羅氟普蘭對(duì)噪聲性耳鳴小鼠海馬NOD 樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3、胱天蛋白酶-1、白細(xì)胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α 的影響

林世童 羅麗霞 胡玉琳 農(nóng)豐靖 杜政徳 劉 津

1.右江民族醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，廣西百色 533000；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，北京 100000；3.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，廣西百色 533000

目前，臨床中耳鳴的發(fā)病率逐漸上升，可引起情緒化損害[1-2]。研究顯示，邊緣系統(tǒng)與聽覺中樞存在解剖與功能學(xué)聯(lián)系[3-4]。機(jī)體受刺激后小膠質(zhì)細(xì)胞活化分泌白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等炎癥因子[5]。羅氟普蘭可抑制炎癥因子活化，本研究通過建立無明顯聽力損失的噪聲性耳鳴動(dòng)物模型，觀察羅氟普蘭對(duì)海馬NOD 樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）、胱天蛋白酶1（cysteine aspartic acid specific protease-1，caspase-1）、IL-1β、TNF-α 的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來源及分組

選取24 只無特定病原體C57BL/6J 雄性小鼠，6～8 周齡，體重18～20 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。動(dòng)物合格證號(hào)：NO.44829700 006950；動(dòng)物許可證號(hào)為：SCXK（粵）2022-0063。采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為對(duì)照組、噪聲暴露組、羅氟普蘭干預(yù)組、羅氟普蘭耳毒性檢測(cè)組，各6 只。本研究相關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查由右江民族醫(yī)學(xué)院科技處進(jìn)行（2022111301）。

1.2 主要儀器與試劑

信號(hào)發(fā)生器（北京聲望聲電技術(shù)有限公司，MiniratorMR2）；聲級(jí)計(jì)（北京聲望聲電技術(shù)有限公司，BSWA 308）；音響（EON615 HARMAN International）；驚跳反射實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（ENV-022S Med Assocites）。

1.3 研究方法

1.3.1 造模方法及藥物耳毒性檢測(cè) 噪聲暴露組和羅氟普蘭干預(yù)組通過100 dB 寬帶白噪聲單次暴露2 h造模，羅氟普蘭干預(yù)組、羅氟普蘭耳毒性檢測(cè)組連續(xù)注射7 d 羅氟普蘭[1 mg/（kg·d）]，噪聲暴露組、對(duì)照組連續(xù)注射7 d 等量生理鹽水。

1.3.2 聽性腦干反應(yīng)（auditory brainstem response，ABR）檢測(cè) 四組于干預(yù)前后進(jìn)行ABR，檢測(cè)4、6、8 kHz 為測(cè)聽頻率點(diǎn)，從80 dB 開始，以20 dB 為1 個(gè)單位遞減，引出的Ⅲ波最小聲音刺激強(qiáng)度為ABR反應(yīng)閾。

1.3.3 耳鳴行為學(xué)檢測(cè) 采用間歇前抑制驚跳反射抑制率（gap prepulse inhibition of acoustic startle response inhibition ratio，GPIAS%）實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)檢測(cè)。測(cè)試前自適應(yīng)5 min，采用驚跳反射實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)試，GPIAS%=（無前間隔刺激時(shí)誘發(fā)的驚跳反射波幅-有前間隔刺激時(shí)誘發(fā)的驚跳反射波幅）/無前間隔刺激時(shí)誘發(fā)的驚跳反射波幅×100%[7]。

1.4 耳蝸基底膜熒光染色

干預(yù)后取四組的耳蝸置于10%乙二胺四乙酸溶液中，4 ℃儲(chǔ)存。體視顯微鏡下，取耳蝸基底膜，0.01 mmol/L磷酸緩沖鹽溶液浸泡，4 ℃保存。10%山羊血清封閉1 h，4 ℃過夜一抗（1∶50）孵育，沖洗3 次，熒光二抗488（1∶100）避光室溫孵育1 h，滴加防淬滅劑，封片。

1.5 NLRP3、caspase-1、IL-1β、TNF-α mRNA 及蛋白水平檢測(cè)

1.5.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 干預(yù)后取對(duì)照組、噪聲暴露組、羅氟普蘭干預(yù)組海馬置于液氮中，-80 ℃保存，提取海馬總RNA，測(cè)RNA 濃度，合成cDNA，反應(yīng)條件：37 ℃2 min，55 ℃15 min，85 ℃5 min。產(chǎn)物稀釋進(jìn)行熒光定量PCR 檢測(cè)，以β-actin 為內(nèi)參，擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性10 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，40 個(gè)循環(huán)。反應(yīng)體系：2×實(shí)時(shí)定量PCR 擴(kuò)增的預(yù)混合溶液30.0 μl，雙蒸水21.6 μl，模板DNA/cDNA 6.0 μl，正向引物（10μmol/L）1.2μl，反向引物（10μmol/L）1.2 μl。引物序列見表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 引物序列

1.5.2 蛋白質(zhì)印跡法 取對(duì)照組、噪聲暴露組、羅氟普蘭干預(yù)組海馬研磨，提取蛋白，檢測(cè)濃度。分離膠10%和12.5%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離目的蛋白，轉(zhuǎn)印至PVDF 膜，室溫封閉2 h，一抗（1∶1 000）稀釋后4 ℃過夜，洗膜3 次，室溫孵育二抗1.5 h，顯影，Image J 軟件分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較采用t 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四組ABR 檢測(cè)結(jié)果

