多組學分析揭示潰瘍性結腸炎緩解期脾虛濕困證與活動期濕熱阻滯證間的潛在分子機制及靶向中藥預測

黎祖鳴，封杰妮，陳雪如，陳劍坤，盧 月，李際強，馮 艷

多組學分析揭示潰瘍性結腸炎緩解期脾虛濕困證與活動期濕熱阻滯證間的潛在分子機制及靶向中藥預測

黎祖鳴1，封杰妮1，陳雪如1，陳劍坤2，盧 月2，李際強2*，馮 艷2*

1. 廣州中醫藥大學第二臨床醫學院，廣東 廣州 510405 2. 廣州中醫藥大學第二附屬醫院（廣東省中醫院），廣東 廣州 510006

綜合分析潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）相關scRNA-seq和RNA-seq數據集，探討UC緩解期脾虛濕困證與活動期濕熱阻滯證間的潛在分子機制，并挖掘潛在干預中藥。運用差異基因表達分析和韋恩圖鑒定出UC緩解期脾虛濕困證和活動期濕熱阻滯證相關基因及兩者間的對話基因。通過京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）、基因集變異分析（gene set variation analysis，GSVA）及Spearman相關性分析深入探討對話基因參與的生物過程及潛在功能。通過單細胞轉錄組分析探討UC緩解期與活動期的差異情況及對話基因在其中的作用。基于循環算法構建UC緩解期脾虛濕困證向活動期濕熱阻滯證發生發展的風險預測模型。運用外部數據集、動物實驗與實時定量聚合酶鏈反應（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR）進一步驗證對話基因的表達情況。借助SoFDA數據庫構建“基因-中醫癥狀/現代醫學癥狀”網絡；借助TCMIP和COREMINE數據庫預測對話基因的潛在靶向中藥。鑒定出31個UC緩解期脾虛濕困證相關基因，其主要富集在代謝相關途徑；鑒定出160個UC活動期濕熱阻滯證相關基因，其主要富集在炎癥免疫相關途徑。鑒定出22個UC緩解期脾虛濕困證與活動期濕熱阻滯證之間的對話基因，上調對話基因與炎癥免疫相關途徑呈顯著相關性，下調對話基因與代謝途徑呈顯著相關性。單細胞轉錄組分析顯示，相比于正常對照及UC緩解期，UC活動期中B細胞占比上調；B細胞在UC活動期濕熱阻滯證中作用貢獻較大，而在UC緩解期脾虛濕困證中的作用貢獻較小；UC活動期B細胞的受體信號通路活性明顯高于UC緩解期；上調的對話基因CD55在B細胞中表達水平較高，CD55+B細胞與CD55?B細胞之間存在差異的細胞通訊及細胞代謝水平。6個風險預測基因（、、、、、）可以較為準確預測UC緩解期脾虛濕困證向UC活動期濕熱阻滯證發展，動物實驗及RT-PCR驗證了其表達水平。通過數據庫檢索得到人參、黃芪、枸杞子等45味潛在靶向中藥。鑒定出22個關鍵對話基因，它們可能通過影響炎癥免疫和代謝相關途徑誘導UC緩解期脾虛濕困證向UC活動期濕熱阻滯證發展。B細胞在UC緩解期脾虛濕困證向活動期濕熱阻滯證發生發展過程中發揮重要作用。CD55可能通過影響炎癥免疫和代謝相關途徑，促進B細胞活性，從而促進UC緩解期脾虛濕困證向活動期濕熱阻滯證發展。22個關鍵對話基因與UC相關中醫癥狀和現代醫學癥狀關聯密切。

潰瘍性結腸炎；單細胞轉錄組；轉錄組；緩解期；脾虛濕困證；活動期；濕熱阻滯證；人參；黃芪；枸杞子

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種影響直腸和結腸的終身炎癥性疾病。2023年，全球UC的患病人數估計為500萬例，且發病率呈上升趨勢[1]。UC是炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）的2種類型之一，其特點是從直腸到近端結腸的慢性炎癥，該病病程纏綿，活動期與緩解期常交替出現，活動期以腹痛腹瀉、黏液膿血便為主要臨床表現[2]。祖國醫學認為，UC屬于“泄瀉”“痢疾”和“腹痛”等范疇，脾虛濕困證和濕熱阻滯證是UC的兩大基本病因病機[3]，UC緩解期以脾虛濕困證為主[4]，在脾胃虛弱濕邪內蘊的基礎上會產生諸多變證[3]。UC活動期以濕熱阻滯證為主，大腸濕熱易導致血瘀腸絡，最后累及脾陽腎陽[3,5]。雖然這些理論已經過臨床實踐檢驗，但UC緩解期脾虛濕困證向UC活動期濕熱阻滯證的發生發展機制尚不清楚，證候作為中醫理論的核心，其生物學基礎不清、病證關聯機制不明是制約中醫藥現代化發展的一大瓶頸[6]。

