detect TOM20 and Trx2 protein expressions. DPN rat model was prepared and given total glucosides of paeony, immunofluorescence was used to detect TOM20 and Trx2 protein expressions in sciatic nerve of rats.The results of high content analysis showed that after 12, 24 h of 150 mmol/L glucose intervention, TOM20 and Trx2 protein expressions were significantly decreased (< 0.05, 0.01), and there was a correlation between the expressions of the two proteins. Compared with control group, TOM20 and Trx2 protein expressions in high glucose group were significantly decreased (< 0.01); Compared with high glucose group, TOM20 and Trx2 protein expressions in paeoniflorin group were significantly increased (< 0.01). The results of Western blotting showed that compared with control group, TOM20 and Trx2 protein expressions in TOM20 siRNA group were significantly decreased (< 0.05, 0.01); Compared with TOM20 siRNA group, TOM20 and Trx2 protein expressions were significantly increased after intervention with paeoniflorin for 24, 48 h (< 0.05, 0.01). Compared with control group, TOM20 and Trx2 protein expressions were significantly decreased in sciatic nerve of rats in model group (< 0.01); Compared with model group, TOM20 and Trx2 protein expressions were significantly increased in total glucosides of paeony group (< 0.01).Paeoniflorin can effectively counteract mitochondrial oxidative stress by up-regulating the expression of TOM20 protein in SCs as well as rat sciatic nerve and promoting the mitochondrial input of Trx2, which has therapeutic potential for the treatment of DPN.

paeoniflorin; Schwann cells; diabetic peripheral neuropathy; translocase of outer mitochondrial membrane 20; mitochondrial thioredoxin

R285.5

A

0253 - 2670(2024)09 - 2987 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2024.09.013

2023-11-18

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（82174184）；北京市教育委員會(huì)科技計(jì)劃一般項(xiàng)目（KM202210025021）；北京市科學(xué)技術(shù)協(xié)會(huì)青年人才托舉工程（BYESS2023386）；國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（82204826）。

劉東齊（2001—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幏乐翁悄虿≈車窠?jīng)病變的機(jī)制研究。E-mail: 15801564517@163.com

通信作者：楊鑫偉（1989—），女，副教授，碩士生導(dǎo)師，從事中藥及復(fù)方藥效和作用機(jī)制研究。E-mail: yxw0226@ccmu.edu.cn

[責(zé)任編輯 李亞楠]