熱毒寧注射液霧化吸入給藥的安全性研究

張騰之，宋 玲#，唐黎明，侯紅平，谷舒怡，高云航，航 艾，李 晗，彭 博，陳韡亞，陳騰飛，張廣平

熱毒寧注射液霧化吸入給藥的安全性研究

張騰之1，宋 玲1#，唐黎明2，侯紅平1，谷舒怡2，高云航1，航 艾2，李 晗1，彭 博1，陳韡亞1，陳騰飛1*，張廣平1*

1. 中國中醫科學院中藥研究所，北京 100700 2. 上海市食品藥品檢驗研究院藥理毒理所，上海 201112

針對熱毒寧注射液霧化吸入給藥后可能的安全性風險開展研究，為熱毒寧注射液霧化吸入臨床應用提供基礎和依據，探討中藥霧化吸入制劑臨床前安全性評價的技術方法。在GLP條件下開展熱毒寧注射液大鼠霧化吸入單次給藥和重復給藥30 d毒性實驗，大鼠黏膜刺激（伴隨反復給藥觀察）和豚鼠全身主動過敏實驗。在連續給藥7 d后，分別在停藥1、7、14 d時對熱毒寧注射液在肺中檢測到的31種成分進行分析。大鼠單次口鼻暴露120 min/次、2次/d，動物未見明顯異常；熱毒寧低、中、高劑量（30、60、120 min/d）組大鼠口鼻吸入重復給藥30 d、恢復期14 d毒性實驗對血液學、血液生化、肺系數、尿液、組織病理學未見藥物相關的病理改變，對呼吸道黏膜未見刺激性。豚鼠全身主動過敏實驗為陰性。所分析到的熱毒寧注射液的31種成分在停藥14 d后所有成分均檢測不到或者在檢測限下。熱毒寧注射液霧化吸入給藥對呼吸道黏膜無刺激和過敏，大鼠口鼻暴露1個月未見明顯毒性反應，所測定的31種成分均能夠在肺部代謝，無明顯沉積。

熱毒寧注射液；霧化吸入；安全性；肺沉積；梔子苷；新綠原酸；綠原酸；隱綠原酸

相對于傳統的口服和注射給藥，霧化吸入給藥治療呼吸道疾病具有明顯的優勢。霧化吸入給藥為肺部靶向給藥，可提高呼吸道的藥物濃度，同時可以避免首過效應和胃腸道降解，因而能夠提高藥物的療效。霧化吸入給藥劑量遠低于注射和口服給藥，藥物進入全身血液循環的濃度大幅度降低，因而極大地減少了藥物全身暴露可能的安全性風險。盡管目前中藥仍然沒有霧化吸入制劑上市，但是其作為一種療法在臨床廣泛應用。近年來將中藥注射劑霧化吸入應用于臨床治療呼吸系統疾病有大量報道[1]。熱毒寧注射液是由青蒿、金銀花、梔子3味中藥經過水蒸氣蒸餾技術、連續逆流萃取技術和超濾膜分離技術提純精制而成的中藥注射劑。臨床用于治療外感風熱所致感冒、咳嗽，癥見高熱、微惡風寒、頭痛身痛、咳嗽、痰黃等。臨床報道顯示熱毒寧注射液采用霧化吸入方式給藥，在治療急性上呼吸道感染[2-3]、急性支氣管炎[4]、慢性支氣管炎[5]、毛細支氣管炎[6-10]等呼吸道疾病上取得了良好的療效。然而將注射液霧化吸入給藥屬于用藥途徑改變，其臨床前的安全性研究仍然是空白，注射制劑用于霧化吸入方式給藥帶來的呼吸道高暴露、藥物成分肺沉積及對黏膜刺激等安全性問題尚需論證。本研究首先基于《中國藥典》2020年版四部0111吸入制劑項下供霧化器用液體制劑的規定，對熱毒寧注射液作為霧化吸入制劑的可行性進行評估，在此基礎上通過熱毒寧注射液大鼠霧化吸入急性毒性、重復給藥30 d毒性、大鼠黏膜刺激和豚鼠全身主動過敏實驗，對熱毒寧注射液在肺中成分進行檢測，對熱毒寧注射液霧化吸入給藥的臨床前安全性進行研究，為臨床應用提供依據和基礎。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級Wistar大鼠，體質量180～200 g，6～8周齡，雌雄各半，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，動物生產許可證號SCXK（滬）2017-0005。SPF級SD大鼠，體質量180～200 g，6～8周齡，雌雄各半，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物生產許可證號SCXK（京）2016-0006。SPF級Hartley豚鼠，體質量298.0～371.3 g，5～6周齡，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物生產許可證號SCXK（京）2016-0011。動物合格證號為2015000548281、11400700359727、1100111911043753、1100111911043753、11400700359729、11400700262038。本實驗中涉及操作均符合本單位倫理委員會要求和標準。動物倫理編號為IACUC-SIFDC17119、IACUC-SIFDC18103、IACUC-SIFDC17100。單次多次給藥毒性實驗、過敏反應均在上海市食品藥品檢驗所藥物安全評價中心開展；肺組織沉積實驗在北京市醫療器械檢驗所實驗動物飼養房開展，均為屏障環境。