干預(yù)前比較，四組ABR 反應(yīng)閾無明顯改變。見圖1。

圖1 四組聽性腦干反應(yīng)檢測(cè)結(jié)果

2.2 四組GPIAS%比較

噪聲暴露組GPIAS%低于對(duì)照組，羅氟普蘭干預(yù)組GPIAS%高于噪聲暴露組（P＜0.05）。羅氟普蘭耳毒性檢測(cè)組GPIAS%與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 四組GPIAS%比較（）

表2 四組GPIAS%比較（）

注 與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與噪聲暴露組比較，bP＜0.05。GPIAS%：間歇前抑制驚跳反射抑制率。

2.3 四組耳蝸基底膜毛細(xì)胞鋪片染色結(jié)果

耳蝸基底膜鋪片免疫熒光染色結(jié)果顯示，四組內(nèi)外毛細(xì)胞均排列整齊，未見明顯異常。見圖2。

圖2 四組耳蝸基底膜毛細(xì)胞鋪片熒光染色結(jié)果（40×）

2.4 對(duì)照組、噪聲暴露組、羅氟普蘭干預(yù)組NLRP3、caspase-1、IL-1β、TNF-α mRNA 表達(dá)量比較

圖3 對(duì)照組、噪聲暴露組、羅氟普蘭干預(yù)組NLRP3、caspase-1、IL-1β、TNF-α 蛋白條帶圖

噪聲暴露組NLRP3、caspase-1、IL-1β、TNF-α mRNA 表達(dá)量均高于對(duì)照組，羅氟普蘭干預(yù)組低于噪聲暴露組（P＜0.05）。見表3。

表3 對(duì)照組、噪聲暴露組、羅氟普蘭干預(yù)組NLRP3、caspase-1、IL-1β、TNF-α mRNA 表達(dá)量比較（）

表3 對(duì)照組、噪聲暴露組、羅氟普蘭干預(yù)組NLRP3、caspase-1、IL-1β、TNF-α mRNA 表達(dá)量比較（）

注 與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與噪聲暴露組比較，bP＜0.05。IL-1β：白細(xì)胞介素-1β；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；caspase-1：胱天蛋白酶-1；NLRP3：NOD 樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3。

2.5 對(duì)照組、噪聲暴露組、羅氟普蘭干預(yù)組NLRP3、caspase-1、IL-1β、TNF-α 蛋白水平比較

噪聲暴露組NLRP3、caspase-1、IL-1β、TNF-α 蛋白水平均高于對(duì)照組，羅氟普蘭干預(yù)組低于噪聲暴露組（P＜0.05）。見圖3、表4。

表4 對(duì)照組、噪聲暴露組、羅氟普蘭干預(yù)組NLRP3、caspase-1、IL-1β、TNF-α 蛋白水平比較（）

表4 對(duì)照組、噪聲暴露組、羅氟普蘭干預(yù)組NLRP3、caspase-1、IL-1β、TNF-α 蛋白水平比較（）

注 與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與噪聲暴露組比較，bP＜0.05。IL-1β：白細(xì)胞介素-1β；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；caspase-1：胱天蛋白酶-1；NLRP3：NOD 樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3。

3 討論

耳鳴動(dòng)物模型構(gòu)建有飲水抑制法、聲音驚嚇刺激法[8]。經(jīng)典造模方法效率低、成本高[9]。噪聲已成為世界衛(wèi)生組織定義的七大危害之一，受干擾人群以青少年和大學(xué)生為主，耳鳴呈年輕化趨勢(shì)[10-12]。

本研究建立的噪聲性耳鳴動(dòng)物模型，是基于大量文獻(xiàn)支撐和課題組前期實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)，噪聲暴露后7 d 耳鳴更穩(wěn)定[13-14]。耳鳴行為學(xué)檢測(cè)是利用動(dòng)物受到驚嚇刺激后本能反應(yīng)為基礎(chǔ)，結(jié)果可靠[15]。經(jīng)驗(yàn)證，此方法可建立無聽力下降的噪聲性耳鳴動(dòng)物模型。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，羅氟普蘭干預(yù)組和羅氟普蘭耳毒性檢測(cè)組均未見明顯異常，提示羅氟普蘭無耳毒性。NLRP3 可驅(qū)動(dòng)小膠質(zhì)細(xì)胞分泌IL-1β，主要功能通過激活細(xì)胞因子分泌感知、放大和傳播促炎信號(hào)[16]。NLRP3 活化后可使caspase-1 活化并激活I(lǐng)L-1β 和TNF-α 使炎癥發(fā)生[17]。文獻(xiàn)表明，聽覺信息的變化可引起海馬結(jié)構(gòu)和功能的改變[18]。噪聲暴露后的動(dòng)物海馬小膠質(zhì)細(xì)胞大量持久激活分泌IL-1β、TNF-α，但尚少見研究解釋其是否由NLRP3/caspase-1/IL-1β 信號(hào)通路所致[19-20]。羅氟普蘭是一種PDE4 抑制劑，可減少小膠質(zhì)細(xì)胞活化，減少炎癥因子分泌[21-25]。

綜上所述，噪聲暴露性耳鳴與NLRP3/caspase-1/IL-1β 炎癥信號(hào)通路有關(guān)。

利益沖突聲明：本文所有作者均聲明不存在利益沖突。