藤黃酸和雷帕霉素共載脂質體的制備及協同抗腫瘤活性研究

丁歡歡，姜先梅，劉紅梅，齊 瑤，涂柯蓉，陳 琳，蔡璐璐*，周先禮*

·藥劑與工藝·

藤黃酸和雷帕霉素共載脂質體的制備及協同抗腫瘤活性研究

丁歡歡1, 2，姜先梅2, 3，劉紅梅2, 3，齊 瑤2, 3，涂柯蓉2, 3，陳 琳1，蔡璐璐2, 3*，周先禮1*

1. 西南交通大學生命科學與工程學院，四川 成都 610031 2. 四川省醫學科學院·四川省人民醫院，藥學部，四川 成都 610072 3. 電子科技大學醫學院，個體化藥物治療四川省重點實驗室，四川 成都 610072

制備共載藤黃酸和雷帕霉素的脂質體（liposomes co-loaded with gambogic acid and rapamycin，GR@Lip）并優化其處方，研究GR@Lip的體外抗腫瘤機制、體內藥動學和生物分布。以包封率、載藥量及粒徑為評價指標，通過單因素和正交設計實驗篩選GR@Lip的最佳處方，并對其進行表征和穩定性研究；通過CCK-8法和流式細胞術考察GR@Lip對腫瘤細胞增殖和凋亡的影響，細胞劃痕實驗與Transwell實驗考察GR@Lip對腫瘤細胞遷移與侵襲的影響，透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）和免疫熒光考察GR@Lip對腫瘤細胞自噬的影響，液相色譜-質譜聯用技術（liquid chromotography with mass spectrometry，LC-MS）和活體成像儀研究GR@Lip的體內藥動學和生物分布。GR@Lip的最佳處方為制備溫度40 ℃，藥脂比1∶1∶20，磷脂與膽固醇比例4∶1，超聲功率195 W，超聲時間5 min，水化介質為超純水，水相pH值為7.1；該方法制備的GR@Lip藤黃酸包封率為（97.27±2.76）%，雷帕霉素包封率為（96.58±3.82）%，藤黃酸載藥量為（3.29±0.44）%，雷帕霉素載藥量為（4.91±0.44）%。TEM形態觀察顯示GR@Lip呈球形，動態光散射（dynamic light scattering，DLS）檢測其平均粒徑為（157.19±1.74）nm、ζ電位為（?22.1±1.3）mV，且具有良好的穩定性。體外抗腫瘤活性實驗結果顯示，藤黃酸和雷帕霉素聯用能協同抑制腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲，并顯著促進腫瘤細胞凋亡，增強自噬。此外，體內藥動學和生物分布結果顯示，GR@Lip可在體內滯留更長時間且具有良好的腫瘤靶向性。成功制備了GR@Lip，揭示其具有通過多途徑協同抗腫瘤的活性，并顯著改善了藤黃酸和雷帕霉素的藥動學行為，為進一步體內研究和未來臨床應用提供了實驗依據。

藤黃酸；雷帕霉素；共載脂質體；抗腫瘤；聯合用藥；體內藥動學；生物分布；增殖；凋亡；遷移；浸襲；自噬

惡性腫瘤是全球范圍的重大公共衛生問題，嚴重威脅人類的生命健康。化療作為治療惡性腫瘤的重要手段之一，為腫瘤患者的生命健康做出了巨大的貢獻。雷帕霉素是雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的天然抑制劑，已被FDA批準用于治療腎癌，其衍生物已用于腦腫瘤、胰腺癌和乳腺癌等的治療。由于腫瘤病理機制復雜多元，僅依靠單一抗腫瘤機制的藥物治療很難獲益。因此，探尋創新型高效低毒的藥物聯用模式已成為腫瘤治療的有效策略。中藥成分具有多靶點、多環節、多途徑的特點和較低的不良反應，與化療藥物聯用可減輕臨床癥狀、降低不良反應、防止耐藥和復發[1]，在腫瘤治療中具有巨大前景。藤黃酸是從中藥藤黃中提取的一種天然化合物，可有效抑制多種腫瘤生長。藤黃酸也被證實可與化療藥物如多柔比星[2]、吉西他濱[3]等聯用，協同增強抗腫瘤療效[4]。因此，本研究旨在探索藤黃酸與雷帕霉素的組合策略是否可以改善腫瘤治療效果，并初步研究其協同抗癌機制。

然而，藤黃酸具有水溶性差、刺激性強且選擇性較低的缺點，雷帕霉素難溶于水且單用易產生耐藥性導致臨床應用受到嚴重阻礙，基于納米技術的藥物共遞送系統在解決上述缺陷方面表現出顯著的優勢[5]。研究顯示，多藥共載納米制劑可在保持藥物活性的同時顯著增強療效[6]。脂質體作為目前研發比較成熟的裝載疏水性藥物的制劑，其磷脂雙分子層結構可以更有效地被細胞攝取，從而提高藥物遞送效能[7-8]。此外，基于脂質體的被動靶向作用，可以改善藥物在體內的藥動學行為，增強腫瘤靶向性。本實驗將藤黃酸和雷帕霉素共載于脂質體中，通過單因素和正交設計試驗對處方工藝進行優化，研究其對多種腫瘤細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲以及自噬的影響，并進一步研究其體內藥動學和生物分布，初步探索雙藥共載脂質體的抗腫瘤作用機制，以期為藤黃酸臨床制劑的應用轉化提供依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