采用現代技術闡述中醫證候病理機制，有助于中醫藥科學內涵的闡釋。轉錄組測序（transcriptome，RNA-seq）是在總體水平上研究細胞中所有基因的轉錄調節，是基因組遺傳信息和生物功能之間的重要橋梁[7]，其有利于解釋疾病發展過程中某一階段病理概括的發生發展機制[8]。單細胞轉錄組測序（single cell transcriptome sequencing，scRNA-seq）已經成為一種研究單細胞分辨率的復雜生物系統的強大技術，其出現使得在單細胞水平上對特定細胞群進行分析成為可能[9]。單細胞測序用于中醫辨證分型的研究，不僅能闡釋其科學性，還能使其更加規范化與標準化[10]。因此，借助現代科技手段深入研究UC緩解期脾虛濕困證向活動期濕熱阻滯證的發生發展，了解其潛在分子機制，對于發現新的UC臨床治療方案具有重要意義。

為探討UC緩解期脾虛濕困證與活動期濕熱阻滯證之間的潛在關聯機制，本研究綜合分析了UC相關RNA-seq和scRNA-seq數據，以期找到UC緩解期脾虛濕困證向活動期濕熱阻滯證發生發展過程中的關鍵分子，并對這些分子在疾病進程中的作用進行深入探討，同時關聯了核心基因相關的中醫癥狀和現代醫學癥狀，并且得到其潛在靶向中藥，為UC的臨床治療和中藥新藥開發提供新思路。

1 資料與方法

1.1 數據來源與處理

從基因表達綜合數據庫（https://www.ncbi. nlm.nih.gov/geo/）下載了3個UC相關RNA-seq數據集GSE75214[11]、GSE53306[12]和GSE38713[13]。GSE75214包括74個UC活動期樣本、23個UC緩解期樣本和11個正常對照樣本；GSE53306包括16個UC活動期樣本、12個UC緩解期樣本和12個正常對照樣本；GSE38713包括15個UC活動期樣本、15個UC緩解期樣本和13個正常對照樣本。其中，GSE75214作為訓練集，GSE53306和GSE38713作為驗證集。另外，檢索得到UC相關scRNA-seq數據集GSE231993[14]，該數據集包含4個UC患者炎癥反應活躍處的腸黏膜樣本、4個上述UC患者其自身非炎癥反應活躍處的腸黏膜樣本和4個正常對照的腸黏膜樣本，將炎癥反應活躍處的腸黏膜樣本作為活動期樣本、非炎癥反應活躍處的腸黏膜樣本作為緩解期樣本進行后續分析。使用R 4.2.1中的“Seurat”[15]R包對GSE231993進行處理，使用CreateSeuratObject創建seurat對象，檢測到200＜基因＜4 000且線粒體基因＜20%的細胞被保留用于后續分析。為了可視化和統計分析scRNA-seq數據集，該研究測試了26個主成分并將其用于均勻流形逼近和投影圖（uniform manifold approximation and projection，UMAP）分析。使用聚類分辨率為0.5的FindNeighbors和FindClusters函數進行細胞簇聚類分析。通過“singleR”包及人工校正的方式對細胞簇進行注釋。

1.2 UC緩解期脾虛濕困證與UC活動期濕熱阻滯證之間潛在共享基因的鑒定

使用“limma”[16]R包對UC緩解期與正常對照樣本進行差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs）分析，UC緩解期DEGs篩選標準為＜0.05和|log2FC|＞0.585。同理得到UC活動期DEGs。通過中醫證候本體及多維定量關聯計算平臺（SoFDA，http://www.tcmip.cn/Syndrome/front/#/）[17]分別搜集脾虛濕困證和濕熱阻滯證的主次癥狀相關基因集，共獲得脾虛濕困證相關基因558個和濕熱阻滯證相關基因608個。SoFDA是一個中醫證候本體論、證候分類工具以及與疾病相關的特征關聯的數據庫，可用于研究病理聯系和治療機制[17]。將UC緩解期DEGs與脾虛濕困證相關基因取交集得到UC緩解期脾虛濕困證相關基因；將UC活動期DEGs與濕熱阻滯證相關基因取交集得到UC活動期濕熱阻滯證相關基因。將UC緩解期脾虛濕困證相關基因與UC活動期濕熱阻滯證相關基因取交集，得到UC緩解期脾虛濕困證與UC活動期濕熱阻滯證之間潛在共享基因（以下稱“對話基因”）。

1.3 功能富集分析

為進一步探討UC緩解期脾虛濕困證相關基因和UC活動期濕熱阻滯證相關基因的功能，分別對其進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析，校正后＜0.05被認為具有顯著性。基因集變異分析（gene set variation analysis，GSVA）是一種非參數和非線性的算法，可用于評估基因表達微陣列中的富集數據。基于GSVA包，使用GSVA定量通路和生物學過程的活性[18]，并比較UC活動期、UC緩解期和正常對照樣本之間的通路活性。為進一步理解UC緩解期脾虛濕困證與UC活動期濕熱阻滯證之間的潛在發展機制，將對話基因與差異通路活性評分進行Spearman相關性分析。