1.2 藥品與試劑

熱毒寧注射液（批號180709）購自江蘇康緣藥業股份有限公司；氯化鈉注射液（批號16102102）購自華裕（無錫）制藥有限公司；梔子苷對照品（批號110749-201718，質量分數為97.6%）購自中國食品藥品檢定研究院；對照品新綠原酸（批號MUST-18031001，質量分數為99.67%）、綠原酸（批號MUST-18030620，質量分數為99.39%）、隱綠原酸（批號MUST-18032403，質量分數為99.07%）購自成都曼思特生物科技有限公司；肝素鈉（批號B02M8S30252）購自上海源葉生物科技有限公司；戊巴比妥鈉、甲醇（色譜純）購自德國Merck公司；甲酸（色譜純）購自美國ROE公司；0.9%氯化鈉注射液（批號1901293203）購自石家莊四藥有限公司。

1.3 儀器

Pari LC PLUS霧化發生器、Turbo Boy N型藍芯霧化器（德國Pari公司）；IES-N型口鼻式吸入暴露系統（上海瑞曼信息科技有限公司）；PCXR8型采樣泵（美國SKC公司）；LLC型Intox7級聯撞擊器（美國In-Tox Products公司）；4146型流量校準計（美國TSI公司）；ADVIA 2120i型血液分析儀（西門子公司）；CA1500型全自動血凝儀（日本Sysmex公司）；URIT-1600型全自動尿液分析儀（優利特）；7100型全自動生化分析儀（日本HITACHI公司）；ASP6025型旋轉式組織處理機、Histocore組織包埋處理中心、ST5020型自動組織切片染色機（德國Leica公司）；MICROM HM 315型旋轉切片機（美國Thermo公司）；液相色譜-質譜聯用分析系統由ExionLC AC超高效液相儀及QTRAP 5500質譜儀組成，系統工作軟件為Analyst 1.62（美國Sciex公司）；601-2202-002 Rev04型、601-2202-002 Rev05型動物口鼻暴露系統（美國DSI公司）；RVC 2-18 CD plus真空離心濃縮系統（德國CHRIST公司）；T18 digital ultra turrax高速分散勻漿機（德國IKA公司）；5424R型臺式離心機（德國Eppendorf公司）；Vortex-genie2型可調速渦旋混合器（美國Industrial Scientific公司）；BCD-189WDPV型?20 ℃低溫冰箱（海爾集團公司）。

2 方法

2.1 霧化質量控制

2個Y型并聯的Pari LC PLUS霧化發生器，發生體積流量4 L/min；口鼻式吸入暴露系統：雙層塔，每層12孔，每層裝12只動物。熱毒寧注射液符合相關治療標準，霧化器為Pari Turbo Boy N藍芯；呼吸模擬器型號為BRS2000。結果以綠原酸計，遞送速率0.71 mg/min，遞送總量1.92 mg。

按照吸入制劑微細粒子空氣動力學特征測定法（《中國藥典》2020年版四部0951）以裝置3（NGI）項下供霧化器用的液體制劑檢查法檢查微細粒子劑量。以綠原酸和梔子苷計，空氣動力學中值直徑（mass median aerodynamic diameter，MMAD）約為4.6 μm，微細粒子分數（fine particle fraction，FPF）為46%。

2.2 熱毒寧注射液大鼠口鼻吸入單次給藥毒性實驗

取體質量合格的Wistar大鼠40只，隨機分為陰性對照組和熱毒寧組，每組20只，雌雄各半。熱毒寧組霧化吸入給藥120 min，2次/d，間隔4 h，陰性對照組動物同法吸入空氣。給藥后觀察14 d，觀察給藥后14 d內動物反應癥狀，對觀察期結束后的存活動物進行大體解剖，觀察臟器病變情況。