XSE205型分析天平，梅特勒托利多儀器有限公司；RE-2010型旋轉蒸發儀，成都康宇科技有限公司；SHB-III型循環水式多用真空泵，鄭州長城科工貿有限公司；WB-2000型水浴鍋，鄭州長城科工貿有限公司；SM-650A型超聲波細胞粉碎機，南京舜瑪儀器設備有限公司；Litesizer 500型納米粒徑及Zeta電位分析儀，安東帕（上海）商貿有限公司；HT7820型低電壓透射電子顯微鏡（TEM），日本日立公司；Agilent 1260型高效液相色譜系統，美國安捷倫公司；色譜柱Sun Fire C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），美國Waters公司；SB25-12DTD型超聲波清洗器，寧波新芝生物科技股份有限公司；i-Pure Pro2智能型純水/超純水機，杭州澤南科技有限公司；FD-1C-50型冷凍干燥機，北京博醫康實驗儀器有限公司；75004240型離心機，百樂科技有限公司；Herocell 240型二氧化碳培養箱，上海潤度生物科技有限公司；Epoch2型酶標儀，美國伯騰儀器有限公司；ICX41型生物顯微鏡，寧波舜宇儀器有限公司；NovoCyte 2070R型流式細胞儀，安捷倫科技有限公司；AniView 100型多模式動物活體成像系統，廣州博鷺騰生物科技有限公司；AB Sciex Qtrap 5500型液相色譜-質譜聯用儀，日本島津公司。

1.2 材料

藤黃酸，批號20210122，質量分數98%，南京康滿林化工實業有限公司；藤黃酸對照品，批號M0802AS，質量分數≥97%，大連美侖生物技術有限公司；卵磷脂（批號C14422665）、雷帕霉素（批號c12477612，質量分數98%），上海麥克林生化科技有限公司；雷帕霉素對照品，批號J17GB155257，質量分數≥99%，上海源葉生物科技有限公司；和厚樸酚對照品，批號20221027，質量分數≥98%，北京北方偉業計量技術研究院；子囊霉素對照品，批號PR230820-29，質量分數95.3%，廣州亮化化工有限公司；吲哚菁綠（indocyanine green，ICG），批號22Z144-D1，質量分數90%，上海甄準生物科技有限公司；膽固醇，批號B80859，艾偉拓（上海）醫藥科技有限公司；無水乙醇，分析純，成都金山化學試劑有限公司；甲醇，分析純，成都市科隆化學品有限公司；乙腈，色譜純，Sigma-Aldrich（上海）貿易有限公司；冰乙酸，色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司；RPMI 1640、DMEM培養基，批號812338、8122762，賽默飛世爾生物化學制品有限公司；胎牛血清、胰蛋白酶，批號H20051277、SS1059，美國Gibco公司；CCK-8（批號CR2310019）、磷酸鹽緩沖液（PBS，批號23314817），武漢賽維爾生物科技有限公司。

小鼠胰腺癌Pan02細胞和小鼠宮頸癌U14細胞均購自武漢華爾納生物科技有限公司，批號分別為SAc0135和CTCC-400-0316；小鼠乳腺癌4T1細胞購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫，批號250362。Balb/c小鼠，雌性，5～6周齡，購自斯貝福（北京）生物技術有限公司，質量合格證編號為110324241101832765。所有動物飼養在同一環境下，環境溫度為（24.0±1.0）℃，相對濕度維持在55%～65%。本實驗相關動物實驗遵循四川省人民醫院實驗動物研究所有關實驗動物管理和使用的規定，均符合3R原則。

2 方法與結果

2.1 藤黃酸與雷帕霉素聯用比例的篩選

通過CCK8法測定藤黃酸、雷帕霉素及不同聯用比例對4T1細胞的增殖毒性，將處于對數生長期的4T1細胞以5 000個/孔接種在96孔板中，孵育24 h后棄去舊培養基，加入不同質量濃度的藥物繼續培養24 h，然后加入CCK-8增殖檢測試劑，37 ℃孵育2 h后，通過酶標儀測定450 nm處的吸光度（），并計算半數抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50，單位為μg/mL）及聯合指數（combination index，CI，CI＝A/IC,A＋B/IC,B）。其中，A和B代表2種不同藥物，IC,A和IC,B是表示A、B 2種藥物單獨使用使生長抑制率達時的藥物質量濃度，A和B是A藥和B藥聯合使用使生長抑制率達時2種藥物的質量濃度）[9]。CI＝1表示加和作用，CI＜1表示協同作用，CI＞1表示拮抗作用。結果見表1，當藤黃酸與雷帕霉素物質的量比為1∶1時，CI＝0.772＜1，協同效果最好，因此，后續選擇該比例制備共載脂質體。

表1 藤黃酸與雷帕霉素聯用比例篩選

2.2 GR@Lip制備方法的考察

2.2.1 薄膜水化法 精密稱取藤黃酸5 mg、雷帕霉素7.28 mg、膽固醇9.23 mg與大豆卵磷脂72.43 mg（藥脂比為物質的量比1∶1∶15，磷脂與膽固醇比例為物質的量比4∶1），溶于3～5 mL無水乙醇中，利用旋轉蒸發儀去除溶劑，待圓底燒瓶內部形成均勻薄膜后，繼續旋蒸3 h以完全除去殘留溶劑。加入5 mL超純水水化1 h，超聲5 min（195 W），依次過0.45 μm及0.22 μm濾膜，即可得到GR@Lip。

2.2.2 逆向蒸發法 精密稱取藤黃酸5 mg、雷帕霉素7.28 mg、膽固醇9.23 mg與大豆卵磷脂72.43 mg（藥脂比為物質的量比1∶1∶15，磷脂與膽固醇比例為物質的量比4∶1），溶于3 mL氯仿中，加入1 mL超純水，采用功率為195 W的超聲波細胞粉碎機超聲5 min，成乳后蒸發除去溶劑，加入5 mL超純水水化1 h，超聲5 min（195 W），依次過0.45 μm及0.22 μm濾膜，即可得到GR@Lip。

2.2.3 乙醇注入法 精密稱取藤黃酸5 mg、雷帕霉素7.28 mg、膽固醇9.23 mg與大豆卵磷脂72.43 mg（藥脂比為物質的量比1∶1∶15，磷脂與膽固醇比例為物質的量比4∶1），溶于3 mL無水乙醇中，40 ℃攪拌30 min。5 mL超純水在40 ℃下攪拌30 min，將無水乙醇溶液緩慢滴入超純水中繼續攪拌30 min。旋轉蒸發除去乙醇，定容至5 mL，超聲5 min（195 W），依次過0.45、0.22 μm濾膜，即可得到GR@Lip。