1.4 UC緩解期/活動期各類型細胞對脾虛濕困證/濕熱阻滯證表型的作用活性評分

利用“Seurat”包中的“AddModuleScore”功能定量每個細胞中特定基因組的活性[19]。基于UC緩解期脾虛濕困證相關基因，對UC緩解期中的每個細胞進行打分并比較各類細胞對UC緩解期脾虛濕困證的作用貢獻；相同的方法用于分析UC活動期中各類細胞對UC活動期濕熱阻滯證的作用貢獻。

1.5 CD55+B細胞和CD55?B細胞的細胞通訊及細胞代謝分析

使用“CellChat”[20]包分別在UC緩解期和UC活動期樣本中進行細胞通訊分析，比較CD55+B細胞和CD55?B細胞與其他微環境細胞之間的串擾，使用CellChatDB.huma作為配體-受體相互作用參考數據庫。＜0.05被認為細胞-細胞相互作用具有統計學意義。計算簇中平均受體表達水平和相互作用簇中平均配體表達水平，使用點圖來說明配體-受體相互作用的平均值之間的差異。同時，在單細胞水平上使用“scMetabolism”包[21]評估細胞的代謝特征。“scMetabolism”包可在單細胞水平量化代謝，該包以常規單細胞矩陣文件為基礎，采用VISION算法對每個細胞進行評分，從而得到細胞在每條代謝通路中的活性得分[21]。

1.6 外部數據集驗證

基于2個外部數據集GSE53306和GSE38713驗證對話基因在UC活動期、UC緩解期和正常對照樣本之間的表達水平，使用箱圖和小提琴圖實現可視化。

1.7 UC緩解期脾虛濕困證向活動期濕熱阻滯證發展的風險預測模型的構建及驗證

綜合上述分析，最后基于對話基因進行循環算法分析，以確定最佳的UC緩解期脾虛濕困證向活動期濕熱阻滯證發展的風險預測模型[22-23]。在每個循環中，從16個特征基因中隨機選擇15個基因的組合。然后，使用“Cancerclass”[24]R包來估計合并數據集中的曲線下面積（area under curve，AUC），并檢查每種組合的預測準確度。在16種組合中，將具有最高AUC（genelistmax AUC）的基因組合進行篩選并應用于下一個周期。重復該循環，直到剩下不超過3種不同的基因組合。最后，選擇所有循環中AUC值最高且值最顯著的基因組來構建預測模型，其中GSE75214作為訓練集，GSE53306和GSE38713作為驗證集。

1.8 風險預測基因在UC與正常組織中的表達情況分析

1.8.1 儀器與試劑 衰變加速因子（decay-accelerating factor，CD55）、神經內分泌轉化酶1（neuroendocrine convertase 1，PCSK1）、血漿蛋白酶C1抑制劑（plasma protease C1 inhibitor，SERPING1）、乙酰輔酶A乙酰轉移酶1（acetyl-CoA acetyltransferase 1，ACAT1）、溶質載體系列26成員2（solute carrier family 26 member 2，SLC26A2）、3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶2（3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase 2，HMGCS2）PCR引物由美國Invitrogen公司設計合成；葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium salt，DSS）購自美國MP Biomedical公司（批號S8634）。電泳儀及電泳槽（Bio-rad公司）；RNA抽提試劑盒、反轉錄試劑盒（日本Takara公司）；PCR擴增儀（美國Applied Biosystems公司）。

1.8.2 動物模型制備 10只SPF級雄性C57BL/6小鼠，6～8周齡，體質量（20±2）g，購自北京維通利華有限公司，實驗動物生產許可證號SCXK（京）2021-0006。飼養環境濕度保持在（55±2）%，12 h黑夜和12 h白天循環。動物實驗均按廣州中醫藥大學中藥學院實驗動物倫理委員會批準方案進行，動物實驗倫理批號ZYD-2023-153。小鼠適應性飼養1周后，將10只小鼠隨機分為正常組與模型組，每組5只。模型組連續7 d自由飲用3% DSS制備UC模型，正常組予正常飲用水。

1.8.3 實時定量聚合酶鏈反應（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR）分析 RT-PCR檢測風險預測基因在模型組結腸黏膜組織與正常組結腸黏膜組織中的表達水平。使用TRIzol試劑提取總RNA進行逆轉錄；使用TBgreen（RR420）染料按照10 μL體系進行循環擴增，引物序列見表1。通過2???Ct方法測定基因相對表達量，數據標準化以3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，）為管家基因。

1.9 “基因-中醫癥狀/現代醫學癥狀”和“基因-中藥”關聯網絡的構建

將對話基因導入SoFDA平臺[17]，對其相關中醫癥狀與現代醫學癥狀進行富集分析，以挖掘其對應的UC相關中醫癥狀及現代醫學癥狀。通過中醫藥整合藥理學研究平臺v2.0（TCMIP，http://www.tcmip. cn/TCMIP/index.php/Home/）[25]尋找靶向對話基因的中藥。由于CD55在TCMIP數據庫中沒有找到靶向中藥，故在COREMINE數據庫（https://www. coremine.com/）中預測相關靶向中藥，＜0.05作為篩選標準。使用Cytoscape軟件構建“基因-中醫癥狀/現代醫學癥狀”和“基因-中藥”關聯網絡。

