磷脂酶A2 氨基末端衍生肽的合成及其抗細菌活性的研究

安 娜 李 艷 廖柳鳳 梁寧生

廣西醫科大學附屬腫瘤醫院臨床藥學科，廣西南寧 530021

目前，多重耐藥菌已經廣泛分布全世界各地，研究表明，我國革蘭氏陰性桿菌的耐藥高于革蘭氏陽性球菌及真菌，甚至有些對碳青霉烯類抗菌藥物出現了耐藥[1-5]。抗菌肽是廣泛存在于生物體內的天然多肽，其具有廣譜抗菌等特點[6-8]。人們相繼從高等動植物中分離獲得抗菌肽，并發現抗菌肽對部分細菌、真菌、病毒及癌細胞等均具有強有力的殺傷作用[9-10]。大量的文獻報道這些分子是高度特異性的抗微生物化合物，極具成為新型抗菌藥物的潛力[11-15]。因此，對抗菌肽的殺菌活性研究逐漸成為熱點。磷脂酶A2（phospholipase A2，PLA2）是一類能夠參與水解磷脂sn-2 鍵的酶，具有抗菌、抗感染、抗腫瘤等多種生物活性[16-17]。近年來，越來越多的研究表明，PLA2氨基末端衍生肽在抗細菌感染方面具有重要作用[18-20]。為了進一步探討其抗細菌活性的機制，本文研究了PLA2氨基末端衍生肽的合成及其抗細菌活性。

1 材料與方法

1.1 PLA2 氨基端肽PLA2N11、PLA2N15、PLA2N20 的合成

①材料準備：細胞培養液（批號：2010060303）、血清（批號：19110502）、胰蛋白酶（批號：2009240202）、膠原蛋白酶（批號：9001121）等，上述試劑均由浙江森瑞生物科技有限公司提供。②細胞培養：將細胞培養在適當的條件下，待細胞生長到所需密度后，加入胰蛋白酶和膠原蛋白酶進行消化。③提取PLA2：將消化后的細胞離心，取上清液，加適量硫酸銨溶液沉淀。沉淀物即為PLA2。④氨基端肽的制備：將PLA2溶解在緩沖液中，加入胰蛋白酶水解，得到氨基端肽。⑤純化氨基端肽：將水解產物進行離子交換和凝膠過濾色譜，得到純化的氨基端肽。在Fmoc 固相合成法中α-氨基用Fmoc 保護基（圖1）進行保護，側鏈則采用Boc作為保護基。所有的抗菌肽均由上海波泰生物科技有限公司根據本研究的設計合成。

圖1 Fmoc 固相合成法合成多肽機制與工藝流程

圖2 PLA2 氨基末端衍生肽質譜圖

1.2 PLA2N11、PLA2N15、PLA2N20 的殺菌實驗

1.2.1 儀器Thermo 420 型恒溫氣浴搖床為美國Thermo Electron 公司產品；J3-NAPCO-5410 型二氧化碳培養箱購自克勒格瓦尼（上海）分析儀器有限公司；微量加樣器1 000、200、50、10 μl 各1 支購自日本NICIRYO公司；pH 計購自美國ORION Research 公司；HWS-20恒溫水浴箱購自江蘇太倉市實驗設備廠；漩渦振蕩器購自江蘇海門市麒麟醫用儀器廠；Anke TGL-16C 臺式離心機購自上海安亭科學儀器廠；Hettic 臺式高速冷凍離心機320/320R 購自德國Hettic 公司；TU-1810S紫外分光光度計購自北京普析通用儀器有限公司；Techcompvis7200 可見分光光度計購自上海天美科學儀器有限公司。

1.2.2 細菌標準株 革蘭氏陽性菌：枯草桿菌（ATCC 63501）；一種革蘭氏陰性菌：大腸埃希菌（ATCC44113）。以上標準菌株均來自廣西醫科大學微生物學教研室。

1.2.3 藥品與試劑①上海波泰生物科技有限公司合成的PLA2氨基末端11、15、20 個氨基酸殘基的多肽PLA2N11（批號：10081311，純度≥95%）、PLA2N15（批號：10101326，純度≥98%）、PLA2N20（批號：10101479，純度≥98%）。②4-羥乙基哌嗪乙磺酸（Hepes，批號：230-907-9）和1%小牛血清白蛋白（BSA，批號：A8010）購自北京Solarbio 公司。③LB 培養基粉（批號：1009533）及LB 營養瓊脂（批號：100127）購自生物工程（上海）有限公司。④RPMI 1640（批號：970810）購自GIBCOBRL 公司。

1.3 殺菌實驗方法

采用瓊脂鋪板計數法。①細菌培養：取過夜的枯草桿菌和大腸埃希菌按照1∶50 的比例加入3 ml 的新鮮LB 培養液中，置于37℃的恒溫搖床孵育2.5 h，達到對數生長期。②菌液制備：室溫下1 000 r/min 離心45 s 后收集細菌，用生理鹽水洗滌細菌并再次離心，棄上清液，將所得細菌沉淀物溶于500 μl 滅菌生理鹽水。③實驗分組：制備RPMI-1640 反應體系，依次將10 μl 細菌和10 μl 多肽（實驗組，其作用濃度分別為7.81、31.25、125.00、500.00 μg/ml）或生理鹽水（對照）加入80 μl 反應體系中，混勻，置于37℃的恒溫水浴鍋中2h。④計算殺菌率：2h 后取出反應液40μl，以滅菌生理鹽水進行10 倍稀釋，保存于無菌培養皿中，加入LB 營養瓊脂6 ml 搖勻，37℃恒溫箱中過夜培養。殺菌率=（1-實驗組菌落形成單位）/對照菌落形成單位×100%。合成后進行純度檢測、分子量檢測及穩定性檢測。