2.2.4 考察結果 結果如表2所示，與逆向蒸發法和乙醇注入法相比，薄膜水化法制備得到的脂質體包封率最高，載藥量與逆向蒸發法相近，但高于乙醇注入法，且粒徑最小，表明薄膜水化法更適于制備GR@Lip，因此，后續選擇薄膜水化法進一步優化其制備方法。在后續實驗中通過薄膜水化法制備空白脂質體、藤黃酸脂質體（gambogic acid liposomes，GA@Lip）、雷帕霉素脂質體（rapamycin liposomes，Rap@Lip）與吲哚菁綠脂質體（indocyanine green liposomes，ICG@Lip）。

表2 制備方法考察(, n = 3)

2.3 HPLC法測定GR@Lip包封率與載藥量分析方法的建立

2.3.1 雷帕霉素、藤黃酸對照品溶液的配制 精密稱取雷帕霉素對照品47.72 mg，藤黃酸對照品32.60 mg，以甲醇溶解并定容于10 mL量瓶中，混勻即得雷帕霉素/藤黃酸對照品儲備液，按比例稀釋為所需質量濃度。

2.3.2 供試品溶液及空白脂質體對照溶液的配制 精密量取1 mL GR@Lip于量瓶中，加入適量甲醇，振蕩渦旋后用甲醇定容，搖勻，0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得供試品溶液。同法配制空白脂質體對照溶液。

2.3.3 色譜條件 色譜柱為Sun Fire C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫35 ℃；體積流量1.5 mL/min；檢測波長288、361 nm；進樣量10 μL；流動相梯度洗脫見表3，色譜圖見圖1。

2.3.4 系統適用性實驗 取空白脂質體溶液、雷帕霉素、藤黃酸對照品溶液（雷帕霉素119.30 μg/mL、藤黃酸81.50 μg/mL）進樣分析。結果表明雷帕霉素、藤黃酸與相鄰組分分離度均大于1.5，拖尾因子小于1.5，對照品溶液連續5次峰面積的RSD小于2.0%，對照品溶液信噪比（/）大于10，表明方法系統適用性好。

表3 流動相梯度洗脫程序

2.3.5 線性關系考察 取系列雷帕霉素、藤黃酸對照品溶液，按“2.3.3”項下色譜條件進樣測定，分別以雷帕霉素、藤黃酸的質量濃度為橫坐標（），雷帕霉素、藤黃酸的峰面積為縱坐標（）繪制標準曲線，得回歸方程分別為雷帕霉素＝14.753 4＋16.543 8，2＝0.999 9；藤黃酸＝5.364 7＋2.271 6，2＝0.999 9；結果表明，雷帕霉素在14.91～357.90 μg/mL，藤黃酸在10.18～244.50 μg/mL線性關系良好。

2.3.6 精密度試驗 取同一供試品溶液，連續進樣6次，計算日內精密度，雷帕霉素日內檢測RSD為0.13%，藤黃酸日內檢測RSD為0.06%，表明方法精密度高。

2.3.7 重復性試驗 精密吸取同一批GR@Lip樣品6份，加適量色譜級甲醇超聲溶解，制得供試品溶液，按色譜條件進樣分析并平行測定3次。GR@Lip中雷帕霉素RSD為1.71%，藤黃酸RSD為1.47%，表明方法重復性良好。

圖1 雷帕霉素和藤黃酸對照品(A) 及GR@Lip樣品(B) 的HPLC圖譜

2.3.8 加樣回收率試驗 精密吸取低、中、高質量濃度雷帕霉素、藤黃酸對照品儲備液各5 mL，置于不同的10 mL量瓶中，再分別加入空白脂質體5 mL，并用色譜級甲醇定容，平行制備3份，再根據“2.3.2”項下所述方法配制供試品溶液。按色譜條件進樣分析并平行測定3次，雷帕霉素回收率為（102.99±3.63）%，回收率RSD值為（0.68±0.34）%，藤黃酸回收率為（101.13±0.05）%，回收率RSD值為（0.73±0.28）%，表明方法準確度高。

2.4 GR@Lip包封率與載藥量的測定

藤黃酸和雷帕霉素在水中的溶解度均很?。ㄌ冱S酸溶解度約為0.5 μg/mL，雷帕霉素溶解度約為0.26 μg/mL），因此，認為游離藥物已在制備過程中通過微孔濾膜濾過去除。精密量取100 μL GR@Lip，另精密稱取一定質量的凍干的GR@Lip，分別加入甲醇定容至1 mL進行破乳，靜置后，用0.22 μm有機系微孔濾膜濾過，取續濾液，按“2.2.3”項下色譜條件測定藤黃酸與雷帕霉素藥物含量。按下列公式分別計算包封率和載藥量。

包封率＝藥物實際質量/藥物的投入量

載藥量＝藥物實際質量/制劑的總質量

2.5 GR@Lip處方工藝優化

在文獻調研及前期預實驗的基礎上，確定以制備溫度（旋蒸及水化時的溫度）、藥脂比（脂總量代表磷脂與膽固醇總量）、磷脂-膽固醇比例、超聲功率、超聲時間、水化介質及水相pH值作為考察對象，包封率、載藥量及粒徑作為評價指標進行單因素考察，并根據單因素篩選結果，進行正交設計試驗，篩選出最佳處方。

2.5.1 單因素考察

（1）制備溫度考察：藤黃酸投藥量為5 mg，雷帕霉素投藥量為7.28 mg，藥脂比為1∶1∶15，磷脂-膽固醇比例為4∶1，超聲功率195 W，超聲時間5 min，超純水作為水化介質，水相pH值為7.1的條件下，考察不同溫度對包封率、載藥量及粒徑的影響。結果見表4，隨著溫度升高，包封率和載藥量呈先上升后下降的趨勢，綜合考慮最佳制備溫度為40 ℃，這可能是由于溫度較低時無法引發磷脂相變，溫度過高時影響磷脂穩定性造成的[10]。