表1 基因引物序列

1.10 統計學分析

采用GraphPad Prism 9.0軟件進行數據分析，兩組間比較采用檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，＜0.05被認為具有統計學差異。

2 結果

2.1 UC緩解期脾虛濕困證相關基因和UC活動期濕熱阻滯證相關基因的鑒定及功能富集分析

共鑒定出UC緩解期DEGs 582個，其中上調基因289個，下調基因293個，見圖1-A。將UC緩解期DEGs與脾虛濕困證相關基因取交集得到31個UC緩解期脾虛濕困證相關基因，見圖1-C。共鑒定出UC活動期DEGs 2 780個，其中上調基因1 557個，下調基因1 223，見圖1-B。將UC活動期DEGs與濕熱阻滯證相關基因取交集得到160個UC活動期濕熱阻滯證相關基因，見圖1-D。KEGG富集分析顯示，UC緩解期脾虛濕困證相關基因主要富集在代謝相關通路，包括過氧化物酶體增殖物活化受體（peroxisome proliferator activates receptor，PPAR）信號通路，脂肪酸降解，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解，脂肪酸代謝，萜類骨架生物合成、丁酸代謝等，見圖1-E；UC活動期濕熱阻滯證相關基因主要富集在免疫相關通路，包括炎性腸病、輔助性T細胞1型（T helper cell 1，Th1）和Th2細胞分化、Th17細胞分化、原發性免疫缺陷、磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol-3-hydroxy kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號通路、核轉錄因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）信號通路、細胞因子-細胞因子受體相互作用和腸道免疫網絡等，見圖1-F。

2.2 UC緩解期脾虛濕困證與UC活動期濕熱阻滯證之間潛在對話基因的鑒定及功能相關性分析

將31個UC緩解期脾虛濕困證相關基因與160個UC活動期濕熱阻滯證相關基因取交集，得到22個兩者潛在對話基因，其中11個上調對話基因和11個下調對話基因，見圖2，差異表達情況見表2。GSVA結果顯示，相比于正常對照和UC緩解期，代謝相關通路在UC活動期中明顯下調，包括甘油脂代謝，花生四烯酸酸代謝，甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸代謝和組氨酸代謝等，見圖3-A；相比于正常對照和UC緩解期，炎癥免疫相關通路在UC活動期中明顯上調，包括B細胞受體信號通路、系統性狼瘡紅斑、自身免疫甲狀腺疾病、利什曼感染、趨化因子信號通路和抗原處理和呈現等，見圖3-B。Spearman相關性分析顯示，、白細胞介素7受體（interleukin 7 receptor，）和補體成分4A（complement component 4A，）等上調基因與炎癥免疫相關通路呈顯著正相關，見圖4-A；ATP結合盒亞家族B成員11（ATP binding cassette subfamily B member 11，ABCB11）、酰基輔酶A脫氫酶中鏈（acyl-CoA dehydrogenase medium chain，ACADM）和肉毒堿棕櫚酰轉移酶1A（carnitine palmitoyl-transferase 1A，CPT1A）等下調基因與代謝相關通路呈顯著正相關，見圖4-B。

2.3 B細胞可能是UC緩解期脾虛濕困證向UC活動期濕熱阻滯證發展的關鍵免疫細胞

分析來自GSE231993數據集的單細胞測序樣本，通過質量控制排除低質量線粒體細胞后，選擇45 579個細胞用于后續分析。通過UMAP算法對細胞進行聚類得到26個細胞簇。進一步通過“singleR”包及人工注釋將26個細胞簇分為8種細胞類型：B細胞、T細胞、巨噬細胞、上皮細胞、內皮細胞、平滑肌細胞、成纖維細胞和肥大細胞，見圖5-A。細胞類型占比分析顯示，相比于正常對照及UC緩解期，UC活動期中B細胞占比上調，見圖5-B。為探討UC緩解期各類型細胞對脾虛濕困證表型的作用活性，基于31個UC緩解期脾虛濕困證相關基因，使用“Seurat”包的AddModuleScore功能對UC緩解期中的每個細胞進行評分并對各類型細胞進行比較，結果顯示B細胞、T細胞和肥大細胞的得分較低，上皮細胞、內皮細胞、成纖維細胞、巨噬細胞和平滑肌細胞的得分較高；同理，基于160個UC活動期濕熱阻滯證相關基因，對UC活動期中每個細胞進行評分并對各類型細胞進行比較，結果顯示B細胞和巨噬細胞的得分較高，而其他細胞的得分較低，見圖6。進一步比較了B細胞受體信號通路活性在UC緩解期B細胞和UC活動期B細胞的差異，結果顯示UC活動期B細胞的受體信號通路活性明顯高于UC緩解期，見圖7。因此，推測B細胞可能在UC緩解期脾虛濕困證向UC活動期濕熱阻滯證發展過程中發揮重要作用。

