毛蕊異黃酮治療脊髓損傷大鼠的作用機(jī)制

★ 陳靜 熊潤萍 帥品花 黃麗君 鄧文靜（江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 南昌 330006）

隨著交通工具及工業(yè)的不斷發(fā)展，脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）的發(fā)生率逐年升高［1］，是導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙和殘疾的主要疾病之一。目前臨床上治療SCI 主要依靠藥物和外科手術(shù)［2］，雖在一定程度上緩解病情，但解決不了病患的根本問題，因此脊髓損傷仍是學(xué)者們研究的熱點(diǎn)問題。近年來隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展，對脊髓損傷的病理機(jī)制研究不斷加深，并且在脊髓損傷的防治過程中更加重視中醫(yī)藥治療SCI 的機(jī)制探究［3］。補(bǔ)陽還五湯是治療中樞神經(jīng)損傷疾病的代表方，其中黃芪為君藥，具有補(bǔ)益元?dú)狻⒋傺小㈧铕鐾ńj(luò)的作用［4］。毛蕊異黃酮是黃芪的黃酮類主要活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗病毒等作用，研究發(fā)現(xiàn)其對脊髓損傷具有潛在治療作用［5］。但毛蕊異黃酮治療脊髓損傷的詳細(xì)作用機(jī)理尚未明確，值得進(jìn)一步深入研究。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）通路與脊髓修復(fù)機(jī)制緊密相關(guān)［6］。本研究通過改良Allen 重物打擊法建立大鼠脊髓損傷模型，觀察脊髓組織中病理情況和p-Akt、gp130、IL-6 蛋白表達(dá)，探討毛蕊異黃酮治療脊髓損傷的潛在作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動物

30只8～10周齡大鼠（SPF級，雌性，200～250 g），購自江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗動物科技中心，生產(chǎn)許可證SCXK（贛）2018-0003。大鼠飼養(yǎng)于潔凈環(huán)境中，溫度（23±2）℃，濕度40%～70%，自由飲食攝水，12 h光暗交替，所有動物適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后開始試驗。

1.2 儀器與試劑

毛蕊異黃酮（成都普菲德生物技術(shù)有限公司，含量≥98%，批號JOT-10389）；山羊抗兔GAPHD多克隆抗體、gp130 抗體、IL-6 抗體（武漢博士德生物工程有限公司）；免疫組化試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）；DAB 顯色試劑盒（北京中山生物技術(shù)有限公司）；熒光顯微鏡、倒置顯微鏡（日本OLYMPUS 公司）。

2 方法

2.1 脊髓損傷模型的建立

采用改良Allen 重物打擊法制備脊髓損傷模型。造模組20 只大鼠均腹腔注射60 mg/kg 氯胺酮麻醉，俯臥位固定大鼠，在背部以T10 為中心，縱向切一3 cm 的小口，充分暴露T10 段脊髓。在T10 脊髓的表面放置一個直徑為3 mm 的圓形薄片，用10 g 的砝碼自由墜落12.5 cm 打擊該墊片，造成T10 段脊髓的沖擊傷，逐層縫合大鼠皮膚。當(dāng)撞擊脊髓時大鼠出現(xiàn)身體抖動，打擊局部脊髓表面迅速呈瘀紫色，術(shù)后雙下肢出現(xiàn)完全癱瘓時視為脊髓損傷模型制備成功。假手術(shù)組10 只大鼠只暴露T10段脊髓并不打擊脊髓，其他步驟和造模大鼠相同。

2.2 分組、給藥和術(shù)后護(hù)理

將30只大鼠分為假手術(shù)組10只和造模組20只，造模成功后隨機(jī)分為模型組、毛蕊異黃酮組，各10 只。參考文獻(xiàn)［7］，毛蕊異黃酮組每天給予毛蕊異黃酮20 mg/kg，假手術(shù)組、模型組每天以等量生理鹽水灌胃，每天2 次；連續(xù)干預(yù)5 周。造模結(jié)束后，將所有大鼠置于25 ℃的動物房內(nèi)統(tǒng)一飼養(yǎng)，將墊有鋸末的平板置于大鼠籠中，以吸收排尿及防止肢體或骶部壓瘡，并及時更換。手術(shù)結(jié)束后人工排尿，2 次/d，各大鼠均連續(xù)排尿2 周，直至大鼠恢復(fù)自主排尿時停止。