2.3 熱毒寧注射液大鼠口鼻吸入重復給藥30 d恢復期14 d毒性實驗

取Wistar大鼠120只，雌雄各半，隨機分為陰性對照組和熱毒寧低、中、高劑量組，每組30只，每籠5只飼養。熱毒寧低、中、高劑量組暴露時間分別為30、60、120 min。陰性對照組動物同法吸入空氣，吸入時間與同周期內吸入時間最長的組相同，1次/d，連續30 d，停藥恢復期為14 d。實驗期間觀察大鼠一般狀況（發病、死亡、體質量、攝食攝水、毛發、皮膚、腺體分泌、糞便形狀、呼吸及循環系統、自主效應、神經系統）及血液學指標，每日給藥前觀察大鼠鼻腔黏膜與口腔黏膜可視范圍內有無紅腫、流血、潰瘍等現象，給藥后即刻觀察動物局部刺激癥狀（如哮喘、咳嗽、嘔吐、窒息等癥狀），對解剖動物進行大體觀察和組織病理學觀察。

2.4 熱毒寧注射液全身主動過敏試驗

取體質量合格的豚鼠32只，按隨機分組表均分為陰性對照組、陽性對照組和熱毒寧高、低劑量組。熱毒寧高劑量組取受試物原液作為致敏液與激發液，致敏給藥時間60 min，激發時給藥時間為120 min。熱毒寧低劑量組取受試物原液作為致敏液與激發液，致敏給藥時間為30 min，激發給藥時間為60 min。陰性對照組采用氯化鈉注射液原液，吸入時間與同周期內吸入時間最長的組相同。陽性對照組致敏時取卵白蛋白，以氯化鈉注射液配制成3 mg/mL致敏液，與熱毒寧組同法霧化致敏液20 min。激發時取卵白蛋白，以氯化鈉注射液配制成6 mg/mL激發液，與熱毒寧組同法霧化致敏液最長至40 min。

實驗中致敏階段受試物與對照品均采用口鼻霧化方式給藥，每隔1 d給藥1次，連續3次。激發階段仍采用口鼻霧化方式給藥，各組各取半數動物于末次致敏后第14、21天進行激發。每次致敏和激發當日稱量記錄每組每只動物的體質量。致敏期間，每日觀察記錄動物的一般癥狀。激發當日，動物口鼻霧化給予熱毒寧高、低劑量組或陰性、陽性對照藥物后即刻至30 min，詳細觀察每只動物的反應，記錄癥狀的出現及消失時間。

2.5 熱毒寧注射液大鼠肺組織沉積實驗

2.5.1 分組、給藥和取材 SD大鼠適應性飼養5 d，取體質量合格的大鼠54只，隨機分為空白組、熱毒寧低、高劑量（30、120 min/次）組，每組18只，雌雄各半，每日給藥1次，連續給藥7 d。首次給藥前，大鼠禁食過夜，正常飲水，給藥開始時禁食禁水，給藥后2 h恢復飲水，4 h恢復飲食。各組大鼠分別在末次給藥結束后1、7、14 d進行處理和取材，每組每個取材點各處理6只動物，雌雄各半。動物處理前禁食過夜，正常飲水。大鼠麻醉后，腹主動脈采盡血液，采集完整的肺組織。取肺組織用流動的生理鹽水沖洗，濾紙吸干水分，稱定質量，?20 ℃保存。將肺組織37 ℃水浴解凍，剪成小塊，加入4倍體積的生理鹽水，冰浴勻漿3 min，?20 ℃保存。

2.5.2 工作溶液配制 精密稱取梔子苷、新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸對照品適量，分別置10 mL量瓶中，加甲醇超聲溶解后定容，搖勻后取該母液適量，分別用甲醇稀釋成質量濃度均為1 mg/mL的對照品儲備液。取一定量的各化合物儲備液，混合后加甲醇配制成梔子苷、新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸質量濃度分別為1、10、2、5 μg/mL的混合對照品溶液（MIX0），用甲醇按一定比例將MIX0稀釋成梔子苷、新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸質量濃度分別為1、10、2、5 ng/mL的混合檢出限工作溶液；取一定量的各化合物儲備液，混合后加甲醇配制成梔子苷、新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸質量濃度分別為2、20、5、10 μg/mL的混合標準溶液（MIX1），用甲醇按一定比例將MIX1稀釋成梔子苷、新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸質量濃度分別為2、20、5、50 ng/mL的混合定量限工作溶液。于?80 ℃冰箱冷凍保存。

2.5.3 樣品處理 精密吸取50 μL檢出限及定量限混合樣品溶液或大鼠肺組織勻漿樣品，加甲醇150 μL，渦旋2 min，超聲1 min，?4 ℃、12 000 r/min離心5 min，取150 μL上清，45 ℃真空離心濃縮至干燥。加入75 μL 5%甲醇水溶液復溶，渦旋2 min，?4 ℃、12 000 r/min離心5 min，取上清進樣分析。

