艾葉復方精油乳對脂溢性脫發相關致病菌抑制作用研究

★ 洪石希 楊思 楊輝 張浩朗 張芹 鐘瀾 王俊軍 熊耀坤（江西中醫藥大學藥學院 南昌 330004）

脂溢性脫發又稱雄激素源性脫發，臨床表現為頭皮油脂增多、頭皮屑大量形成、前額和頭頂頭發逐漸脫落，在男性中的發病率高達23.0%，占脫發總人數的84.8%［1-2］。其病機主要由雄激素及其受體異常引起，也與微生物感染、遺傳和心理等因素有關［3-6］；由糠秕馬拉色菌屬、痤瘡丙酸桿菌屬、金黃色葡萄球菌等屬引起的炎癥已成為脂溢性脫發發生的第三大因素［7-8］。中藥精油是一種天然綠色的植物芳香性物質，具有廣譜抑菌、抗炎、抗病毒等作用［9-11］，其用于預防和治療由細菌引起相關疾病的作用正在被逐步研究。此外，薄荷精油和薰衣草精油還被發現具有促生發作用［12］。本實驗選用具有廣譜抑菌的艾葉精油、肉桂精油、生姜精油和薄荷精油制成艾葉復方精油乳，研究其對脂溢性脫發相關致病菌的抑制作用，為中藥精油治療脂溢性脫發提供更多解決方法及科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

艾葉油、生姜油（上海麥克林生化科技有限公司）；肉桂油、薄荷精油（廣州唐穗科技有限公司）；吐溫-80（分析純，天津市大茂化學試劑廠）；MH肉湯培養基、MH 瓊脂培養基、瓊脂粉（青島海博生物技術有限公司）；液體硫乙醇酸鹽（FT）培養基（廣東環凱微生物科技有限公司）；青霉素藥敏紙片（溫州康泰藥物原料有限公司）；金黃色葡萄球菌、糠秕馬拉色菌、痤瘡丙酸桿菌（北京北納創聯生物技術研究院）。

FA2004N 電子天平（上海精密科學儀器有限公司），DSX-280B 手提式壓力蒸汽滅菌器（上海申安器械廠）；立式電熱恒溫培養箱（上海丙林電子科技有限公司）；超凈工作臺（蘇州佳寶凈化工程設備有限公司）；Medium-E400UF 實驗室純水系統（上海和泰儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 艾葉復方精油乳的制備 稱取艾葉油40.0 mg、薄荷油60.0 mg、肉桂油80.0 mg、生姜油60.0 mg、吐溫-80 185.0 mg 研磨混勻，加入18.1 mL 蒸餾水超聲混合均勻，即得濃度為13.0 mg/mL 的艾葉復方精油乳，備用。

1.2.2 菌種的活化 無菌移液槍吸取0.5 mL MH肉湯培養基，滴入金黃色葡萄球菌凍干粉安瓿管內，輕輕振蕩，使凍干菌體溶解呈懸浮狀。吸取全部菌體懸浮液，移植于MH 瓊脂培養基中，37 ℃恒溫培養24 h。連續培養至第三代，挑取2～3 個菌落轉入MH 肉湯液體培養基中培養，使用平板計數法確定細菌濃度，保存備用。

無菌移液槍吸取0.5 mL MH 肉湯培養基，滴入糠秕馬拉色菌凍干粉安瓿管內，輕輕振蕩，使凍干菌體溶解呈懸浮狀。吸取全部菌體懸浮液，移植于MH 瓊脂培養基中，30 ℃恒溫培養48 h。連續培養至第三代，挑取2～3 個菌落轉入MH 肉湯液體培養基中培養，使用平板計數法確定細菌濃度，保存備用。

無菌移液槍吸取 1 mL FT 培養基，滴入痤瘡丙酸桿菌凍干粉安瓿管內，輕輕振蕩，使凍干菌體溶解呈懸浮狀。吸取全部菌體懸浮液，移植于10 mL 已滅菌FT 培養基中，搖勻，使用封口膜封口，置于厭氧袋中37 ℃恒溫厭氧培養72 h。連續培養至第三代，使用平板計數法確定細菌濃度，保存備用。