表4 制備溫度的考察(, n = 3)

（2）藥脂比考察：藤黃酸投藥量為5 mg，雷帕霉素投藥量為7.28 mg，溫度為40 ℃，磷脂-膽固醇比例為4∶1，超聲功率195 W，超聲時間5 min，超純水作為水化介質，水相pH值為7.1的條件下，考察藥脂比對GR@Lip包封率、載藥量及粒徑的影響。結果見表5，隨著脂質用量的增加，藤黃酸和雷帕霉素的包封率逐漸增加，藤黃酸的載藥量呈逐漸下降趨勢，而雷帕霉素的載藥量呈現先增加后下降的趨勢，不同藥脂比制得的脂質體粒徑均小于200 nm，綜合考慮最佳藥脂比為1∶1∶20。這是由于增加脂質用量有利于增加包封率，但脂質用量較多時會降低載藥量[11]。

（3）磷脂與膽固醇比例考察：藤黃酸投藥量為5 mg，雷帕霉素投藥量為7.28 mg，溫度為40 ℃，藥脂比為1∶1∶20，超聲功率195 W，超聲時間5 min，超純水作為水化介質，水相pH值為7.1的條件下，考察藥脂比對GR@Lip包封率、載藥量及粒徑的影響。結果見表6，隨著磷脂比例的增加，藤黃酸和雷帕霉素的包封率略有下降，載藥量先增加后下降，粒徑逐漸增加，但均小于200 nm，綜合考慮磷脂與膽固醇的最佳比例為4∶1。

表5 藥脂比考察(, n = 3)

（4）超聲功率考察：藤黃酸投藥量為5 mg，雷帕霉素投藥量為7.28 mg，溫度為40 ℃，藥脂比為1∶1∶20，磷脂與膽固醇比例4∶1，超聲時間5 min，超純水作為水化介質，水相pH值為7.1的條件下，考察超聲功率對GR@Lip包封率、載藥量及粒徑的影響。結果見表7，隨著功率的增加，藤黃酸和雷帕霉素的包封率和載藥量逐漸增加，粒徑逐漸減小。綜合考慮，確定超聲功率為195 W。

表6 磷脂與膽固醇比例考察(, n = 3)

表7 超聲功率考察(, n = 3)

（5）超聲時間考察：藤黃酸投藥量為5 mg，雷帕霉素投藥量為7.28 mg，溫度為40 ℃，藥脂比為1∶1∶20，磷脂與膽固醇比例4∶1，超聲時間功率195 W，超純水作為水化介質，水相pH值為7.1的條件下，考察超聲時間對GR@Lip包封率、載藥量及粒徑的影響。結果見表8，隨著超聲時間的增加，藤黃酸和雷帕霉素的載藥量和粒徑逐漸減小，這可能是由于過長時間的超聲破壞了GR@Lip。超聲5 min時的包封率、載藥量及粒徑均較為理想。綜合考慮，確定超聲時間為5 min。

表8 超聲時間考察(, n = 3)

（6）水化介質考察：藤黃酸投藥量為5 mg，雷帕霉素投藥量為7.28 mg，溫度為40 ℃，藥脂比為1∶1∶20，磷脂與膽固醇比例4∶1，超聲時間功率195 W，超聲時間5 min，水相pH值為7.1的條件下，考察水化介質對GR@Lip包封率、載藥量及粒徑的影響。結果見表9，選擇超純水作為水化介質時，包封率及載藥量均明顯優于PBS和生理鹽水，且粒徑較小。此外，生理鹽水作為水化介質時，靜置數小時便析出沉淀，表明其穩定性較差。綜合考慮，確定超純水作為水化介質。

（7）水相pH值考察：藤黃酸投藥量為5 mg，雷帕霉素投藥量為7.28 mg，溫度為40 ℃，藥脂比為1∶1∶20，磷脂與膽固醇比例4∶1，超聲時間功率195 W，超聲時間5 min，超純水作為水化介質的條件下，考察水相pH值對GR@Lip包封率、載藥量及粒徑的影響。結果見表10，當水化介質呈弱酸性和近中性時，包封率及載藥量均較高，呈弱堿性時略低，這可能是因為藤黃酸呈酸性，在堿性溶液中不穩定。在弱酸性條件下，共載脂質體的粒徑略大。綜合考慮，確定水相pH值為7.1。

表9 水化介質考察(, n = 3)

表10 水相pH值考察(, n = 3)

2.5.2 正交設計試驗 綜合比較單因素實驗篩選結果，選擇對包封率和載藥量影響較為顯著的3個因素，即制備溫度（A）、藥脂比（B）、磷脂-膽固醇比例（C）作為正交設計試驗的主要影響因素，其他因素采用單因素考察的最佳結果，確定超聲功率為195 W，超聲時間為5 min，水化介質為超純水，水相pH為7.1。在3個主要因素水平上以藤黃酸包封率（1）、雷帕霉素包封率（2）、藤黃酸載藥量（3）、雷帕霉素載藥量（4）及粒徑（5）作為主要評價指標，采用L9(34)正交試驗表進行實驗，篩選出最優處方，正交因素設計水平見表11。

本研究因有多個評價指標，故采用綜合評分法。通過SPSS AUA分析軟件確定藤黃酸包封率（1）、雷帕霉素包封率（2）、藤黃酸載藥量（3）、雷帕霉素載藥量（4）及粒徑（5）權重分別為20.10%、18.81%、18.22%、17.59%和25.27%，進行綜合評分。正交設計試驗結果見表11，方差結果見表12。極差為A＞B＞C，說明A因素的影響最大，即制備溫度，其次是藥脂比，磷脂與膽固醇的比例的影響較小，最佳制備工藝為A1B2C2，即GR@Lip的最優處方為制備溫度40 ℃，藥脂比1∶1∶20，磷脂與膽固醇比例4∶1。