1.4 統計學方法

采用SPSS 25.0 統計學軟件進行數據處理。采用origin 8.0 進行圖像繪制，計量資料采用均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PLA2 氨基末端衍生肽的一級結構特點

PLA2N11含有2 個堿性氨基酸（2 個賴氨酸），該蛋白質具有兩個正電荷的側鏈基團。氨基酸之間通過肽鍵相連，形成了肽鏈。PLA2N15含有4 個堿性氨基酸；與PLA2N11比較，PLA2N15具有更多的堿性氨基酸，具有更多的正電荷側鏈基團。PLA2N15的第一個特點在于其豐富的脯氨酸和賴氨酸。PLA2N15中谷氨酸和天冬氨酸含量較高。PLA2N20含有7 個堿性氨基酸（4 個賴氨酸，2 個精氨酸，1 個組氨酸），PLA2N20具有更多的堿性氨基酸，正電荷側鏈基團更強。PLA2N11、PLA2N15、PLA2N20均不含酸性氨基酸。此外，疏水性氨基酸比例較高，PLA2N20可達到0.600。PLA2N11、PLA2N15、PLA2N20質譜圖。見圖2。

2.2 多 肽PLA2N11、PLA2N15、PLA2N20對枯草桿菌殺菌活性比較

與對照比較，多肽PLA2N11、PLA2N15、PLA2N20對革蘭氏陽性菌枯草桿菌殺菌活性更強，各多肽間比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；當多肽作用濃度為500.00 μg/ml 時，PLA2N15對枯草桿菌殺菌率可達99.8%，高于PLA2N11、PLA2N20，及對照（P＜0.05）。見表1。

表1 多肽PLA2N11、PLA2N15、PLA2N20 對枯草桿菌殺菌活性比較（%，，n=4）

表1 多肽PLA2N11、PLA2N15、PLA2N20 對枯草桿菌殺菌活性比較（%，，n=4）

注 與對照比較，aP＜0.05；與PLA2N11 比較，bP＜0.05；與PLA2N15 比較，cP＜0.05。PLA2：磷脂酶A2。

2.3 多 肽PLA2N11、PLA2N15、PLA2N20對大腸埃希菌殺菌活性比較

與對照比較，各多肽不同作用濃度時對大腸埃希菌殺菌活性比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；多肽作用濃度為7.81、125.00、500.00 μg/ml 時，PLA2N15的殺菌活性均高于PLA2N11和PLA2N20（P＜0.05）；多肽作用濃度為31.25 μg/ml 時，PLA2N15的殺菌活性低于PLA2N11的殺菌活性，且高于PLA2N20的殺菌活性（P＜0.05）。見表2。

表2 多肽PLA2N11、PLA2N15、PLA2N20 對大腸埃希菌殺菌活性比較（%，，n=4）

表2 多肽PLA2N11、PLA2N15、PLA2N20 對大腸埃希菌殺菌活性比較（%，，n=4）

注 與對照比較，aP＜0.05；與PLA2N11 比較，bP＜0.05；與PLA2N15 比較，cP＜0.05。PLA2：磷脂酶A2。

3 討論

抗菌肽通過靜電吸引力與細菌細胞膜帶負電荷的磷脂結合，引起膜破裂，最終導致細菌死亡[21]。本研究的殺菌試驗選擇了枯草桿菌和大腸埃希菌，結果表明，當作用濃度為500.00 μg/ml 時PLA2N15對枯草桿菌、大腸埃希菌的殺菌率分別為99.8%、56.4%，優于PLA2N11、PLA2N20。關于PLA2N15在動物或人體內的使用濃度需要進一步的科學研究和實驗驗證。在動物或人體內，藥物濃度受到許多因素的影響，包括藥物的吸收、分布、代謝和排泄等。因此，預測PLA2N15在人體內的濃度需要基于藥代動力學模型和相關參數的測定。需要注意的是，藥物在體內的濃度并不是越高越好，而是需要在達到治療效果的同時，避免出現不良反應。結合本研究的結果，多肽的抗菌活性與其攜帶的凈正電荷及堿性氨基酸數量的密切相關，但不一定是正相關。部分抗菌肽表現出隨正電荷適當增加而殺菌活性增強，其可能原因是抗菌肽與細菌之間的靜電吸引力增強[22-23]。

在確定合成肽的抗細菌活性過程中，需要進行大量的細菌培養和藥敏實驗。盡管面臨挑戰，但此研究仍具有明顯的優勢，通過合成PLA2氨基末端衍生肽，有可能開發出一種全新的抗細菌感染策略，對于解決日益嚴重的抗菌藥物耐藥性問題具有重要意義[24]。但該研究也存在一定的局限，實驗成本較高，實驗周期較長。另外盡管在實驗室內合成的肽可能具有抗細菌活性，但在臨床轉化為實際治療手段的過程中可能面臨諸多挑戰，例如安全性、有效性、生產成本等問題。

目前，隨著抗生素在臨床應用的增加，耐藥問題越來越突出。抗菌肽則具有殺菌快速、抗菌譜廣、毒副作用小、無免疫原性等優點。且由于其特殊的殺菌機制，被抑制或殺滅的病原性微生物不會產生抗性菌株，不會由于耐藥性而減弱殺滅細菌的作用[25]。隨著技術的不斷發展和研究的不斷深入，最終這些困難會得到克服。期待更多具有很好抗菌活性的抗菌肽不斷出現，為人類抵抗多重耐藥菌提供一道防線。

利益沖突聲明：本文所有作者均聲明不存在利益沖突。