2.3 行為學(xué)觀察

采用雙盲雙人獨(dú)立觀察記錄，在術(shù)后5 周進(jìn)行行為學(xué)評分，采用改良Tarlov 評分［8］和斜板試驗。改良Tarlov 評分標(biāo)準(zhǔn)：沒有自主性的運(yùn)動，只限于非反射性的髖、膝關(guān)節(jié)運(yùn)動，0 和1 分；髖、膝、踝3 個關(guān)節(jié)的肢體運(yùn)動，2 分；行走時可主動支撐體重和不協(xié)調(diào)步態(tài)或偶爾出現(xiàn)協(xié)調(diào)步態(tài)，3 分；活動時呈現(xiàn)前后肢協(xié)調(diào)步態(tài)，行動時有趾間關(guān)節(jié)的肢體運(yùn)動，4 分；正常步態(tài)，5 分。斜板試驗：取一塊長方形木板，將2 mm 的橡膠墊墊于木板上，將大鼠頭向前，身體縱軸與斜面板縱軸垂直放置，將木板與水平面之間的角度逐漸增大，直至大鼠在原定位置上剛好可以維持 5 s，將這一個角度稱為傾斜平面臨界角度。

2.4 皮層體感誘發(fā)電位檢測

大鼠麻醉固定后，在腓腸肌中部置入刺激電極，用1.5～4 mA 刺激強(qiáng)度和1.9 Hz 刺激頻率刺激大鼠。在頭頂部中線與冠狀縫交處頭皮下置入記錄電極，在其后方0.5 cm 處置入?yún)⒖茧姌O，將動物尾部用0.9%氯化鈉浸濕并連接地線。于術(shù)后5 周用肌電圖誘發(fā)電位儀檢測大鼠的感覺誘發(fā)電位（SEP），觀察皮層體感誘發(fā)電位波潛伏期變化。

2.5 HE 染色觀察脊髓損傷的情況

造模干預(yù)5 周后麻醉大鼠并開胸，大鼠心臟用4%多聚甲醛灌注固定，將損傷區(qū)的脊髓組織切取2～3 mm，制成3 μm 的切片。樣本切片經(jīng)過HE 染色后置于顯微鏡下觀察脊髓損傷的情況。

2.6 Western blot 檢測各組大鼠脊髓損傷組織中p-Akt、gp130、IL-6 蛋白表達(dá)

處死各組大鼠，取20 mg 脊髓組織，在冰上研磨組織呈粉末狀，將裂解液加入到組織中，制成組織懸液后離心，對蛋白樣本總濃度進(jìn)行測定。轉(zhuǎn)移蛋白樣品至PVDF 膜，倒入5%脫脂奶粉，封閉樣品2 h。蛋白樣品中分別加入一抗p-Akt、gp130、IL-6 和內(nèi)參GAPHD 蛋白（1∶1000），孵育后洗滌蛋白樣品，將二抗（1∶2000）加入到蛋白樣品中，室溫孵育1 h，用ECL 液顯色。用Image J 軟件觀察條帶灰度值并計算蛋白表達(dá)。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料采用（±s）表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 毛蕊異黃酮對SCI 大鼠行為學(xué)及皮層體感誘發(fā)電位波潛伏期的影響

5 周后，與假手術(shù)組比較，模型組中改良Tarlov評分及斜板試驗傾斜角度顯著降低（P＜0.05），皮層體感誘發(fā)電位波潛伏期均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，毛蕊異黃酮干預(yù)后改良Tarlov 評分及斜板試驗傾斜角度顯著上升（P＜0.05），皮層體感誘發(fā)電位波潛伏期均顯著降低（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠改良Tarlov評分、斜板實(shí)驗、皮層體感誘發(fā)電位波潛伏時長比較（±s，n=10）

表1 各組大鼠改良Tarlov評分、斜板實(shí)驗、皮層體感誘發(fā)電位波潛伏時長比較（±s，n=10）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

斜板實(shí)驗傾斜角度/°組別 改良Tarlov評分/分皮層體感誘發(fā)電位波潛伏期時長/ms假手術(shù)組 4.77±0.38 64.38±3.21 17.23±1.12模型組 0.16±0.08* 21.04±0.25* 38.22±2.08*毛蕊異黃酮組 3.21±0.25# 33.82±5.22# 35.23±1.82#

