二仙湯抗骨質疏松有效組分的指紋圖譜、多成分含量測定及其鎮痛和調節骨代謝作用研究

劉 燕，劉玉玲，沈 燚，杜金蔓，趙琦明，葉欣園，張泉龍，秦路平，張巧艷

二仙湯抗骨質疏松有效組分的指紋圖譜、多成分含量測定及其鎮痛和調節骨代謝作用研究

劉 燕，劉玉玲，沈 燚，杜金蔓，趙琦明，葉欣園，張泉龍，秦路平*，張巧艷*

浙江中醫藥大學藥學院，浙江 杭州 310053

建立二仙湯抗骨質疏松有效組分的指紋圖譜及多成分含量測定方法，為基于二仙湯的抗骨質疏松組分中藥的研制奠定基礎。HPLC指紋圖譜檢測采用Agilent ZorBax Extend C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈- 0.1%磷酸水溶液（含0.025%十二烷基硫酸鈉），梯度洗脫：0～30 min，4%～30%乙腈；30～50 min，30%～50%乙腈；50～60 min，50%～90%乙腈；體積流量1 mL/min；柱溫25 ℃；檢測波長270 nm。運用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”進行相似度評價；通過對照品比對，對共有峰進行指認。樣品含量測定的梯度洗脫調整為0～25 min，10%～18%乙腈；25～35 min，18%～19%乙腈；35～40 min，19%～25%乙腈；40～50 min，25%～32%乙腈；50～60 min，32%～55%乙腈；并測定8種有效成分的含量。以小鼠醋酸扭體和成骨細胞和破骨細胞為模型評價二仙湯有效組分的鎮痛和對骨代謝的調控作用。建立了二仙湯有效組分的HPLC指紋圖譜，確定了16個共有峰，16批樣品與對照指紋譜比較的相似度均在0.9以上。指認出其中8個共有峰（1、4、10～12、13、15、16號峰），分別為新芒果苷、芒果苷、阿魏酸、仙茅苷、朝藿定B、淫羊藿苷、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿。含量測定的線性關系、重復性、穩定性、精密度及加樣回收率考察符合要求。二仙湯抗骨質疏松有效組分在小鼠醋酸扭體模型上具有顯著的鎮痛作用，并可促進成骨細胞的形成和骨基質礦化，抑制破骨細胞的骨吸收。建立的二仙湯抗骨質疏松有效組分HPLC指紋圖譜及多成分含量測定方法可準確、高效、全面的對其質量進行評價，為其質量控制提供依據。

二仙湯；骨質疏松；指紋圖譜；多成分含量測定；高效液相色譜法；新芒果苷；芒果苷；阿魏酸；仙茅苷；朝藿定B；淫羊藿苷；鹽酸巴馬?。畸}酸小檗堿；鎮痛；質量控制

中藥方劑是中醫臨床用藥的主要形式，是遵循中醫藥理論，將2味或2味以上的中藥飲片配伍而成的，具有多成分、多靶點整合調節人體機能的作用特點，在多因素復雜性疾病的防治中顯示出明顯的優勢[1]。然而，由于中藥材化學成分復雜，方劑的藥效物質和作用機制不清楚，影響中藥療效的穩定發揮和對中藥方劑作用規律的認識，進而阻礙中藥產品質量的提升和中醫藥現代化的進程。因此，闡明中藥方劑發揮作用的有效成分和機制，制備有效組分，研究有效組分的質量控制，對于安全、有效、穩定、可控的新型中藥的創制具有重要意義。

二仙湯是張伯訥教授創制的著名方劑，由淫羊藿、仙茅、知母、黃柏、巴戟天和當歸組成，具有溫腎陽、補腎精、瀉腎火、調理沖任之功效，用于腎陰、腎陽不足而虛火上炎之更年期綜合征、高血壓、腎炎、腎盂腎炎，尿路感染及閉經等病癥[2]。近年研究發現二仙湯具有調節免疫、抗氧化及雌激素樣活性，常用于治療更年期綜合征、骨質疏松癥和卵巢早衰等疾病[3-6]。前期研究發現二仙湯能夠調控去卵巢骨質疏松大鼠的骨代謝，增加骨密度，改善骨組織微結構的退化，顯示出良好的抗骨質疏松作用[7]。進一步以成骨細胞和破骨細胞為模型，篩選其抗骨質疏松的有效成分，發現二仙湯中淫羊藿黃酮、仙茅酚苷、知母黃酮和皂苷、黃柏生物堿、巴戟天蒽醌和環烯醚萜苷及當歸阿魏酸均有顯著的調節成骨細胞和破骨細胞功能的作用。為此，本實驗富集制備了二仙湯抗骨質疏松的有效組分，明確了其在去卵巢骨質疏松大鼠的確切作用。本實驗研究了二仙湯有效組分的指紋圖譜及多成分的含量測定方法，觀察其在醋酸扭體小鼠模型，體外成骨細胞和破骨的作用，為基于二仙湯的抗骨質疏松組分中藥的研制提供科學的依據。