表11 正交試驗設計與結果

表12 方差結果分析

2.5.3 處方驗證 根據正交設計試驗結果，篩選出最優處方并平行制備3組，測定其包封率、載藥量及粒徑，對處方工藝進行驗證。結果顯示，GR@Lip中藤黃酸包封率為（97.27±2.76）%，雷帕霉素包封率為（96.58±3.82）%，藤黃酸載藥量為（3.29±0.44）%，雷帕霉素載藥量為（4.91±0.44）%，平均粒徑為（157.19±1.74）nm，結果表明該方法重復性良好。

2.6 GR@Lip的表征及穩定性

2.6.1 表征 通過納米粒徑及ζ電位分析儀測定GR@Lip的粒徑和ζ電位，采用TEM對GR@Lip進行形貌表征，考察GR@Lip在4 ℃條件下放置1個月的粒徑和PDI變化情況。結果見圖2和表13，GR@Lip的平均粒徑為（157.19±1.74）nm，PDI為0.224±0.033，ζ電位為（?22.1±1.3）mV。TEM圖像顯示，共載藥脂質體呈球形形態，在4 ℃條件下放置1個月粒徑及PDI均無明顯變化，表明脂質體的粒徑具有良好的穩定性。

2.6.2 穩定性

（1）包封率及滲漏率的測定：將制備得到的GR@Lip放置于在4 ℃條件下，每3天通過HPLC測定包封率，并計算滲漏率（滲漏率＝1－儲存過程中測得的藥物包封率/第0天測得的藥物包封率）。結果如表14所示，隨著儲存時間延長，脂質體存在一定程度的泄露，但儲存15 d包封率仍大于80%，符合脂質體質量控制標準。

（2）氧化產物的測定：磷脂氧化程度是脂質體穩定性的重要指標，本研究采用氧化產物評價磷脂的氧化程度。由于磷脂中含不飽和類脂，可被氧化為共軛二烯，形成過氧化脂質，進一步分解為丙二醛及溶血磷脂。丙二醛在酸性條件下與硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）反應生成一種紅色染料（TBA-pigment），在532 nm處有最大吸收峰，吸光度（）值大小可以反映磷脂的氧化程度。因此，將制備得到的GR@Lip放置于在4 ℃條件下，每3天通過丙二醛檢測試劑盒測定532 nm處的值。結果如表15所示，GR@Lip在15 d內值無明顯變化，表明脂質體具有良好的穩定性。

圖2 GR@Lip的粒徑分布(A)、ζ電位(B) 和TEM圖(C)

表13 粒徑穩定性結果(, n = 3)

表14 包封率及滲漏率測定結果(, n = 3)

表15 氧化產物測定結果(, n = 3)

2.7 體外抗腫瘤活性

2.7.1 細胞增殖毒性檢測 通過CCK-8法測定GR@ Lip對3種不同癌細胞的增殖毒性，將處于對數生長期的Pan02、U14及4T1細胞以5 000個/孔接種在96孔板中，孵育24 h后棄去舊培養基，加入不同質量濃度的脂質體（GA@Lip、Rap@Lip、GR@ Lip）繼續培養24 h，然后加入CCK-8增殖檢測試劑，37 ℃孵育2 h后，通過酶標儀測定450 nm處的值，并計算IC50及CI。結果如表16所示，與GA@Lip組和Rap@Lip組相比，GR@Lip處理后3種癌細胞的IC50均顯著降低，分別為（0.37＋0.54）、（0.54＋0.78）、（0.34＋0.48）μg/mL。此外，GR@Lip對Pan02、U14及4T1細胞的CI值分別為0.65±0.01、0.96±0.02、0.86±0.01，均小于1，表明藤黃酸與雷帕霉素聯用具有協同作用。

表16 IC50及CI值計算結果(, n = 3)

2.7.2 細胞凋亡檢測 將處于對數生長期的Pan02、U14及4T1細胞以6×106個/孔接種在6孔板中，孵育24 h后棄去舊培養基，PBS洗滌。加入藥物繼續培養24 h，用PBS清洗后消化細胞，離心，收集細胞。加入500 μL的binding buffer（1×）重懸細胞，加入2.5 μL的Annexin-V-FITC和2.5 μL的PI染色液輕輕混勻染色，避光孵育15 min后置于冰上，1 h內用流式細胞儀檢測。結果見圖3和表17，在Pan02、U14及4T1細胞中，與對照組的凋亡率［（4.20±0.42）%、（4.03±0.46）%、（1.95±0.30）%］及單藥組的凋亡率［GA@Lip：（22.24±0.22）%、（9.28±0.35）%、（15.45±1.79）%；Rap@Lip： （13.38±0.76）%、（11.95±0.42）%、（0.52±0.13）%］相比，GR@Lip的凋亡率分別為（32.56±1.44）%、（22.15±0.44）%和（25.62±1.58）%，均顯著高于其他3組，表明藤黃酸與雷帕霉素聯用具有促進腫瘤細胞凋亡的協同作用。

圖3 GR@Lip對Pan02 (A)、U14 (B) 及4T1 (C) 細胞凋亡的影響

表17 細胞凋亡分析(, n = 3)

與對照組比較：***＜0.001。

***< 0.001control group.

2.7.3 細胞遷移能力檢測 通過細胞劃痕實驗研究對細胞遷移的影響，將處于對數生長期的Pan02、U14及4T1細胞，以8×106個/孔接種在12孔板中，孵育24 h后棄去舊培養基，PBS清洗細胞后，采用200 μL移液槍槍頭在單層細胞上劃一字劃痕，PBS清洗，在倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照，記錄為0 h。隨后加入藥物繼續培養24 h，PBS清洗1次后，在倒置熒光顯微鏡下拍照觀察細胞的遷移情況。使用Image J軟件分析劃痕面積，并計算遷移率［遷移率＝(0 h劃痕面積－24 h劃痕面積)/0 h劃痕面積］。結果見圖4和表18，在無藥物干預的情況下，左右兩側細胞逐漸向中間劃痕區域靠攏，Pan02、U14及4T1細胞的遷移率達到（51.86±2.35）%、（29.37±8.57）%和（46.96±2.94）%，而給藥組向劃痕區域遷移情況均受到一定程度抑制，尤其給予GR@Lip后，各組細胞遷移率分別降至（3.21±1.01）%、（5.98±2.69）%和（12.39±6.43）%，且顯著低于單藥組，表明藤黃酸與雷帕霉素聯用具有協同抑制腫瘤細胞遷移的作用。