2.5.4 精密度 取“2.5.2”項下混合檢出限和定量限工作溶液各10 μL，各加入大鼠空白肺組織勻漿90 μL，渦旋混勻，得梔子苷、新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸質量濃度分別為0.1、1.0、0.2、0.5 ng/mL的混合檢出限質控溶液，以及梔子苷、新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸質量濃度分別為0.2、2.0、0.5、5.0 ng/mL的混合定量限質控溶液，之后各取50 μL，按“2.5.3”項進行樣品處理并分析，每個批次每個質控樣品設置5個重復，測定3個批次。

2.5.5 色譜條件 色譜柱：Waters Symmetry C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，5 μm），Waters VanGuard Cartridge for Symmetry C18，5 μm預柱；柱溫40 ℃；流動相為0.05%甲酸水溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫：0～1.5 min，95% A；1.5～10 min，95%～5% A；10～12 min，5% A；12～15.5 min，5%～95% A；15.5～17 min，95% A。體積流量0.5 mL/min；進樣量5 μL；樣品盤溫度6 ℃；分析時間17 min。

2.5.6 質譜條件 電噴霧離子源（ESI），負離子模式，噴霧電壓?4 500 V，輔助氣1（N2）50 Arb，輔助氣2（N2）50 arb，輔助氣加熱溫度550 ℃，氣簾氣35 arb。采用MRM掃描方式對31個化合物進行分析，質譜參數見表1。

2.6 統計學分析

表1 熱毒寧注射液吸入溶液中31種檢測成分質譜參數及保留時間

表1（續）

*為[M＋HCOO]?。

*is [M＋HCOO]?.

3 結果

3.1 單次給藥毒性

Wistar大鼠霧化吸入熱毒寧注射液，熱毒寧組給藥時間為120 min/次，2次/d，各組動物給藥后即刻均未見明顯異常，未見明顯急性毒性反應及動物死亡。動物繼續觀察14 d，毛發、行動、精神狀態、采食、飲水、二便及腔道分泌物均未見明顯異常。給藥后第7、14天稱定質量，動物體質量均增長。兩組同性別動物在相同實驗周期中體質量無明顯組間差異。大體觀察與大體解剖均未見明顯異常。

3.2 多次給藥毒性

3.2.1 一般狀況觀察 給藥期間和給藥結束后觀察14 d，熱毒寧各劑量組與陰性對照組動物一般狀況未見明顯異常。

3.2.2 動物體質量和耗食量觀察 如表2所示，實驗期間動物各組動物的體質量呈增長趨勢。與陰性對照組比較，熱毒寧高劑量組雄性動物自第11天起平均體質量低于陰性對照組，同時在給藥期間動物耗食量減少，推測可能與動物霧化給藥過程中暴露時間長應激反應相關，停止給藥后耗食量較給藥期間增加，雖仍低于陰性對照組，但動物體質量增加與其他各劑量組無明顯差異。

表2 各組大鼠體質量變化(, n = 15)

C-陰性對照；RH-熱毒寧高劑量組；RM-熱毒寧中劑量組；RL-熱毒寧低劑量組；與陰性對照組比較：*＜0.05**＜0.01，下表同。

C-negative control; RH-Reduning high-dose group; RM-Reduning medium-dose group; RL-Reduning low-dose group;*< 0.05**< 0.01negative control group, same as below tables.

3.2.3 血液學觀察 如表3、4所示，與陰性對照組比較，給藥30 d雄鼠熱毒寧中劑量組紅細胞、血紅蛋白、血細胞比容出現明顯異常（＜0.05）；恢復期末雄鼠熱毒寧高劑量組平均紅細胞體積、嗜堿性粒細胞、網織紅細胞，熱毒寧中劑量組嗜堿性粒細胞以及熱毒寧低劑量組白細胞、嗜堿性粒細胞出現明顯異常（＜0.05、0.01），血液學其余各檢查指標均未見明顯差異。盡管上述指標統計數值出現異常變化，但其相關聯的其余血液學檢查均未見明顯異常，未見明顯量效關系，故不認為以上這些改變具有生物學意義。

表3 各組雄性大鼠血液學檢查結果(, n = 15)

表4 各組雌性大鼠血液學檢查結果(, n =15)

3.2.4 血液生化結果 如表5、6所示，與陰性對照組比較，給藥30 d雌鼠熱毒寧中劑量組TG水平出現明顯異常（＜0.05），恢復期末雄鼠熱毒寧中劑量組GLU水平以及熱毒寧低劑量組GLU和BUN水平出現明顯異常（＜0.05、0.01），血液生化學其余各項指標均未見明顯差異。由于上述指標改變為偶發且不具備劑量相關性，故不認為以上這些改變具有生物學意義。