A-UC緩解期vs正常對照火山圖；B-UC活動期vs正常對照火山圖；C-UC緩解期脾虛濕困證相關基因的鑒定；D-UC活動期濕熱阻滯證相關基因的鑒定；E-UC緩解期脾虛濕困證相關基因的KEGG富集分析；F-UC活動期濕熱阻滯證相關基因的KEGG富集分析。

圖2 對話基因的鑒定

A-相對于正常對照組，UC緩解期與UC活動期上調的通路；B-相對于正常對照組，UC緩解期與UC活動期下調的通路。

2.4 CD55+B細胞和CD55?細胞的細胞通訊及細胞代謝分析

在單細胞數據中，分析了11個上調對話基因在各類型細胞的表達水平，發現CD55在B細胞中高表達，見圖8-A。接著，分別在UC緩解期和UC活動期單細胞樣本中對CD55+B細胞和CD55?B細胞進行了細胞通訊及細胞代謝分析。細胞通訊結果顯示，在UC緩解期樣本中，CD55+B細胞和CD55?B細胞的細胞通訊較為一致，見圖8-B；而在UC活動期樣本中，相比于CD55?B細胞，CD55+B細胞在免疫細胞微環境中與其他類型細胞的交互通訊更為密切且強度更大，見圖8-C。細胞代謝結果顯示，UC活動期中的B細胞代謝相關途徑活性明顯高于UC緩解期，且在UC緩解期和活動期中，CD55+B細胞代謝相關途徑活性明顯高于CD55?B細胞，見圖9。由此，推測CD55可能通過影響代謝相關途徑，促進B細胞活性，從而促進UC緩解期脾虛濕困證向活動期濕熱阻滯證發展。

圖4 11個上調對話基因與炎癥免疫相關通路活性(A) 和11個下調對話基因與代謝相關通路活性(B) 的相關性分析

圖5 UC活動期、UC緩解期和正常對照樣本之間所有細胞數據的UMAP散點圖(A) 和細胞亞群占比圖(B)

圖6 不同類型細胞對UC緩解期脾虛濕困證和UC活動期濕熱阻滯證表型的作用活性評分及比較

圖7 UC活動期與UC緩解期之間B細胞受體信號通路活性的比較

2.5 外部數據集驗證

基于2個外部數據集GSE53306和GSE38713驗證了22個對話基因，發現除了窖蛋白-1（caveolin 1，）、細絲蛋白A（filamin A，）、、原癌基因蛋白（MYC proto-oncogene, BHLH transcription factor，）以外，其他基因的表達水平均與訓練集一致：相對于正常對照，在UC緩解期和活動期中、、、、、轉錄因子4（transcription factor 4,）、絲氨酸肽酶抑制劑Kazal 1型（serine peptidase inhibitor kazal type 1，）、線粒體RNA加工的RNA組分核糖核酸內切酶（RNA component of mitochondrial RNA processing endoribonuclease，）存在不同程度的上調趨勢，而、、琥珀酰輔酶A: 戊二酸輔酶A轉移酶（succinyl-CoA: glutarate-CoA transferase，）、、電子轉移黃素蛋白脫氫酶（electron transfer flavoprotein dehydrogenase，）、細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑2B（cyclin dependent kinase inhibitor 2B，）、3β-羥基-δ5-類固醇脫氫酶2型（3β-hydroxy-δ5-steroid dehydrogenase type 2，）、溶質載體家族22成員5（solute carrier family 22 member 5，）、和存在不同程度的下調趨勢，見圖10、11。

圖8 11個上調潛在對話基因在不同類型細胞的表達水平(A) 及UC緩解期(B) 和UC活動期(C) 中CD55+B細胞和CD55?B細胞的細胞通訊分析

圖9 UC緩解期(A) 和UC活動期(B) 中CD55+B細胞和CD55?B細胞的細胞代謝分析

2.6 UC緩解期脾虛濕困證向UC活動期濕熱阻滯證發展的風險預測模型的構建

綜合上述分析，對16個UC緩解期脾虛濕困證與UC活動期濕熱阻滯證之間潛在關鍵對話基因（、、、、、、、、、、、、、、、）進行循環算法分析，以確定最佳的預測模型，循環算法流程見圖12-A。納入循環算法構建風險預測模型的基因是訓練數據集與驗證數據集共有的基因，且這些基因經過訓練數據集與驗證數據集的驗證，在UC活動期樣本中均存在上調/下調趨勢。在GSE75214中，6個基因（、、、、、）的組合呈現AUC峰值，見圖12-B。6個基因的組合可以較為準確預測UC緩解期脾虛濕困證向UC活動期濕熱阻滯證發展，AUC為0.99，95% CI：0.98～1.00，＝1.4×10?6，見圖12-C。在GSE53306中6個基因的組合AUC為0.78，95% CI：0.69～0.86，＝0.11，見圖12-D。在GSE38713中6個基因的組合AUC為0.99，95% CI：0.96～1.00，＝0.003 8，見圖12-E。

