基于數據挖掘技術探討細胞分裂周期相關蛋白在肝細胞癌中的表達及對預后的影響

姚夢礎 徐建波 謝 宇▲

1.江蘇省淮安市第一人民醫院腫瘤內科，江蘇淮安 223300；2.江蘇省淮安市第一人民醫院肝膽外科，江蘇淮安 223300

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）在中國年新發病例38.9 萬，居惡性腫瘤第4 位，而年死亡病例達33.6 萬，居第2 位，疾病負擔沉重[1]。乙型或丙型肝炎病毒感染、酒精濫用和非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）等是HCC 的主要危險因素[2]。但HCC 發生和發展的分子機制尚不明確，因此研究識別新的HCC 分子標志物有助于HCC的早期診斷和治療[3]。

細胞快速生長和分裂是惡性腫瘤主要特征之一[4]。細胞周期調控蛋白異常表達對包括HCC 在內的惡性腫瘤的發生、發展起著重要作用[5-6]。而作為細胞周期調控蛋白之一的細胞分裂周期相關蛋白（cycle division cycle-associated protein，CDCA）家族由8 個成員組成，在細胞增殖過程中發揮重要作用，且與多種腫瘤密切相關[7-10]。本研究基于TCGA 數據庫分析了HCC患者的cDNA 基因表達譜，評估CDCA 在HCC 中的表達特征及不同的表達水平與預后的關系，單因素及多因素Cox 模型分析影響HCC 預后的因素。本研究豐富了CDCA 與肝癌的關系研究，并明確了影響肝癌生存獨立危險因素，以期為探索HCC 的發生、發展、預后判斷等提供依據。

1 材料與方法

1.1 數據庫及數據篩選

從TCGA 數據庫（http：//cancergenome.nih.gov/）下載HCC 編碼蛋白基因數據及相應臨床數據，通過RSEM 標準化。納入肝癌及正常肝組織所有基因表達數據完整的病例，排除臨床病理信息及無復發生存時間、總體生存時間（overall survival，OS）數據不完整的病例，最終納入分析266 例HCC 組織及50 例正常肝組織樣本，以HCC 組織CDCA 表達水平的中位數為標準分組，其中CDCA1 為6.82，CDCA2 為5.32，CDCA3 為6.97，CDCA4 為7.19，CDCA5 為7.95，CDCA6為6.41，CDCA7 為4.35，CDCA8 為7.42。均以CDCA基因表達量≥中位數的患者為高表達組（133 例），否則為低表達組（133 例）。

1.2 免疫組織化學染色

選取江蘇省淮安市第一人民醫院2019 年6 月至2020 年6 月經病理診斷的HCC 組織及相對應的癌旁組織樣本24 例，采用隨機數字表法將其分為8 組，每組3 對HCC 及癌旁組織。本研究經江蘇省淮安市第一人民醫院倫理委員會審批（YX-P-2019-023-01）。

試劑和主要儀器：CDCA1（英國abcam 公司，貨號：ab230313）；CDCA2（英國abcam 公司，貨號：ab214289）；CDCA3（美國Proteintech 公司，貨號：15594-1-AP）；CDCA4（英國abcam 公司，貨號：ab192237）；CDCA5（美國Proteintech 公司，貨號：67418-1-Ig）；CDCA6（美國Proteintech 公司，貨號：15579-1-AP）；CDCA7（美國Proteintech 公司，15249-1-AP）；CDCA8（美國Proteintech 公司，貨號：12465-1-AP）；顯微鏡（尼康株式會社，ECLIPSE 50i）和分析軟件（NIS-Elements v4.0）。

采用免疫組織化學染色法觀察：HCC 及癌旁組織石蠟切片分別經脫蠟、脫水，枸櫞酸緩沖液（pH=6.0），微波爐抗原修復（高火10 min，低火10 min）自然冷卻；PBS 沖洗3 次，3%H2O2滅活內源性過氧化物酶10 min，PBS 沖洗3 次，小牛血清封閉10 min，甩干。加相應一抗，以PBS 緩沖液代替一抗作為陰性對照，4 ℃孵育過夜，次日37 ℃水浴箱復溫45 min；滴加羊抗兔二抗工作液，室溫孵育10 min；新鮮配制的DAB 避光顯色；梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片。在光學顯微鏡下觀察。

1.3 統計學方法

采用SPSS 25.0 統計學軟件及GraphPad Prism 軟件（版本5）進行數據分析。計量資料采用均數±標準差（）表示，比較采用t 檢驗；計數資料采用例數或百分率表示，比較采用χ2檢驗；采用Cox 比例風險回歸模型分析HCC 患者預后獨立危險因素。采用Kaplan-Meier 法進行生存分析，采用log-rank χ2檢驗比較組間OS 差異。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HCC 患者的一般資料