表5 各組雄性大鼠血生化檢查結果(, n = 15)

ALT-丙氨酸氨基轉移酶；AST-天冬氨酸氨基轉移酶；ALP-堿性磷酸酶；TP-血清總蛋白；ALB-血清白蛋白；TB-血清總膽紅素；GLU-血糖；BUN-血尿素氮；CRE-血肌酐；CHO-膽固醇；TG-三酰甘油；CK-肌酸激酶；γ-GT-γ-谷氨酰轉肽酶，表6同。

ALT-alanine aminotransferase; AST-aspartate aminotransferase; ALP-alkaline phosphatase; TP-total protein; ALB-albumin; TB-total bilirubin; GLU-glucose; BUN-blood urea nitrogen; CRE-creatinine; CHO-cholesterol; TG-triglyceride; CK-creatine kinase; γ-GT-γ-glutamyl transferase, same as Table 6.

表6 各組雌性大鼠血生化檢查結果(, n = 15)

3.2.5 臟器系數結果 如表7、8所示，與陰性對照組比較，給藥30 d雄鼠熱毒寧高劑量組腦、睪丸、附睪指數具有顯著差異（＜0.01），熱毒寧中劑量組腦指數具有顯著差異（＜0.01），熱毒寧低劑量組腦指數具有顯著差異（＜0.05）；恢復期末雄鼠熱毒寧高劑量組腎臟、肺臟指數具有顯著差異（＜0.05），熱毒寧中劑量組肺臟指數具有顯著差異（＜0.05），熱毒寧低劑量組肝臟指數具有顯著差異（＜0.01）。給藥30 d雌鼠熱毒寧中劑量組肺臟指數具有顯著差異（＜0.05），熱毒寧低劑量組腎上腺指數具有顯著差異（＜0.01）。但是數值異常變化未見明顯劑量相關性，臟器系數以及動物血液學、血清生化學結果均未見明顯相關性的改變，考慮這些改變無生物學意義，與給予受試物無關。

表7 各組雄性大鼠臟器指數變化(, n = 10)

與RH組比較：#＜0.05##＜0.01，表8同。

#< 0.05##< 0.01RH group, same as below table 8.

表8 各組雌性大鼠臟器指數變化(, n =10)

3.2.6 組織病理學觀察 對各組動物的鼻甲、口腔黏膜、咽喉部、氣管及肺部均進行組織病理學檢查，并對陰性對照組及熱毒寧高劑量組的其他臟器包括心、肝、脾、肺、腎等器官進行常規組織病理學檢查。大體剖檢與組織病理學檢查結果表明，上述檢測未見與藥物相關的病理表現，各組動物臟器[腦、脊髓、垂體、胸腺、甲狀腺、胃、小腸和大腸、肝臟、腎臟、腎上腺、脾臟、胰腺、氣管、肺、主動脈、心臟、附睪、睪丸、卵巢、子宮、前列腺、坐骨神經、膀胱、食管旁淋巴結、腸系膜淋巴結、骨髓（股骨）、陰道、精囊、眼-哈氏腺]未見明顯異常；所有受試動物鼻黏膜、口腔黏膜及咽喉部組織未見明顯出血、變性等明顯異常改變，肺及氣管組織無明顯滲出、出血及組織壞死等病理反應，提示熱毒寧注射液對大鼠口腔黏膜、咽喉部組織及呼吸系統不產生明顯的刺激作用，見圖1。綜上，認為熱毒寧注射液未對受試動物產生藥物毒性相關性病理改變。

3.3 全身主動過敏實驗

實驗過程中各組動物致敏和激發階段體質量均增長，均未見其他明顯異常癥狀。陰性對照組和熱毒寧高、低劑量組動物采用不同激發物質霧化激發后，均未見明顯過敏反應，激發后觀察30 min，動物未見明顯異常。陽性對照組動物激發后出現不安寧、咳嗽、呼吸急促、呼吸困難、紫紺、痙攣、潮式呼吸、死亡。熱毒寧注射液吸入經豚鼠全身主動過敏實驗，過敏反應呈陰性。

a-口腔黏膜組織；b-鼻腔前庭部鼻黏膜組織；c-鼻呼吸部鼻黏膜組織；d-鼻嗅部鼻黏膜組織；e-咽喉部組織；f-氣管壁組織；g-肺臟組織。

3.4 大鼠肺組織沉積實驗

3.4.1 熱毒寧注射液藥物成分篩選結果 梔子苷、新綠原酸、綠原酸及隱綠原酸4種成分是熱毒寧注射液的質控成分。其定量分析方法已經在前期經過方法學驗證[10]。另外從熱毒寧注射液中共篩選出其他27種成分。31種成分的相對分子質量為138～756，包括環烯醚萜及其苷類、咖啡酰奎寧酸類、黃酮及其苷類以及其他糖苷類等。優化了31種藥物成分的質譜參數，通過對稀釋2 000倍和4 000倍的熱毒寧溶液樣品進行分析和檢測，確定31種藥物成分的保留時間。保留時間見表1，相應圖譜見圖2。