*P?＜?0.05 **P?＜?0.01 ***P?＜??0.001

圖11 基于GSE38713數據集驗證22個對話基因的表達水平

A-循環算法流程；B-條形圖，顯示基因組合的AUC，每個循環的最大AUC（不同的基因數目組合）；C～E-6基因組合對于預測UC緩解期脾虛濕困證向UC活動期濕熱阻滯證發展具有較高的預測性能。

2.7 風險預測基因在UC和正常對照組織中的表達驗證

對疾病組與正常組的結腸組織進行HE染色以確保模型復刻成功。由結腸病理圖所示，正常組小鼠的結腸結構完整，腸腺整齊排列，上皮細胞之間緊密相連。與正常組比較，模型組小鼠結腸出現明顯潰瘍，結腸上皮細胞大量脫落，腺體排列紊亂，黏膜層和黏膜下層有大量炎性細胞浸潤，見圖13。RT-PCR結果顯示，、、在UC組織中表達顯著升高（＜0.05），、、在UC組織中表達顯著降低（＜0.05），見圖14。6個風險預測基因與上述分析結果一致。

2.8 “基因-中醫癥狀/現代醫學癥狀”和“基因-中藥”關聯網絡的構建

22個對話基因與5個UC相關中醫癥狀和5個UC相關現代醫學癥狀密切相關，見圖15、16。通過TCMIP和COREMINE數據庫共獲得人參、黃芪、枸杞子等45味中藥，靶向8個UC緩解期脾虛濕困證與UC活動期濕熱阻滯證之間潛在對話基因，見圖17。

3 討論

3.1 代謝和炎癥免疫相關途徑在UC緩解期脾虛濕困證向活動期濕熱阻滯證發生發展過程發揮重要作用

KEGG富集分析顯示，UC緩解期脾虛濕困證相關基因主要富集在脂肪酸降解，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解，脂肪酸代謝，萜類骨架生物合成，丁酸代謝等代謝相關途徑。Wu等[26]研究發現，IBD脾虛證與IBD濕熱證之間存在多種顯著血漿差異代謝物，包括甘油磷脂、脂肪酰基和宿主共生腸道菌群氨基酸等。前期研究表明，脂質代謝物在IBD炎癥過程中起著關鍵作用[27]。氨基酸是幾乎所有類型細胞的基本代謝產物，在維持腸道健康方面發揮著重要作用。在IBD患者中，氨基酸在腸道屏障和抗炎細胞因子產生中具有突出的地位，它們還與緊密連接蛋白、氧化應激、腸上皮細胞凋亡和消化道炎癥中產生的促炎細胞因子有關[28]。UC活動期濕熱阻滯證相關基因主要富集在炎性腸病、Th1和Th2細胞分化、Th17細胞分化、細胞因子-細胞因子受體相互作用和腸道免疫網絡等炎癥免疫相關途徑。UC起源于宿主黏膜免疫和腸道細菌菌群之間平衡的破壞，導致對共生非致病菌的異常免疫反應[1]。與健康對照組相比，IBD患者的腸黏膜和固有層中含有更高水平的Th17細胞、IL-17和IL-23。在UC模型小鼠中，IL-17A和IL-17F的缺陷顯示對結腸炎具有保護作用[29]。CD4+T細胞和自然殺傷T細胞可促進Th2相關細胞因子和Th17相關促炎細胞因子的釋放，加重UC腸道炎癥反應[1]。越來越多的證據表明細胞因子及趨化因子信號在UC中的作用[30]。脾虛濕困證是指脾氣不足、運化失健、聚濕生痰、濕濁內蘊導致的一系列證候，濕郁日久易化熱，濕邪和熱邪相互交織，導致身體內濕與熱同時存在，并形成阻滯的一種病理狀態。炎癥反應是指身體對外部刺激或病原體進行防御反應的過程。一方面，濕邪和熱邪都會刺激身體內的免疫系統，導致炎癥反應的發生；另一方面，濕熱阻滯證可能會影響身體內部的代謝過程，導致身體內部的炎癥反應加劇。