1 儀器、材料和動物

1.1 儀器

Agilent 1100型系列高效液相色譜儀，美國Agilent公司；Bio-Tex ELx 800型全自動定量繪圖酶標儀，美國Fisher公司；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺，蘇州凈化有限公司；MCO-15AC型CO2恒溫培養箱，日本Sanyo生物醫學電器公司；CKX41型倒置相差顯微鏡，日本Olympus公司。

1.2 材料

對照品新芒果苷，批號130715，質量分數≥98%，購于北京北納創聯生物技術研究院；對照品芒果苷，批號MUST-13110201，質量分數≥98%，購于北京恒元啟天化工技術研究院；對照品阿魏酸（批號0773-9910）、仙茅苷（批號110771-201105）、鹽酸巴馬汀（批號110732-200506），質量分數≥98%，均由中國食品藥品鑒定研究院提供；對照品朝藿定B，批號110809，質量分數≥98%，由四川省維克奇生物科技有限公司提供；對照品淫羊藿苷，批號145760，質量分數≥98%，購于南京澤郎醫藥科技有限公司；對照品鹽酸小檗堿，批號20130412，質量分數≥98%，購于大連美侖生物技術有限公司。

二仙湯處方6味中藥飲片，購于上海雷允上藥業有限公司，經浙江中醫藥大學藥學院張巧艷教授鑒定分別為小檗科淫羊藿屬植物淫羊藿Maxim.的干燥葉、石蒜科仙茅屬植物仙茅Gaertn.的干燥根莖、百合科知母屬植物知母Bge.的干燥根莖、蕓香科黃檗屬植物黃皮樹Schneid.的干燥樹皮、茜草科巴戟天屬植物巴戟天How的干燥根和傘形科當歸屬植物當歸(Oliv.) Diels的干燥根。結合資源考證優選藥材產地，最終確定6味藥材的產地如下：淫羊藿為甘肅隴南、仙茅為四川宜賓、知母為河北安國、黃柏為四川滎經、當歸為甘肅岷縣、巴戟天為廣東肇慶。

制備指紋圖譜研究的16批樣品由3批藥材制備而成，其中1～5批樣品由第1批藥材制備而成，6味藥材的批號分別為淫羊藿20180501、仙茅20180502、知母20180503、黃柏20180504、當歸20180505、巴戟天20180506；6～11批樣品由第2批藥材制備而成，6味藥材的批號分別為淫羊藿20180601、仙茅20180602、知母20180603、黃柏20180604、當歸20180605、巴戟天20180606；12～16批樣品由第3批藥材制備而成，6味藥材的批號分別為淫羊藿20180701、仙茅20180702、知母20180703、黃柏20180704、當歸20180705、巴戟天20180706。16批樣品依次編號為S1～S16。

制備3批含量測定樣品的藥材批號分別為淫羊藿20200601、仙茅20200602、知母20200603、黃柏20200604、當歸20200605、巴戟天20200606。所有藥材參照《中國藥典》2020年版進行鑒定，均符合要求。參考本課題組前期研究[8]，制備二仙湯抗骨質疏松有效組分，用于指紋圖譜和主要化學成分的含量測定研究。

UMR-106細胞和RAW264.7細胞購自美國ATCC細胞庫；特級胎牛血清、DMEM培養基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium）為美國Gibco公司產品；RANK-L、M-CSF、考馬斯亮藍G-250和地塞米松均購自美國Sigma公司；乙腈、甲醇，色譜純，國藥集團化學試劑有限公司；水，娃哈哈純凈水，杭州娃哈哈集團有限公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸、甲醛、固藍BB、硝酸銀、硫代硫酸鈉等其他試劑均為國產分析純試劑。