圖4 GR@Lip對Pan02 (A)、U14 (B) 及4T1 (C) 細胞遷移的影響

表18 細胞遷移分析(, n = 3)

與對照組比較：**＜0.01***＜0.001。

**< 0.01***< 0.001control group.

2.7.4 細胞侵襲能力檢測 通過Transwell實驗檢測對細胞侵襲的影響，將Matrigel基質膠與無血清培養基，分別按1∶8、1∶12、1∶14的比例進行稀釋，以100 μL/孔加到Transwell上室中，置于培養箱中恒溫孵育5 h至其完全凝固。吸去多余液體，將處于對數生長期的Pan02、U14及4T1細胞分別以2×104、5×104、6×104個/孔接種于Transwell上室，并加入100 μL含藥無血清培養基，下室加入750 μL的完全培養基，繼續培養24 h，棄去Transwell上室的培養基，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗滌，0.5%結晶紫染色5 min。染色結束后，PBS漂洗3次，自然晾干，于顯微鏡下選取隨機視野，觀察并拍照。結果見圖5，與對照組相比，給藥組穿過Transwell小室聚碳酸酯膜的細胞數量顯著減少，其中GR@Lip組細胞數量最少，表明藤黃酸與雷帕霉素聯用可以發揮抑制腫瘤細胞侵襲的協同作用。

圖5 GR@Lip對Pan02 (A)、U14 (B) 及4T1 (C) 細胞侵襲的影響

2.7.5 自噬小體檢測 通過TEM觀察GR@Lip對誘導自噬的影響。將處于對數生長期的Pan02、U14及4T1細胞以1.5×106個/孔接種在60 mm培養皿中，孵育24 h后棄去舊培養基，PBS清洗，加入藥物繼續培養24 h。除去舊培養基，PBS洗滌1次，用胰酶消化，收集細胞懸液至15 mL離心管中，1 500 r/min離心（離心半徑為16.8 cm）10 min，棄去上清。

加入0.5%戊二醛固定液重懸，4 ℃靜置10 min， 12 000 r/min離心（離心半徑為8.6 cm）15 min，棄去上清。加入3%戊二醛固定液固定，1%四氧化鋨進行再固定，丙酮逐級脫水，Epon812包埋，半薄切片用甲苯胺藍染色作光學定位，用鉆石刀作超薄切片，醋酸鈾和枸櫞酸鉛染色后通過透射電鏡觀察并拍照。結果見圖6，與對照組相比，藥物干預后各組均可觀察到自噬小體的產生（紅色箭頭），其中GR@Lip組自噬小體數量最多，表明藤黃酸與雷帕霉素聯用可以協同增強自噬。

圖6 GR@Lip對Pan02 (A)、U14 (B) 及4T1 (C) 自噬小體形成的影響

2.7.6 自噬相關蛋白LC3B和Beclin1的表達 采用免疫熒光技術檢測自噬相關蛋白LC3B和Beclin1的表達情況。將處于對數生長期的Pan02、U14及4T1細胞，以1×105個/孔接種在鋪好細胞爬片的12孔板中，孵育24 h后棄去舊培養基并用PBS清洗，加入藥物繼續培養24 h后，用4%多聚甲醛固定。結果見圖7，GA@Lip和Rap@Lip處理后，在3種癌細胞中均可觀察到紅色熒光（LC3B）或綠色熒光（Beclin1）有所增強，表明藤黃酸與雷帕霉素均可激活自噬。同時，GR@Lip組中紅色熒光和綠色熒光均顯著增強，表明藤黃酸與雷帕霉素聯合可以協同誘導自噬。

2.8 體內藥動學研究

2.8.1 給藥方案與樣品處理 Balb/c小鼠購進后適應性喂養1周，隨機分為空白組、游離藤黃酸組4 mg/kg、游離雷帕霉素組6 mg/kg、GR@Lip組（4＋6）mg/kg，尾靜脈給藥1次后，分別于0.25、0.50、2.00、4.00、8.00、12.00、24.00 h通過小鼠眼球取血，3 500 r/min離心15 min（離心半徑為8.6 cm），取上層血漿于?80 ℃保存。

2.8.2 內標儲備液與對照品儲備液的配制 精密稱取內標物質和厚樸酚、子囊霉素和對照品藤黃酸、雷帕霉素各5 mg，于10 mL量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，作為內標物質儲備液和對照品儲備液。

（1）內標溶液配制：精密量取和厚樸酚內標儲備液20 μL、子囊霉素內標儲備液20 μL到960 μL乙腈中，混勻，再移取50 μL到24.95 mL乙腈中，配制成20 ng/mL內標溶液，4 ℃貯存。

（2）標準曲線建立：精密量取藤黃酸和雷帕霉素對照品儲備液，分別用乙腈稀釋為1 000、400、100、40、10、4、1 ng/mL，作為對照品溶液。按色譜條件進樣測定，分別以雷帕霉素、藤黃酸的質量濃度為橫坐標（），以雷帕霉素、藤黃酸峰面積與內標物質峰面積比值為縱坐標（）繪制標準曲線，得回歸方程分別為雷帕霉素＝8 798.467 5＋ 5 691.288 7，2＝0.992 0；藤黃酸＝23 967.095 9－11 876.545 8，2＝0.994 7。

2.8.3 色譜條件 色譜柱為Waters UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相為乙腈-0.01%氨水溶液，梯度洗脫：0～1.00 min，40%～90%乙腈；1.00～2.80 min，90%乙腈；柱溫35 ℃；進樣量1 μL；體積流量0.5 mL/min。