266 例HCC 患者中男177 例，女89 例；年齡：＜65 歲151 例，≥65 歲115 例；組織學分級：低級別170 例，高級別96 例；T 分期：T1期140 例，T2期70例，T3期48 例，T4期8 例；TNM 分期：Ⅰ期138 例，Ⅱ期69 例，Ⅲ期56 例，Ⅳ期3 例；血管侵犯169 例，未侵犯97 例。

2.2 CDCA 在數據庫HCC 組織中的表達

與正常肝組織比較，CDCA1～8 在HCC 組織中表達水平升高（P＜0.001）。見圖1。

圖1 CDCA 在HCC 組織與正常肝組織中表達情況

2.3 CDCA 在臨床HCC 組織中的表達

臨床HCC 組織中CDCA1-8 的表達水平高于癌旁組織。見圖2。

圖2 免疫組織化學染色觀察肝細胞癌組織及其癌旁組織中細胞分裂周期相關蛋白表達（40×）

2.4 生存分析和多變量分析

CDCA1/2/5/6/8 高表達組總生存率低于低表達組（P＜0.05）。見圖3。

圖3 CDCA1～8 表達高、低兩組HCC 患者生存分析

2.5 單因素和多因素Cox 回歸分析OS 與CDCA 表達水平及臨床病理特征的關系

Cox 單因素分析結果顯示，年齡、腫瘤大小分期（T3/T4）、TNM 分期（Ⅲ期）和CDCA1/2/3/5/6/8 與OS 相關（P＜0.05）。性別：男=1，女=2；病理分級：中低級別=1，高級別=2；血管侵犯：無侵犯=1，有侵犯=2；T 分期與TNM 分期：Ⅰ期=1，Ⅱ期=2，Ⅲ期=3，Ⅳ期=4。多因素Cox 回歸分析結果顯示，CDCA6、CDCA8、年齡、腫瘤大小分期T3/T4是HCC OS 的獨立預測因子（P＜0.05）。見表1。

表1 HCC 患者總生存率的單因素與多因素分析

3 討論

細胞分裂和自主生長功能障礙是包括HCC 在內的惡性腫瘤的重要標志，對腫瘤的發生、進展和預后有很大影響[11-12]。因此，發掘新的、有效的生物標志物將有利于HCC 的治療及對預后的判斷。CDCA 在多種惡性腫瘤中存在異常表達。如CDCA5 在結腸癌及乳腺癌，CDCA7 在卵巢癌，CDCA3 在腎癌，CDCA1～8在肺癌及頸部鱗狀細胞中表達明顯升高[13-18]。本研究基于數據挖掘技術，探討CDCA 在肝細胞癌中的表達及對預后的影響。結果發現，與正常肝組織比較，HCC組織中CDCA 表達升高，且臨床標本免疫組織化學提示相同的結果。

CDCA 在惡性腫瘤中的高表達往往意味患者更短的生存時間。如乳腺癌及結腸癌中CDCA5 高表達者OS 更短[13-14]。卵巢癌中CDCA7 表達增高患者生存時間更短[15]。肺癌中CDCA8 高表達患者其OS 更短[19]。在子宮內膜癌中，CDCA1/2/3/4/5/8 高表達總體預后更差[20]。本研究通過比較CDCA 高低表達組之間OS 的差異，結果顯示，CDCA1/2/5/6/8 高表達患者OS 更短，提示大部分CDCA 表達水平可以作為肝癌患者生存預后的潛在指標之一。

細胞周期中主要有G1～S、S 期和G2～M3期3 個檢查點，它們可為修復DNA 損傷提供時間，維持遺傳穩定性[21]。目前已有報道CDCA2、CDCA3 和CDCA6 參與DNA 復制、G1～S 期轉換和CDK 抑制蛋白抑制，并在人鱗狀細胞癌、口腔癌等中過表達[18，22-23]。CDCA3 可以與Skp1 和cullin 結合，從而影響SCF 復合體對CDK 抑制蛋白泛素化來調節G1/S 期過渡[22]。此外，Wee1 作為一種重要的有絲分裂抑制劑，CDCA3 通過介導Wee1 的降解在G2期發揮作用[24]。CDCA6 可能與前列腺癌的DNA 復制和細胞有絲分裂有關[25]。本研究中單因素及多因素Cox 分析發現，CDCA1/2/3/5/6/8表達水平、肝癌大小、年齡與患者預后密切相關，且CDCA6/8、年齡，腫瘤大小分期（T3/T4）是HCC OS 的獨立預測因子，提示CDCA 與HCC 的增殖密切相關，促進腫瘤增殖進展。

本研究結果顯示，CDCA6/8 是判定HCC 進展和預后的重要生物標志物，為研發作用于CDCA6/8 的治療HCC 靶向藥物提供了有價值的數據支撐。然而，本研究僅探討了CDCA 不同表達量與HCC 的相關性，尚未闡明其促進HCC 發展的分子機制，需在今后進一步深入研究。

利益沖突聲明：本文所有作者均聲明不存在利益沖突。