1.3 動物

雌性ICR小鼠50只，購自浙江中醫藥大學實驗動物中心，許可證號SCXK（浙）2020-0061，動物飼養于浙江中醫藥大學實驗動物研究中心，室溫（25±2）℃，相對濕度45%～50%，可自由進食飲水。本研究中所有實驗動物的使用嚴格遵守浙江中醫藥大學倫理規定（批準號：IACUC-20200420-04）。

2 方法與結果

2.1 二仙湯抗骨質疏松有效組分的制備

6味中藥按處方比例混勻，按每克藥材加8 mL 50%乙醇提取3次，每次2 h，濾過，合并濾液，即為粗提液。提取液減壓濃縮到相對密度為1.23 g/mL，濾過，濾液加蒸餾水稀釋到相對密度為1.08 g/mL，即為待上柱純化樣品液。將樣品液按1個樹脂床體積倍數（BV）的上樣量通入裝有ZTC-1大孔樹脂的色譜柱中，依次用水、50%乙醇和95%乙醇洗脫，收集50%乙醇洗脫部分，減壓濃縮成相對密度為1.25 g/mL的浸膏，60 ℃干燥，粉碎，得棕黃色粉末，即為二仙湯抗骨質疏松有效組分。

2.2 二仙湯抗骨質疏松有效組分指紋圖譜研究

2.2.1 色譜條件 Agilent ZorBax Extend C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液（含0.025%十二烷基硫酸鈉），梯度洗脫：0～30 min，4%～30%乙腈；30～50 min，30%～50%乙腈；50～60 min，50%～90%乙腈；進樣量20 μL；體積流量1 mL/min；柱溫25 ℃；檢測波長270 nm。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取新芒果苷16.20 mg、芒果苷10.00 mg、阿魏酸3.50 mg、仙茅苷1.60 mg、朝藿定B 1.25 mg、朝藿定C 3.00 mg、淫羊藿苷3.38 mg，鹽酸小檗堿5.00 mg和鹽酸巴馬汀5.00 mg分別置于5 mL的量瓶中，新芒果苷、鹽酸小檗堿和鹽酸巴馬汀分別用50%甲醇定容，其他均用甲醇定容至刻度，搖勻，分別配制成質量濃度為3.24 mg/mL的新芒果苷、2.00 mg/mL的芒果苷、0.70 mg/mL的阿魏酸、0.32 mg/mL的仙茅苷、0.25 mg/mL的朝藿定B、0.60 mg/mL的朝藿定C、0.675 mg/mL的淫羊藿苷、1.00 mg/mL的鹽酸小檗堿和1.00 mg/mL的鹽酸巴馬汀儲備液，經0.45mm微孔濾膜濾過，備用。

2.2.3 供試品溶液的制備 取二仙湯有效組分約50 mg，精密稱定后置于5 mL量瓶中，加入4%乙腈-0.1%磷酸水溶液（含0.025%十二烷基硫酸鈉）定容，超聲溶解后微孔濾膜濾過，備用。

2.2.4 精密度試驗 取同一份供試品溶液，連續進樣6次，以對照品淫羊藿苷作為參照峰，計算16個主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積，結果16個主要色譜峰相對保留時間的RSD均小于1.0%，相對峰面積的RSD均小于5.0%，各色譜圖的相似度值不低于0.99，表明儀器的精密度良好。

2.2.5 穩定性試驗 取同一份供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h進行檢測，以對照品淫羊藿苷作為參照峰，計算16個主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積，結果16個主要色譜峰相對保留時間的RSD均小于2.0%，相對峰面積的RSD均小于5.0%，各色譜圖的相似度值不低于0.99，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.2.6 重復性試驗 取同一批供試品，按“2.1.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，進行檢測，以對照品淫羊藿苷作為參照峰，計算16個主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積，結果16個主要色譜峰的相對保留時間的RSD均小于1.0%，相對峰面積的RSD均小于5.0%，各色譜圖的相似度值不低于0.99，表明方法的重復性良好。