*P?＜?0.05 **P?＜?0.01 ***P?＜0.001 ****P＜0.000 1

圖15 “基因-中醫癥狀”關聯網絡

圖16 “基因-現代醫學癥狀”關聯網絡

圖17 “基因-中藥”關聯網絡

3.2 B細胞在UC緩解期脾虛濕困證向UC活動期濕熱阻滯證發展過程中扮演重要角色

研究發現，B細胞對UC緩解期脾虛濕困證表型的作用貢獻較小，而對UC活動期濕熱阻滯證表型的作用貢獻較大，且UC活動期B細胞受體信號通路活性明顯上調，提示B細胞可能在UC緩解期脾虛濕困證向UC活動期濕熱阻滯證發展過程中發揮重要作用。B細胞在UC炎癥發生期間大幅擴增[31]，成為結腸組織中最主要的免疫細胞類型，是UC腸道炎癥發作和進展相關的適應性免疫疾病的標志[32]。抗原激活記憶B細胞，促使它們向漿細胞分化并產生引發UC發病機制的抗原特異性免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）[33]。B細胞在炎癥性腸病組織愈合中同樣發揮重要作用，活化的B細胞在一定程度上干擾了基質-上皮細胞間的相互作用，不利于腸黏膜的修復過程[31]，B細胞耗竭在炎癥性腸病的黏膜愈合前期具有積極作用。此外，本研究發現上調對話基因，在B細胞中表達水平較高，且與B細胞信號通路活性呈正相關，CD55+B細胞在免疫細胞微環境中與其他類型細胞的交互通訊更為密切且強度更大，CD55+B細胞代謝相關途徑活性明顯高于CD55?B細胞。CD55是保護自身免疫細胞免受補體介導裂解的關鍵分子，作為一種免疫調節分子，在炎癥免疫反應中，CD55可以與免疫細胞表面的受體結合，通過調節細胞內的信號轉導通路來發揮其作用[34-35]。因此，本研究推測CD55在介導B細胞活化過程中發揮重要作用，CD55可能通過影響炎癥免疫和代謝相關途徑，促進B細胞活性，從而促進UC緩解期脾虛濕困證向活動期濕熱阻滯證發展，但仍需通過實驗研究進一步挖掘其潛在機制。

3.3 6個風險預測基因可預測UC緩解期脾虛濕困證向活動期濕熱阻滯證發生發展

本研究使用循環算法以構建更準確的UC緩解期脾虛濕困證向活動期濕熱阻滯證發生發展的預測模型，結果顯示，6個基因（、、、、、）的組合呈現AUC峰值且值最顯著，提示其在疾病發展中的重要意義。既往研究顯示，UC患者疾病活動性糞便、結腸黏膜和外周血白細胞中的表達增加[36-38]，其與黏膜炎癥的嚴重程度密切相關。本研究發現酮體相關限速酶基因和在UC組織中下調，酮體在腸道穩態中發揮重要作用，外源性補充β-羥基丁酸（機體含量最多的酮體）可有效緩解DSS誘導的結腸炎[39]。阻斷UC的“炎-癌”轉化是臨床防治UC的核心問題[40]，綜合前人的研究結果發現，相比于正常組織，在UC和結直腸癌中均明顯上調，高表達的直腸癌患者具有較差的疾病特異性生存期、局部無復發生存期和無轉移生存期[41]；在UC和結直腸癌中均明顯下調[42-43]，低表達與體外結腸癌細胞增殖快速發展有關[44]，同時對于腫瘤細胞在體內組織中遷移也十分重要[42]。在UC組織中顯著上調，目前沒有直接證據表明基因與UC有聯系，但發現其與炎癥免疫相關途徑呈正相關，可能在炎癥反應和免疫調節中發揮重要作用。

3.4 靶向預測的中藥是干預UC緩解期脾虛濕困證向活動期濕熱阻滯證發展的潛在藥物

本研究對22個對話基因進行了靶向中藥預測，其中人參、黃芪、枳殼、半夏、枸杞子等中藥在“基因-中藥”調控網絡中的連接度較高。人參-黃芪藥對重在益氣健脾，UC的發病與脾虛關系密切，而脾虛往往與氣虛有關，因此，治療UC需要從補氣、健脾、利濕等方面入手。人參和黃芪的主要成分為皂苷類化合物，其具有抗炎及調節免疫穩態的作用，尤其是對于與腸道炎癥相關的消化系統疾病而言[45]。人參皂苷Rg3可通過抑制NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）炎癥小體激活和調節腸道菌群穩態來改善DSS誘導的結腸炎[46]。黃芪皂苷IV通過重塑Th17/Treg細胞穩態和抗氧化應激有效預防和減輕UC[47]。半夏降逆止嘔、散結除痞，為燥濕化痰之要藥，配伍枳殼理氣寬中、行滯消脹，可有效改善UC氣逆嘔吐、腹脹腹痛等癥狀。研究表明，半夏瀉心湯可通過降低UC患者血清炎癥因子水平、抑制UC模型大鼠細胞焦亡、改善腸道黏膜屏障功能等達到改善UC的作用[45]。枸杞子可減輕腸道杯狀細胞群受損并增強黏液層，枸杞子多糖對氧化應激、炎癥和神經退行性變具有保護作用[48]。

4 結論

本研究通過分析UC相關scRNA-seq和RNA-seq數據初步揭示了UC緩解期脾虛濕困證與活動期濕熱阻滯證之間的潛在分子機制，外部數據集和動物實驗表明關鍵對話基因其具有良好的臨床辨證效能，相關結果有助于提高UC核心證候臨床精準化診斷的水平和證候客觀化研究的深度。通過TCMIP和COREMINE數據庫得到了靶向對話基因的潛在關鍵中藥，后續仍需進一步體內或體外實驗驗證其干預機制。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Revelation of potential molecular mechanism between spleen deficiency and dampness-stagnation syndrome in remission stage and damp-heat stagnation syndrome in active stage of ulcerative colitis based on multiomics analysis and prediction of targeted traditional Chinese medicine