3.4.2 4種指標成分在大鼠肺組織的檢出限與定量限

（1）檢出限：本實驗條件下，肺組織中梔子苷的檢出限低于0.1 ng/mL，新綠原酸的檢出限低于1 ng/mL，綠原酸的檢出限低于0.2 ng/mL，隱綠原酸的檢出限低于0.5 ng/mL。

（2）定量限：本實驗條件下，肺組織中梔子苷的定量限約為0.2 ng/mL，新綠原酸的定量限約為2 ng/mL，綠原酸的定量限為0.5 ng/mL，隱綠原酸的定量限約為1 ng/mL。

（3）精密度：以各化合物的峰面積計算精密度，結果顯示，4個化合物檢出限的批內精密度RSD在10.0%～11.9%，批間精密度RSD在9.9%～11.2%；4個化合物定量限的批內精密度RSD在5.6%～10.3%，批間精密度RSD在6.3%～8.8%。

3.4.3 熱毒寧注射液連續給藥后不同恢復期大鼠肺組織沉積研究

（1）4種代表成分的大鼠肺組織沉積研究：如圖3-A所示，隨著恢復天數的增加，肺組織中梔子苷的峰面積呈現遞減的趨勢。恢復期第7天，低劑量組梔子苷的峰面積已經基本低于定量限。恢復期第14天，低、高劑量組梔子苷的峰面積已經基本低于檢出限。如圖3-B所示，隨著恢復天數的增加，肺組織中新綠原酸的峰面積呈現遞減的趨勢，恢復期第7、14天，低、高劑量組雌、雄大鼠肺組織中均未檢測到新綠原酸。如圖3-C所示，恢復期第7天，低、高劑量組綠原酸的峰面積已經基本低于定量限。恢復期第14天，低、高劑量組梔子苷的峰面積已經基本低于檢出限。如圖3-D所示，恢復期第1天大鼠肺組織中均檢測到隱綠原酸；恢復期第7、14天，低、高劑量組雌、雄大鼠肺組織中均未檢測到隱綠原酸。上述結果表明梔子苷、綠原酸、新綠原酸均夠在大鼠肺組織中逐漸被代謝和消除。

（2）其他27種藥物成分的大鼠肺組織沉積研究：在其他27種藥物成分的沉積研究中，來源于金銀花的咖啡酸在每個恢復期取材點僅有1只大鼠肺中可檢測到，其余5只均未檢測到，說明該成分在肺組織中被代謝和消除。京尼平龍膽雙糖苷、jasminoside、山梔子苷、京尼平苷酸、6′′--芥子酰基京尼平龍膽雙糖苷均為環烯醚萜苷類成分；木犀草苷、芹菜素-7--葡萄糖苷、蘆丁均為黃酮類成分，以及斷氧化馬錢子苷、斷氧馬錢子酸和獐牙菜苷僅能在恢復期第1、7天能檢測到，其余15種成分在恢復期1、7和14 d均未檢測到。

1-梔子苷；2-新綠原酸；3-綠原酸；4-隱綠原酸；5-山梔子苷；6-京尼平苷酸；7-京尼平龍膽雙糖苷；8-6′′-O-香豆酰基京尼平龍膽雙糖苷；9-6′′-O-阿魏酰基京尼平龍膽雙糖苷；10-6′′-O-芥子酰基京尼平龍膽雙糖苷；12-奎寧酸；13-咖啡酸；14-1,5-二咖啡酰奎寧酸；15-異綠原酸B；16-異綠原酸A；17-異綠原酸C；18-馬錢苷酸；19-斷氧化馬錢子苷；20-斷氧馬錢子酸；23-阿魏酸；24-原兒茶醛；25-獐牙菜苷；26-蘆丁；27-山奈酚；28-芹菜素-7-O-葡萄糖苷；29-木犀草苷；30-槲皮素-3-O-半乳糖苷。

圖3 連續給藥后不同恢復期大鼠肺組織中梔子苷 (A)、新綠原酸(B)、綠原酸(C) 和隱綠原酸(D) 的峰面積變化(, n = 18)