2.2.7 指紋圖譜的建立、共有峰標記及其歸屬 利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件（2012版）”以S1為參照圖譜，采用平均數法，時間窗寬度0.1 min，經多點校正，生成二仙湯抗骨質疏松有效組分色譜疊加圖及共有模式對照指紋圖譜（圖1）。分析得到16批供試品的色譜峰，按照色譜峰的保留時間從小到大，選取16個峰面積較大的為共有峰。

圖1 16批二仙湯抗骨質疏松有效組分的HPLC指紋圖譜疊加圖及其對照指紋圖譜(R)

通過加入對照品，觀察對應峰面積的變化，指認出8個色譜峰，結合各藥材化學成分研究的文獻資料[9]，確定1號峰為新芒果苷，4號峰為芒果苷，1、4號峰歸屬于知母藥材；10號峰為阿魏酸，歸屬于當歸藥材；11號峰為仙茅苷，歸屬于仙茅藥材；12號峰為朝藿定B，13號峰為淫羊藿苷，12、13號峰歸屬于淫羊藿藥材；15號峰為鹽酸巴馬汀，16號峰為鹽酸小檗堿，15、16號峰歸屬于黃柏藥材。

2.2.8 相似度評價 將16批二仙湯抗骨質疏松有效組分按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，以“2.2.1”項下色譜條件對樣品進行檢測，并用中藥指紋圖譜相似度評價系統2012版軟件分別對16批樣品的指紋圖譜進行數據處理，生成對照指紋圖譜，16批二仙湯抗骨質疏松有效組分與對照指紋圖譜比較的相似度分別為0.979、0.962、0.968、0.970、0.971、0.986、0.981、0.987、0.986、0.986、0.974、0.971、0.928、0.918、0.971、0.962，從上述結果可以看出，各批次二仙湯抗骨質疏松有效組分間化學成分的差異較小。

2.3 二仙湯抗骨質疏松有效組分的含量測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱為Agilent ZorBax Extend C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-0.1%磷酸水（含有0.025%十二烷基硫酸鈉），梯度洗脫：0～25 min，10%～18%乙腈；25～35 min，18%～19%乙腈；35～40 min，19%～25%乙腈；40～50 min，25%～32%乙腈；50～60 min，32%～55%乙腈；進樣量20 μL，體積流量1 mL/min；柱溫25 ℃；檢測波長270 nm?；旌蠈φ掌泛蜆悠返纳V圖見圖2。

2.3.2 線性關系考察 精密量取“2.1.2”項下的各對照品溶液適量于5 mL量瓶中，加入初始流動相定容得混合對照品溶液（新芒果苷162.0 μg/mL，芒果苷200.0 μg/mL，阿魏酸35.0 μg/mL，仙茅苷64.0 μg/mL，朝藿定B 50.0 μg/mL，淫羊藿苷135.0 μg/mL，鹽酸巴馬汀20.0 μg/mL，鹽酸小檗堿20.0 μg/mL），等比例稀釋成6個質量濃度梯度。分別精密吸取上述對照品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜峰面積。以峰面積為縱坐標（），質量濃度為橫坐標（），繪制標準曲線，進行線性回歸，得回歸方程新芒果苷＝9.074 8－21.982，2＝0.999 4，線性范圍5.1～162.0 μg/mL；芒果苷＝11.109－41.696，2＝0.999 6，線性范圍6.3～200.0 μg/mL；阿魏酸＝29.101＋9.421 4，2＝0.999 4，線性范圍1.1～35.0 μg/mL；仙茅苷＝12.065＋1.485 1，2＝0.999 8，線性范圍2.0～64.0 μg/mL；朝藿定B＝25.743＋8.830 3，2＝0.999 8，線性范圍1.6～50.0 μg/mL；淫羊藿苷＝24.081－8.375 8，2＝0.999 6，線性范圍4.2～135.0 μg/mL；鹽酸巴馬?。?2.459－23.380，2＝0.998 6，線性范圍0.6～20.0 μg/mL；鹽酸小檗堿＝63.802－8.101 5，2＝0.999 2，線性范圍0.6～20.0 μg/mL。