3.2 毛蕊異黃酮對SCI 大鼠損傷組織結(jié)構(gòu)的影響

在5 周時，假手術(shù)組見脊髓組織結(jié)構(gòu)清晰，無明顯細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞，灰、白質(zhì)明顯區(qū)分；模型組脊髓組織結(jié)構(gòu)不清晰，少見完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，灰、白質(zhì)較難區(qū)分；毛蕊異黃酮組脊髓組織結(jié)構(gòu)較清晰，見少量細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞，灰、白質(zhì)可區(qū)分。見圖1。

圖1 脊髓損傷HE染色觀察（×100）

3.3 毛蕊異黃酮對SCI 大鼠損傷組織中p-Akt、gp130、IL-6 蛋白表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組中p-Akt、gp130、IL-6 蛋白水平顯著上升（P＜0.05）；與模型組比較，毛蕊異黃酮干預(yù)后p-Akt、gp130、IL-6 蛋白水平顯著降低（P＜0.05）。見表2、圖2。

圖2 Western blot法檢測脊髓損傷組織中p-Akt、gp130、IL-6相對蛋白表達(dá)

表2 各組大鼠p-Akt、gp130、IL-6蛋白表達(dá)水平比較（±s，n=10）

表2 各組大鼠p-Akt、gp130、IL-6蛋白表達(dá)水平比較（±s，n=10）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別 IL-6/GAPHD gp130/GAPHD p-Akt/GAPHD假手術(shù)組 2.01±0.08 1.63±0.04 0.50±0.03模型組 5.06±0.13* 2.11±0.08* 2.54±0.09*毛蕊異黃酮組 0.53±0.02# 0.73±0.01# 1.07±0.06#

4 討論

目前脊髓損傷的治療與干預(yù)措施是基礎(chǔ)和臨床研究的熱點(diǎn)之一［9］，臨床常以手術(shù)治療脊髓損傷，但治療效果并不十分理想，且治療費(fèi)用相對較高，導(dǎo)致患者及家庭難以接受。近年來隨著中醫(yī)學(xué)的發(fā)展，對脊髓損傷的病理機(jī)制研究不斷加深，并且在脊髓損傷的防治過程中更加重視中醫(yī)藥治療SCI 的機(jī)制探究［10-11］。

本實(shí)驗結(jié)果顯示，毛蕊異黃酮能促進(jìn)脊髓損傷后大鼠后肢功能的恢復(fù)，降低了脊髓損傷后肢皮層體感誘發(fā)電位波潛伏期時長，證明毛蕊異黃酮有利于脊髓損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)，與有關(guān)研究結(jié)果一致［12-13］。

涉及脊髓損傷修復(fù)的信號通路及引導(dǎo)因子有多種，PI3K/Akt 信號通路的激活已經(jīng)被證實(shí)參與脊髓損傷的發(fā)生發(fā)展［14］。IL-6 作為炎癥細(xì)胞分化的重要影響因子，在正常腦組織中表達(dá)較少，在神經(jīng)疾病腦組織中高表達(dá)較高［15］。并且gp130 作為IL-6 等多種細(xì)胞因子的信號傳導(dǎo)鏈，兩者共同參與調(diào)節(jié)急性繼發(fā)性SCI［5］。本研究結(jié)果表明，毛蕊異黃酮抑制了gp130、IL-6 蛋白表達(dá)及PI3K/Akt信號通路磷酸化。究其原因是，脊髓損傷后本身可以釋放出一些能夠?qū)⒕哂卸喾N細(xì)胞因子的信號傳導(dǎo)鏈，如gp130、IL-6 等受體，經(jīng)過其磷酸化以后會特異性結(jié)合信號通路的調(diào)節(jié)亞基，從而將激活細(xì)胞信號通路。本研究發(fā)現(xiàn)毛蕊異黃酮抑制脊髓損傷組織gp130、IL-6 的表達(dá)，進(jìn)一步說明毛蕊異黃酮可能通過PI3K/Akt 信號通路降低脊髓損傷區(qū)域炎癥反應(yīng)，從而改善脊髓功能。

綜上所述，毛蕊異黃酮通過PI3K/Akt 信號通路恢復(fù)脊髓神經(jīng)功能，為臨床治療脊髓損傷提供實(shí)驗和理論依據(jù)。