2.8.4 質譜條件 電離方式：電噴霧離子源，離子源溫度500 ℃，氣簾氣（CUR）137.895 kPa（20 psi），噴霧電壓（IS）?4 500 V，霧化氣（GS1）413.685 kPa（60 psi），加熱氣（GS2）413.685 kPa（60 psi），去簇電壓（DP）?100 V，離子束聚焦電壓（EP）?10 V，碰撞池出口電壓（CXP）?10 V，總掃描時間0.315 s，監測模式：負離子多反應監測（MRM）。定量分析的離子反應對為藤黃酸/627.2→583.2，碰撞能?22 V；雷帕霉素/912.6→321.2，碰撞能?49 V。

2.8.5 液質聯用分析 精密量取30 μL待測血漿樣品，加入120 μL含和厚樸酚和子囊霉素20 ng/mL的內標溶液，渦旋混勻，13 000 r/min離心15 min（離心半徑為8.6 cm），取上清液至進樣小瓶，采用上述色譜、質譜條件進行含量檢測。

2.8.6 藥動學結果 根據上述檢測結果，繪制血藥濃度-時間曲線見圖8，采用DAS 2.0軟件對所得數據進行計算分析，得出相關藥動學參數見表19。與游離藥物組相比，GR@Lip組中藤黃酸和雷帕霉素的AUC0～t分別是游離藤黃酸和游離雷帕霉素的1.51和1.29倍，AUC0～∞分別是游離藤黃酸和游離雷帕霉素的1.64和1.34倍。

藤黃酸和雷帕霉素的達峰濃度（max）分別由（27.29±4.61）μg/L和（148.19±5.07）μg/L提高至（36.43±1.53）μg/L和（179.69±25.78）μg/L。更重要的是，藤黃酸和雷帕霉素的半衰期1/2分別由3.67 h和6.82 h延長至8.48 h和8.12 h，且平均滯留時間（MRT0～∞）較游離組也有所延長。以上結果表明GR@Lip較游離藥物可在體內滯留更長時間，具有更高的生物利用率。

2.9 體內生物分布

采用熒光染料ICG代替藥物進行脂質體的體內生物分布研究，Balb/c小鼠購進后適應性喂養1周，將處于對數生長期的4T1細胞以3×105個/100 μL接種于小鼠第2乳腺墊皮下，建立小鼠乳腺癌原位模型。待腫瘤生長至200 mm3時，隨機分為2組，靜脈給予1 μg/mL的ICG Lip與游離ICG，分別于1、2、4、6、8、10、24、48 h置于活體成像儀拍攝。待小鼠體內熒光染料完全清除后（大于72 h），再次通過尾靜脈給予相同劑量的ICG@Lip與游離ICG，于8 h時處死小鼠，解剖出心、肝、脾、肺、腎及腫瘤組織，采用4%多聚甲醛固定，進行離體成像，分析各組織中ICG的熒光強度。結果見圖9，隨著時間的推移，游離ICG組中腫瘤部位的ICG熒光強度逐漸減弱且下降速度較快，24 h時熒光幾乎完全消失。而ICG@Lip組的ICG熒光強度下降速度相對緩慢，且從4 h起顯著高于游離ICG組，甚至在48 h時仍舊保留部分熒光。

圖7 GR@Lip對Pan02 (A)、U14 (B) 及4T1 (C) 細胞中自噬相關蛋白LC3B和Beclin1表達的影響

圖8 血藥濃度-時間曲線(, n = 3)

心、肝、脾、肺、腎和腫瘤組織的離體成像結果顯示，ICG@Lip組在腫瘤部位的熒光明顯強于游離ICG組。上述結果顯示，與游離ICG相比，ICG@ Lip可更長時間富集于腫瘤部位，表明脂質體可通過被動靶向改善藥物在體內的分布，增強腫瘤靶向性，增加蓄積量，這可能依賴于納米顆粒的高通透性和滯留（enhanced permeability and retention effect，EPR）效應。

表19 主要藥動學參數(, n = 3)

與游離雷帕霉素比較：*＜0.05**＜0.01***＜0.001。

*< 0.05**＜0.01***< 0.001free rapamycin.

3 討論

脂質體制備方法通常包括溶劑注入法、薄膜水化法和逆向蒸發法等。本研究首先考察了3種不同制備方法對GR@Lip包封率、載藥量及粒徑的影響，確定薄膜水化法為GR@Lip的最佳制備方法，并進一步通過單因素實驗和正交設計試驗進行篩選，得到了最優的處方工藝，實現了2藥的高效包載。然而，薄膜水化法制備所得脂質體通常粒徑較大且不均一[12]，影響脂質體的穩定性，而脂質體的穩定性決定了其在體內的循環時間與到達作用靶點的藥物量，從而對藥物的治療效果產生重要影響[13]。因此，在水化后采用超聲破碎方式使脂質體的平均粒徑控制在200 nm以內，能在30 d內維持粒徑和PDI基本不變化，改善了該制備方法的不足，并通過考察滲漏率和磷脂氧化程度證明了其具有良好的穩定性。此外，在藤黃酸檢測方法[14]的基礎上進行了改進，建立了一種準確度高、可靠性強的HPLC分析方法，可用于同時檢測藤黃酸和雷帕霉素的含量。

A-不同時間點下荷瘤小鼠的活體熒光圖；B-8 h后離體臟器及腫瘤熒光圖；C-腫瘤部位熒光強度隨時間變化曲線(, n = 3, *P＜0.05 ***P＜0.001)。

實體瘤具有高度異質性，單一藥物的療效有限，加大藥物劑量易帶來不良反應以及多藥耐藥性等問題[15]，聯合療法可以通過作用不同通路以及不同靶點，減少耐藥的發生，并可通過藥物的協同作用進一步提高藥物療效。基于腫瘤病理復雜性，抗腫瘤藥物聯合使用已成為臨床上的主要策略[16]。本研究將天然化合物藤黃酸與mTOR抑制劑雷帕霉素聯用，實現了協同抗胰腺癌、宮頸癌及乳腺癌的作用，與空白對照及單藥組相比，GR@Lip在誘導凋亡、抑制遷移和侵襲方面均展現出顯著優勢。此外，研究表明自噬在控制癌癥的發生發展，影響腫瘤細胞對抗癌治療反應中發揮著重要的作用，誘導腫瘤細胞自噬已被證明是有效的干預措施[17]。雷帕霉素作為一種經典的自噬激活劑，可負性調控PI3K/Akt/ mTOR通路，激活自噬介導的死亡。研究表明，藤黃酸也能夠通過上調自噬蛋白Beclin1、Atg和LC3的表達，誘導自噬小體的形成[18]。