1-新芒果苷；2-芒果苷；3-阿魏酸；4-仙茅苷；5-朝藿定B；6-淫羊藿苷；7-鹽酸巴馬??；8-鹽酸小檗堿。

2.3.3 檢測限和定量限實驗 精密吸取對照品溶液，采用倍比稀釋的方法，檢測限按照信噪比（/）大于3，定量限按照/大于10的要求檢測。新芒果苷、芒果苷、阿魏酸、仙茅苷、朝藿定B、淫羊藿苷、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿的檢測限分別為0.96、0.87、0.23、0.56、0.35、0.48、0.23、0.20 μg/mL，定量限分別為2.60、3.12、0.86、1.60、1.20、1.42、0.56、0.53 μg/mL。

2.3.4 精密度試驗 精密量取已知濃度的混合對照品溶液。按“2.3.1”項色譜條件測定，同一天連續進樣6針測定日內精密度，每天進樣1針，連續進樣6 d，測定日間精密度，所得樣品峰面積RSD＜3%，表明日內精密度和日間精密度符合要求。

2.3.5 穩定性試驗 取二仙湯抗骨質疏松有效組分，分別在0、2、4、8、12 h進樣測定，計算新芒果苷、芒果苷、阿魏酸、仙茅苷、朝藿定B、淫羊藿苷、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿的峰面積RSD分別為2.78%、0.75%、2.91%、2.78%、1.04%、0.90%、3.90%、3.75%，表明在12 h內樣品溶液中上述各化合物較為穩定。

2.3.6 重復性試驗 取二仙湯抗骨質疏松有效組分，分別配制6份供試品溶液，按“2.3.1”項下方法進樣，記錄各對照品峰面積，計算新芒果苷、芒果苷、阿魏酸、仙茅苷、朝藿定B、淫羊藿苷、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿質量分數的RSD分別為1.25%、4.08%、0.88%、3.57%、1.71%、2.78%、2.08%、1.96%，表明本測定方法重復性良好。

2.3.7 加樣回收率試驗 分別稱取6份等量的已知含量的二仙湯抗骨質疏松有效組分，加入不同量的對照品，按樣品制備方法操作制備供試品，按“2.3.1”項下色譜條件，測定8種指標成分的含量，計算新芒果苷、芒果苷、阿魏酸、仙茅苷、朝藿定B、淫羊藿苷、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿的平均加樣回收率分別為102.2%、98.9%、99.4%、100.8%、100.0%、99.4%、101.2%、98.1%，RSD分別為2.37%、1.33%、2.84%、1.64%、1.89%、3.27%、2.10%、2.54%，表明本法回收率良好，符合要求。

2.3.8 含量測定 取各供試品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件進樣分析，每份樣品平行測3份，記錄色譜峰面積，計算二仙湯抗骨質疏松有效組分中各成分的含量，結果見表1、2。從表1可以看出，3批二仙湯抗骨質疏松有效組分中新芒果苷的平均質量分數為8.29%，芒果苷的平均質量分數為3.63%，阿魏酸的平均質量分數為0.32%，仙茅苷的平均質量分數為0.84%，朝藿定B的平均質量分數為3.91%，淫羊藿苷的平均質量分數為3.64%，鹽酸巴馬汀的平均質量分數為1.94%，鹽酸小檗堿的平均質量分數為2.85%。表2為室溫放置24個月的樣品，16批樣品中二仙湯抗骨質疏松有效組分中主要有效成分的含量都有不同程度的降低，以黃柏小檗堿類成分的含量降低的最為明顯。

表1 3批二仙湯抗骨質疏松有效組分中主要成分的含量測定結果

表2 16批二仙湯抗骨質疏松有效組分放置24月后主要成分的含量測定結果

2.4 二仙湯抗骨質疏松有效組分的鎮痛作用

抑制率＝(對照組小鼠扭體數－給藥組小鼠扭體數)/對照組小鼠扭體數

結果如表3所示，消炎痛組小鼠扭體次數比對照組小鼠顯著降低（＜0.01），抑制率為68.5%。二仙湯抗骨質疏松有效組分低、中、高劑量組小鼠扭體次數均比正常對照組減少，抑制率分別為17.1%、26.9%和35.4%，中、高劑量組小鼠扭體次數與對照組比較有顯著性差異（＜0.05、0.01），表明二仙湯抗骨質疏松有效組分具有較好的鎮痛作用。

表3 二仙湯抗骨質疏松有效組分對小鼠的鎮痛作用(, n = 10)

與對照組比較：*＜0.05**＜0.01。

*< 0.05**< 0.01control group.