LI Zuming1, FENG Jieni1, CHEN Xueru1, CHEN Jiankun2, LU Yue2, LI Jiqiang2, FENG Yan2

1. The Second Clinical Medical College, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, China 2. The Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine (Guangdong Hospital of Traditional Chinese Medicine), Guangzhou 510006, China

To explore the potential molecular mechanism between spleen deficiency and dampness-stagnation syndrome in remission stage and dampness-heat stagnation syndrome in active stage of ulcerative colitis (UC) by comprehensively analyzing the scRNA-seq and RNA-seq data sets related to UC, and to explore the potential intervention of traditional Chinese medicine (TCM).Differential gene expression analysis and venn diagram analysis were used to identify the related genes of spleen deficiency and dampness-stagnation syndrome in remission stage of UC, dampness-heat stagnation syndrome in active stage of UC and the crosstalk genes between them. Enrichment analysis of Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) and gene set variation analysis(GSVA) and Spearman correlation analysis were used to explore the biological processes involved in crosstalk genes and their potential functions. Based on single-cell transcriptome analysis, we explored the differences between remission and active phases of UC and the role of crosstalk genes in them. Based on the circulation algorithm, a risk prediction model for the occurrence and development of UC from spleen deficiency and dampness-stagnation syndrome in remission stage to dampness-heat stagnation syndrome in active stage was constructed. Extraneous data, animal experiments and real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-PCR) were used to further verify the expression of crosstalk genes. Based on SoFDA database, we constructed “gene-TCM symptom/modern medical symptom” network. Potential target traditional Chinese medicines (TCMs) of crosstalk genes were predicted by TCMIP and COREMINE databases.A total of 31 genes related to spleen deficiency and dampness-stagnation syndrome in remission stage of UC were identified, which were mainly enriched in metabolism-related pathways; A total of 160 genes related to dampness-heat stagnation syndrome in active stage of UC were identified, which were mainly enriched in inflammatory immune-related pathways. A total of 22 crosstalk genes were identified between spleen deficiency and dampness-stagnation syndrome in remission stage and dampness-heat stagnation syndrome in active stage of UC. Upregulating crosstalk genes were significantly correlated with inflammatory immune pathways, and downregulating crosstalk genes were significantly correlated with metabolism-related pathways. Single-cell transcriptome analysis revealed the proportion of B cells in the active phase was upregulated compared to normal controls and remission phases; B cells play a greater role in dampness-heat stagnation syndrome in active stage of UC than that in spleen deficiency and dampness-stagnation syndrome in remission stage. The receptor signaling pathway activity of B cells in UC active stage was significantly higher than that in UC remission stage. CD55, an up-regulated crosstalk gene, was highly expressed in B cells. There were differences in cell-to-cell communication and cellular metabolism between CD55+B cells and CD55?B cells. Six risk predict genes (,,,,,) can accurately predict the development from spleen deficiency and dampness-stagnation syndrome in remission stage to dampness-heat stagnation syndrome in active stage of UC. Animal experiments and RT-PCR confirmed their expression. A total of 45 potential targeted TCMs such as Renshen (et), Huangqi () and Gouqizi () through database retrieval were obtained.This study identified 22 key crosstalk genes, which may induce the development of spleen deficiency and dampness-stagnation syndrome in remission stage to dampness-heat stagnation syndrome in active stage of UC by influencing inflammatory immune and metabolic related pathways. B cells play an important role in the occurrence and development process from spleen deficiency and dampness-stagnation syndrome in remission stage to dampness-heat stagnation syndrome in active stage of UC. CD55 may promote B cell activity by affecting inflammatory immune and metabolic pathway, thus promoting the development of spleen deficiency and dampness-stagnation syndrome in remission stage of UC to dampness-heat stagnation syndrome in active stage. A total of 22 key crosstalk genes are closely related to UC-related Chinese medicine symptoms and modern medical symptoms.

ulcerative colitis; single cell transcriptome; transcriptome; remission stage; spleen deficiency and dampness-stagnation syndrome; active stage; damp-heat stagnation syndrome;et;;

R285

A

0253 - 2670(2024)09 - 3041 - 16

10.7501/j.issn.0253-2670.2024.09.018

2023-12-11

廣州市科技計劃?市校（院）聯合資助基礎與應用基礎研究項目（2023A03J0738）；廣東省中醫院朝陽人才科研專項資助（ZY2022KY10，ZY2022YL04）

黎祖鳴，本科。E-mail: gzylizuming@126.com

通信作者：馮 艷，副主任醫師。E-mail: gonggongshiyongyx@163.com

李際強，主任醫師。E-mail: lijiqiangjizhen@163.com

[責任編輯 潘明佳]