此外，大量證據表明Akt/mTOR信號通路的抑制可激活自噬關鍵調節因子Beclin1[19]，這表明藤黃酸可能上調Beclin1和LC3B的表達協同雷帕霉素抑制Akt/mTOR信號通路，從而增強腫瘤細胞自噬。本研究結果也證實藤黃酸和雷帕霉素可協同促進腫瘤細胞產生自噬。有研究報道，雷帕霉素可誘導細胞產生自噬性凋亡[20]，雷帕霉素單獨使用時，腫瘤細胞僅發生少量凋亡，聯合應用時凋亡率顯著增加。這提示藤黃酸聯合雷帕霉素對腫瘤細胞的凋亡作用可能是通過協同增強自噬介導的，但具體機制需要后續的實驗進一步研究。

綜上，本研究采用薄膜水化法制備藤黃酸和雷帕霉素共載脂質體GR@Lip，并進行體外抗腫瘤作用、體內藥代動力學及生物分布研究。結果表明GR@Lip在胰腺癌、宮頸癌及乳腺癌細胞模型上可通過抑制腫瘤細胞增殖、誘導凋亡、抑制遷移和侵襲以及激活自噬等多種途徑發揮協同抗腫瘤作用，與游離藥物相比在體內和腫瘤部位可滯留更長時間，顯示出用于治療惡性腫瘤的潛力，為后續體內抗腫瘤研究奠定了基礎。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Preparation of gambogic acid and rapamycin co-loaded liposomes and study on the synergistic antitumor effect

DING Huanhuan1, 2, JIANG Xianmei2, 3, LIU Hongmei2, 3, QI Yao2, 3, TU Kerong2, 3, CHEN Lin1, CAI Lulu2, 3, ZHOU Xianli1

1. School of Life Science and Engineering, Southwest Jiaotong University, Chengdu 610031, China 2. Department of Pharmacy, Sichuan Academy of Medical Sciences & Sichuan Provincial People’s hospital, Chengdu 610072, China 3. Personalized Drug Therapy Key Laboratory of Sichuan Province, School of Medicine, University of Electronic Science and Technology of China, Chengdu 610072, China

To prepare liposomes co-loaded with gambogic acid and rapamycin (GR@Lip), optimize its prescription, perform anti-tumor mechanism research, pharmacokinetics and biodistribution.The entrapment efficiency, drug loading, particle size were used as evaluation indicators. Single factor investigation method and orthogonal design experiments were used to optimize the optimum formulation of GR@Lip, and its characterization and stability were studied. The effects of GR@Lip on the proliferation and apoptosis of tumor cells were investigated by CCK-8 and flow cytometry. The effects of GR@Lip on the migration and invasion of tumour cells were investigated by cell scratching, Transwell. The effects of GR@Lip on the autophagy of tumour cells were investigated by transmission electron microscope (TEM) and immunofluorescence. The effects of GR@Lip on the pharmacokinetics and biodistributionwere investigated by liquid chromotography with mass spectrometry (LC-MS) and living body imager.The optimal conditions were determined as follows: temperature is 40 ℃, ratio of drug to lipid is 1:1:20, the phospholipid-cholesterol ratio is 4:1, ultrasonic power is 195 W, ultrasonic time is 5 min, hydration medium is ultrapure water and aqueous pH value is 7.1. The entrapment efficiency and drug loading of gambogic acid and rapamycin were (97.27 ± 2.76)%, (96.58 ± 3.82)%, (3.29 ± 0.44)% and (4.91 ± 0.44)%, respectively. GR@Lip showed a spherical under TEM with an average particle size of (157.19 ± 1.74) nm, ζ potential was (?22.1 ± 1.3) mV by dynamic light scattering (DLS), and had good stability.anti-tumor activity experiment showed that gambogic acid combination rapamycin can inhibit the proliferation, migration and invasion of tumor cells, and also significantly promote apoptosis and autophagy. In addition, pharmacokinetics and biodistribution resultsshowed that GR@Lip can remain for long time and had good tumor targeting.This study successfully prepare GR@Lip, revealing that it has synergistic anti-tumor activity through multiple pathways, and significantly improving the pharmacokinetic behavior of gambogic acid and rapamycin, providing a basis for furtherresearch and future clinical applications.

gambogic acid; rapamycin; co-loaded liposomes; anti-tumor; drug combination;pharmacokinetics;biodistribution;proliferation; apoptosis; migration; invasion; autophagy

R283.6

A

0253 - 2670(2024)09 - 2896 - 16

10.7501/j.issn.0253-2670.2024.09.005

2023-10-10

國家自然科學基金項目（U2230123）；國家自然科學基金項目（82304969）；國家自然科學基金項目（82304789）；國家自然科學基金項目（81972901）；四川省科技項目（2022ZYD0080）；四川省科技項目（2023YFS0110）；四川省科技項目（2023YFS0131）；四川省科技項目（2023YFS0125）；四川省科技項目（2023NSFSC0033）；中國博士后科學基金（2022M710623）；中國博士后科學基金（2022M720670）

丁歡歡，碩士研究生，研究方向為藥劑學。E-mail: 2467091987@qq.com

通信作者：周先禮，教授，研究方向為天然藥物化學。E-mail: zhouxl@swjtu.edu.cn

蔡璐璐，教授，研究方向為腫瘤靶向藥物制劑研究。E-mail: cailulu@med.uestc.edu.cn

[責任編輯 鄭禮勝]