2.5 二仙湯抗骨質疏松有效組分對成骨細胞的作用

將UMR-106成骨細胞用含l0%胎牛血清的DMEM培養基配制成濃度為3×104/mL的細胞懸液，以每孔100 μL的體積接種于96孔培養板中，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h后給藥，陰性對照組只加含10%血清的DMEM培養基，其余各組分別加入含二仙湯提取物5、10、20 μg/mL的培養基，繼續培養48 h和72 h，MTT法檢測成骨細胞的增殖。按照上述方案處理成骨細胞，培養至6 d時，按照試劑盒說明書檢測堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）的活性，以每孔中每mg蛋白釋放的對硝基苯酚的nmol數表示ALP的活性。

UMR-106成骨細胞按每孔1×105的細胞數接種于24孔板內，用含10%胎牛血清的DMEM培養基培養24 h，換含0.1% BSA的新鮮DMEM使細胞適應，12 h后換終濃度為1.0 nmol/L的含藥骨結節誘導培養基（0.1%白蛋白，10.0 nmol/L地塞米松，0.01 mol/L β-甘油磷酸鈉和50 μg/mL抗壞血酸以及10%胎牛血清的DMEM培養基），其中二仙湯抗骨質疏松有效組分的質量濃度分別為5、10、20 μg/mL，每3天換液1次，連續培養觀察14 d后進行骨結節染色。倒置相差顯微鏡200倍下觀察并計數每孔內20個隨機視野內骨結節的數量，以紅色結節和邊界清晰為準，取平均值，結果以骨結節數目/孔表示[10]。骨形成受2個不同的過程調控，即新的成骨細胞的形成和成骨細胞產生骨基質的活性。堿性磷酸酶是骨重建過程中的關鍵酶，能夠促進骨基質的礦化[11-12]。如表4所示，二仙湯抗骨質疏松有效組分在5、10、20 μg/mL的質量濃度下作用48 h和72 h，顯著促進UMR-106成骨細胞的增殖；作用6 d后，顯著增加成骨細胞堿性磷酸酶活性；作用12 d后，顯著增加成骨細胞骨鈣結節的形成，這些結果表明二仙湯抗骨質疏松有效組分通過增加成骨細胞的數目、成骨細胞的活性和促進骨基質的礦化增加骨質的形成。

表4 二仙湯抗骨質疏松有效組分對成骨細胞增殖、堿性磷酸酶活性和骨鈣結節形成的影響(, n = 8)

與對照組比較：*＜0.05**＜0.01。

*< 0.05**< 0.01control group.

2.6 二仙湯抗骨質疏松有效組分對破骨細胞的作用

將RAW264.7細胞培養在含25 ng/mL的核刺激因子-κB受體配體（receptor activator for nuclear factor kappa B ligand，RANKL）和30 ng/mL的巨噬細胞集落刺激因子（macrophage-stimulating factor，MCSF）的DMEM培養基中72 h，即分化為多核的抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrateresistant acid phosphatase，TRAP）染色陽性的破骨細胞。將1×105/mL RAW264.7細胞懸浮于含25 ng/mL RANKL和30 ng/mL MCSF的DMEM培養基中，接種于96孔板內，每孔100 μL，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養72 h，換含質量濃度為5、10、20 μg/mL的二仙湯提取物的培養基，繼續培養48 h和72 h，進行破骨細胞增殖測定，以評價二仙湯抗骨質疏松有效組分對破骨細胞是否有細胞毒作用。

破骨細胞抗酒石酸酸性磷酸酶的活性與破骨細胞的骨吸收活性直接相關[13]。如表5所示，二仙湯抗骨質疏松有效組分的質量濃度在5～20 μg/mL內抑制破骨細胞抗酒石酸酸性磷酸酶的活性，在10、20 μg/mL的質量濃度下作用72 h時，抑制率分別達到30.9%和47.4%。

RAW264.7細胞在RANKL和MCSF的誘導下分化為破骨細胞，成熟破骨細胞吸收骨基質，在骨片上形成吸收陷窩。用5、10、20 μg/mL的二仙湯抗骨質疏松有效組分處理破骨細胞12 d，與對照組相比，骨片表面形成的骨吸收陷窩的面積分別減少21.4%、24.8%和36.9%。這些結果表明二仙湯抗骨質疏松有效組分在5、10、20 μg/mL的質量濃度下，劑量相關性降低破骨細胞的骨吸收作用。

表5 二仙湯抗骨質疏松有效組分對由RAW264.7細胞誘導的破骨細胞抗酒石酸酸性磷酸酶活性和骨吸收陷窩面積的影響(, n = 8)

與對照組比較：*＜0.05**＜0.01。

*< 0.05**< 0.01control group.