4 討論

吸入給藥在治療呼吸道疾病方面具有明顯的優勢，近幾年吸入給藥的產品開發獲得藥品生產企業的重點關注，其中毒理研究是其關鍵的一環。目前針對吸入藥物非臨床評價的技術要求，僅經濟合作與發展組織（OECD）頒布了吸入藥物非臨床試驗技術指南。美國FDA提出了針對吸入藥物的非臨床評價建議[11]，2008年藥品審評中心組織專家對于吸入給藥的安全性進行討論，針對化藥吸入給藥的安全性公布了《肺部吸入制劑毒理研究的關注點》。指出吸入給藥藥物直接作用于肺部且有全身吸收，因此肺部、全身性吸入毒性研究十分有價值，其他給藥途徑的毒性無法替代。

霧化吸入給藥為呼吸道的局部給藥，藥物在呼吸道的高暴露，需要關注藥物對呼吸道黏膜的刺激和過敏。肺泡表面積巨大，血氣屏障薄，代謝酶少，血流豐富，吸入后藥物能夠迅速入血，藥物吸入給藥的過程中會沉積在口咽部可通過胃腸道入血使藥物在全身暴露，因此還需要關注藥物全身暴露導致的其他臟器以及胃腸道的毒性。不同于單一成分化藥，中藥成分復雜藥物成分吸入肺部后期代謝情況尚不清楚，因此對于多成分復方中藥藥物成分在肺部的滯留可能帶來的風險是中藥吸入給藥安全性關注的焦點。熱毒寧注射液是2005年版《藥品注冊管理辦法》實施后獲批的第1個中藥注射劑新藥，已經在臨床應用多年，開展過系統的注射給藥的臨床前的安全性研究。本研究重點關注呼吸道高暴露以及藥物成分在肺部滯留導致的安全性風險，包括霧化吸入給藥黏膜刺激、過敏、重復給藥對呼吸道帶來的損害以及藥物成分在肺部的滯留。

藥物在肺部沉積的量和沉積部位是影響藥物的安全性和有效性的重要因素，而粒徑的大小是關鍵，粒徑大小和分布影響著吸入制劑氣溶膠在呼吸道不同部位的沉積量，只有具有足夠小的空氣動力學粒徑的藥物氣溶膠才可能隨著吸氣進入肺部，才能充分暴露因霧化給藥帶來的風險。在毒理學實驗中，推薦的氣溶膠顆粒MMAD數值應為1～4 μm，而幾何標準差應為1.5～3.0[12]。本研究對霧化粒徑進行檢測，其MMAD符合相關要求。實驗采用口鼻暴露系統對動物進行霧化給藥，考慮到藥物的濃度不同，藥物霧化產生的粒徑大小、分布以及遞送速率和遞送總量等霧化特性參數也會產生變化，因而在實驗中不同的劑量是以霧化吸入不同的給藥時間區分，低、中、高劑量連續給藥時間分別為30、60、120 min。藥物的毒性與其吸入后藥物的沉積量密切相關，目前對吸入藥物的沉積測定體內技術包括以放射性同位素標記氣霧粒子采用γ閃爍掃描法、單光子發射計算機斷層成像、正電子發射計算機斷層成像等影像技術和藥物動力學體內方法和采用模擬支氣管樹觀察粒子在不同部位的沉積的體外方法[13-16]。根據動物肺活量、霧化氣溶膠濃度、給藥時間計算出吸入量，以此作為毒性的給藥劑量，計算所得低、中、高劑量分別為0.14、0.27、0.54 mL/kg，該劑量包括吸入沉積在口咽的量以及隨著呼吸呼出的量，文獻報道藥物沉積量是吸入量的5%～30%[17]。

重復給藥一般狀況結果顯示未見藥物全身暴露導致的明顯毒性反應，呼吸系統是藥物的主要靶器官，因此對于呼吸系統的組織病理學檢查要求的更為細致，需要對口鼻到肺部整個系統不同切面進行病理檢查，結果顯示，陰性對照組和受試物各劑量組所有受試動物肺、氣管、鼻黏膜、口腔黏膜及咽部均未見明顯病理性改變，其他臟器系統也未見明顯異常，亦未出現豚鼠全身過敏反應。