3 討論

二仙湯是臨床治療婦女更年期綜合征和骨質疏松癥的常用方劑[14-16]。本實驗在前期對其抗骨質疏松有效成分和有效組分研究的基礎上，研究了二仙湯抗骨質疏松有效組分的化學指紋圖譜和主要有效成分的含量測定方法，并進一步明確了其鎮痛和對成骨細胞和破骨細胞功能的調控作用，為二仙湯方劑的質量控制及將其研制成抗骨質疏松的創新藥物奠定了基礎。本研究建立了二仙湯抗骨質疏松有效組分的指紋圖譜，對流動相（甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液）進行考察，發現乙腈-0.1%磷酸水溶液洗脫能力較好，色譜分離較好；采用紫外-可見分光光度計在200～400 nm波長下對二仙湯抗骨質疏松有效組分樣品進行掃描，270 nm波長下出峰數量較多且峰形良好；對柱溫進行了考察，發現柱溫在23～25 ℃時分離度良好；對體積流量、不同酸濃度等耐用性進行了考察，體積流量在0.8～1.2 mL/min，酸濃度在0.8%～1.2%對色譜峰無明顯影響，最后優選甲醇-0.1%磷酸水溶液為流動相梯度洗脫，柱溫25 ℃，體積流量1 mL/min，波長270 nm的色譜條件。

中藥指紋圖譜技術是目前公認的天然藥物質量控制的有效方式之一，突破以單一指標或幾個化學成分評價藥品質量的局限，可以較為全面的反映中藥所含化學成分的種類和數量[17-19]。骨質疏松癥是由于參與骨重建的成骨細胞的骨形成和破骨細胞骨吸收的平衡被破壞，使得骨吸收大于骨形成，導致骨丟失和骨質疏松癥的發生[20-21]。

二仙湯由淫羊藿、仙茅、知母、黃柏、當歸和巴戟天6味中藥組成[22]。淫羊藿黃酮、仙茅酚苷、知母黃酮和皂苷、黃柏小檗堿和當歸有機酸、巴戟天蒽醌和環烯醚萜苷為其相應藥材的活性成分，也有研究表明上述化學成分對成骨細胞和破骨細胞的功能均有顯著的調控作用，為二仙湯抗骨質疏松的有效成分[23-26]。本研究在前期制備二仙湯抗骨質疏松有效組分的基礎上，研究建立了其指紋圖譜，并進一步建立了多成分的含量測定方法，為二仙湯有效組分的質量控制奠定了基礎。二仙湯抗骨質疏松有效組分指紋圖譜研究中，確認了16個共有峰，以表征有效組分的含量，并通過加入對照品比對，指認了8個共有峰的化學結構，明確了其歸屬藥材。我們也試圖進一步明確16個共有峰中其余8個共有峰的歸屬，但是由于6味藥材所含化學成分復雜，采用相同的色譜方法和條件獲得的6味藥材單獨HPLC圖譜，與對照指紋圖譜比對時發現不同的藥材會具有相同色譜保留時間，尚沒有明確每個共有峰的確切的歸屬藥材。

另外，由于HPLC-DAD分析技術在靈敏度和對無紫外吸收的皂苷類成分檢測方面的不足，本研究所建立的指紋圖譜和含量測定方法尚不能表征二仙湯中含量較低的化學成分及知母皂苷類成分的結構類型和含量。因此，后續有必要進一步應用UPLC-MS等技術鑒定共有峰所代表的化學成分結構，以明確每個共有峰的歸屬藥材，并對含量較低及無紫外吸收的皂苷類成分進行定性和定量分析，以全面控制二仙湯有效組分的質量。

骨質疏松癥是由于骨代謝紊亂導致的骨丟失，其臨床表現為腰腿疼痛。課題組前期研究表明二仙湯抗骨質疏松有效組分能夠增加維甲酸和去卵巢誘導的骨質疏松大鼠的骨密度，改善骨組織微結構，顯示出良好的抗骨質疏松作用。

本研究進一步觀察了二仙湯抗骨質疏松有效組分在醋酸扭體小鼠的鎮痛作用及對成骨細胞和破骨細胞功能的調控作用，結果表明二仙湯有效組分能夠有效緩解醋酸扭體小鼠的疼痛反應，增加成骨細胞的形成、分化和骨礦化結節形成，抑制破骨細胞的形成、分化和骨吸收作用，進一步確證了其對骨代謝的調控作用及對骨質疏松臨床癥狀的緩解作用。后續有必要深入研究二仙湯抗骨質疏松有效組分的化學組成、多成分多靶點調控骨代謝的機制及其臨床應用的安全性，為將其研制成新型抗骨質疏松癥的組分中藥奠定基礎。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Establishment of fingerprint and content determination of multi-components for antiosteoporotic active fraction from Er-xian decoction and research on its analgesic and bone metabolism regulating effects

LIU Yan, LIU Yuling, SHEN Yi, DU Jinman, ZHAO Qiming, YE Xinyuan, ZHANG Quanlong, QIN Luping, ZHANG Qiaoyan

School of Pharmaceutical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China

To establish the fingerprint and multi-component content determination method of antiosteoporotic active fraction from Er-xian decoction, and lay a foundation for the development of antiosteoporotic component Chinese medicine based on Er-xian decoction.A Agilent ZorBax Extend C18column (250 mm × 4.6 mm, 5 μm) was selected for HPLC fingerprint detection; the mobile phase is consist of acetonitrile-0.1% aqueous phosphoric acid solution (containing 0.025% sodium dodecyl sulfate); gradient elution: 0—30 min, 4%—30% acetonitrile; 30—50 min, 30%—50% acetonitrile; 50—60 min, 50%—90% acetonitrile; flow rate is 1 mL/min; column temperature is 25 ℃; detection wavelength is 270 nm. The “” was used to evaluate the similarity; the common peaks were identified by comparison with reference compounds. The gradient elution for content determination was adjusted to: 0—25 min, 10%—18% acetonitrile; 25—35 min, 18%—19% acetonitrile; 35—40 min, 19%—25% acetonitrile; 40—50 min, 25%—32% acetonitrile; 50—60 min, 32%—55% acetonitrile and the contents of eight active components were determined. The analgesic effect of the effective components of Er-xian decoction and the regulation of bone metabolism were evaluated in mice with acetic acid twist body, osteoblasts and osteoclasts.The HPLC fingerprints of active fraction from Er-xian decoction were established, and 16 common peaks were identified. The similarity of 16 batches of samples comparison with reference fingerprint was more than 0.9. Eight common peaks (peaks 1, 4, 10—12, 13, 15, 16) were identified as neomangiferin, mangiferin, ferulic acid, curculigoside, epimedin B, icariin, palmatine hydrochloride and berberine hydrochloride. The linear relationship, repeatability, stability, precision and recovery in content determination meet the requirements. The antiosteoporotic active fraction from Er-xian decoction had a significant analgesic effect in the mouse acetate twist body model, and increased the formation of osteoblasts and mineralization of bone matrix, and inhibited the bone resorption of osteoclasts.The established HPLC fingerprint and multi-component content determination method of antiosteoporotic active fraction from Er-xian decoction could accurately, efficiently and comprehensively evaluate its quality, and provide a basis for its quality control.

Er-xian decoction; osteoporosis; fingerprint; multicomponent determination; high-performance liquid chromatography; neomangiferin; mangiferin; ferulic acid; curculigoside; epimedin B; icariin; palmatine hydrochloride; berberine hydrochloride; analgesia; quality control

R283.6

A

0253 - 2670(2024)09 - 2923 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2024.09.007

2023-10-17

國家自然科學基金項目（82374099）；國家自然科學基金項目（81973534）

劉 燕，女，碩士研究生，研究方向為中藥活性成分及其作用。E-mail: 2587175184@qq.com

通信作者：張巧艷，教授，從事中藥活性成分及其作用機制研究。E-mail: zqy1965@163.com

秦路平，教授，從事中藥品質評價和資源開發利用研究。E-mail: lpqin@zcmu.edu.cn

[責任編輯 鄭禮勝]