中藥霧化吸入藥液由于其是多成分的復雜體系，其成分吸入后的代謝清除往往不清楚，其藥物成分在肺部滯留可能帶來的安全性的風險是關注的焦點。本研究通過檢測熱毒寧注射液吸入后不同時間點藥物成分在肺臟中的濃度來探討藥物在肺部的滯留情況。熱毒寧注射液成分主要包括環烯醚萜類、木脂素類、香豆素類、倍半萜類、黃酮類、咖啡酰奎寧酸類、酚酸類和單萜類等多種成分[18-19]，以及一些微量物質如莫諾香、獐牙菜香[20]。熱毒寧注射液化學成分除了來源于其組成藥材中的成分外[21]還發現其在制備過程中產生了新的化合物[22]。目前已經從熱毒寧注射液中分離和鑒定了100種成分。本研究首先選擇了熱毒寧注射液中的梔子苷、綠原酸、新綠原酸及隱綠原酸4種質控成分在肺組織的清除情況開展了重點研究，其次，根據文獻資料及通過MRM-IDA-EPI方法從熱毒寧注射液中鑒定出的27種成分作為補充研究，從而更全面地評價熱毒寧注射液霧化吸入給藥后藥物成分從肺組織中消除的情況。本研究結果顯示連續給藥7 d，停藥恢復14 d后，4種指標成分和其他27種藥物成分均能夠從肺中清除。

在吸入毒理的評價方面，中藥制劑與單一化藥成分有一致的部分，如在實驗方案的總體設計、動物選擇、實驗的技術和方法以及指標評價等，但中藥因為多成分復雜體系也有其特殊的地方，如何進行毒性評價需要進一步探討。本研究為熱毒寧注射液吸入制劑的臨床應用提供依據和基礎，同時也為中藥吸入給藥的安全性研究進行有益的探索。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Safety study of Reduning Injection after atomization inhalation administration

ZHANG Tengzhi1,SONG Ling1,TANG Liming2, HOU Hongping1,GU Shuyi2, GAO Yunhang1,HANG Ai2,LI Han1,PENG Bo1,CHEN Weiya1,CHEN Tengfei1,ZHANG Guangping1

1. Institute of Chinese Materia Medica China Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing 100700, China 2. Department of Pharmacology and Toxicology of Shanghai Institute for Food and Drug Control,Shanghai 201112, China

To carry out a study on the possible safety risks after the administration of Reduning Injection (熱毒寧注射液) by atomization inhalation, to provide a basis for the clinical application of Reduning Injection by atomization inhalation, and to explore the methods of preclinical safety evaluation of traditional Chinese medicine nebulized inhalation preparations.Toxicity tests for single-dose administration and repeated-dose administration for 30 d of Reduning Injection by nebulized inhalation in rats, and mucosal irritation in rats (observed with repeated administration) and active systemic anaphylaxis in guinea pigs were carried out under GLP conditions. The 31 components detected by the compositional analysis of Reduning Injection were examined in the lungs by stopping the drug for 1, 7, 14 d after seven consecutive days of administration.Rats were exposed orally and nasally 120 min/time, 2 times/d, and animals did not show obvious abnormalities; Reduning Injection low-, medium-, high-dose (30, 60, 120 min/d) groups of rats orally and nasally inhalation repeated administration of 30 d and recovery period of 14 d of toxicity test on the hematology, blood biochemistry, lung coefficients, urine, histopathology did not in the drug-related pathology, the mucous membranes of the respiratory tract did not see the irritation. The active systemic anaphylaxis in guinea pigs was negative. All 31 components analyzed for Reduning Injection were either undetectable or below the detection line after 14 d of withdrawal.The nebulized inhalation administration of Reduning Injection did not cause irritation and sensitization to the respiratory mucosa, and no obvious toxic reaction was observed in rats exposed orally and nasally for one month, and all the 31 components determined were able to be metabolized in the lungs without any deposition.

Reduning Injection; atomization inhalation; safety; lung deposition; geniposide;neochlorogenic acid;chlorogenic acid;cryptochlorogenic acid

R285.53

A

0253 - 2670(2024)09 - 3015 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2024.09.016

2023-12-04

中國中醫科學院科技創新工程重大攻關項目（CI2021A04615）；國家自然科學基金青年項目（82204740）；中國中醫科學院中藥研究所中藥藥理創新團隊項目（CI2021B015）；中央級公益性科研院所基本科研業務費專項（ZXKT22045）；中國中醫科學院科技創新工程課題（CI2023E001TS12）

張騰之（2001—），女，碩士研究生，主要從事中藥藥理研究。E-mail: ztz0113@163.com

宋 玲（1987—）女，助理研究員，主要從事中藥藥理研究。E-mail: lsong@icmm.ac.cn

通信作者：陳騰飛（1986—），男，副研究員，主要從事中藥藥動學研究。E-mail: flychen04@126.com

張廣平（1975—），男，研究員，博士生導師，主要從事中藥藥理毒理研究。E-mail: iamzgp@163.com

[責任編輯 李亞楠]