1.2.3 抑菌圈的測定——牛津杯法 使用PBS 溶液稀釋供試菌溶液，制成 1×106CFU/mL 的細菌懸液，取各種細菌懸液100 μL 于培養皿平板上，涂布均勻。用鑷子夾取2 個牛津杯放入培養皿中，輕輕按壓，使牛津杯和培養基表面接觸緊實。吸取100 μL 艾葉復方精油乳加入牛津杯中，另一牛津杯中加入100 μL 1%吐溫-80 作為陰性對照，并以藥敏試紙作為陽性對照，每組平行實驗3 次。金黃色葡萄球菌組37 ℃ 恒溫培養18 h 后觀察；糠秕馬拉色菌組30 ℃恒溫培養48 h 后觀察，痤瘡丙酸桿菌組37 ℃恒溫無氧條件下培養72 h 觀察；用游標卡尺測量抑菌圈直徑，取平均值［13］。

1.2.4 最小抑菌濃度——肉湯稀釋法 在96 孔板中使用營養肉湯梯度稀釋艾葉復方精油乳，使濃度為6.50、3.25、1.62、0.812、0.406、0.203、0.101、0.0508、0.0254、0.0126 mg/mL。在孔板第11 孔和12 孔加入營養肉湯培養基。于1～10 孔和12 孔加入10 μL 的供試菌菌液，第11 孔作為陰性對照，第12 孔為陽性對照。將各組在合適的條件下培養，培養結束后觀察結果，藥物最大稀釋管中菌株不生長（溶液不渾濁）者為艾葉復方精油乳的最小抑菌濃度。

1.2.5 統計學方法 使用SPSS 22.0 統計軟件進行統計分析。計量資料以（±s）表示，采用t檢驗，計數資料以百分比表示，采用χ2檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 艾葉復方精油乳的抑菌圈直徑

艾葉復方精油乳對金黃色葡萄球菌、糠秕馬拉色菌、痤瘡丙酸桿菌的抑菌圈結果見表1、圖1。

圖1 艾葉復方精油乳對脂溢性脫發相關病菌的抑菌圈結果

表1 不同藥物對脂溢性脫發相關病菌的抑菌圈直徑比較mm

以美國臨床實驗室標準化委員會（NCCLS）頒布的《抗微生物藥物敏感性試驗執行標準》判斷細菌對藥物的敏感性，抑菌圈試驗的判定標準為：抑菌圈直徑＞20 mm 為最敏感，10～20 mm 為中度敏感，5～10 mm 為低度敏感，抑菌圈直徑≤5 mm者為不敏感［14］。由實驗結果可知，金黃色葡萄球菌、糠秕馬拉色菌和痤瘡丙酸桿菌對艾葉復方精油乳有中度敏感性，說明有抑制作用。

2.2 艾葉復方精油乳的抑菌MIC 值

采用肉湯稀釋法，進行艾葉復方精油乳的最小抑菌濃度實驗，確定艾葉復方精油乳對金黃色葡萄球菌、糠秕馬拉色菌、痤瘡丙酸桿菌的最小抑菌濃度，結果見表2、圖2。

圖2 艾葉復方精油乳對脂溢性脫發相關細菌的最小抑菌實驗結果

表2 不同濃度艾葉復方精油乳對細菌的抑制效果比較

由表2 可知，艾葉復方精油乳對不同細菌的最小抑菌濃度不同。當艾葉復方精油乳濃度為0.050 mg/mL 時，金黃色葡萄球菌與糠秕馬拉色菌出現菌落，使肉湯渾濁，所以艾葉復方精油乳對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度是0.101 mg/mL。當艾葉復方精油乳的濃度稀釋到0.101 mg/mL 時，痤瘡丙酸桿菌開始生長，所以艾葉復方精油乳對痤瘡丙酸桿菌的最小抑菌濃度為0.203 mg/mL。

3 討論

微生物感染可引起頭皮皮炎并加重脂溢性脫發，主要致病菌包括金黃色葡萄球菌、糠秕馬拉色菌和痤瘡丙酸桿菌等，這些細菌數量的失調增多還會引發毛囊炎及痤瘡等。目前治療藥物主要是酮康唑乳膏，已有研究表明中藥精油對多種細菌有抑制作用，這為擴大臨床用藥提供了更多選擇，而中藥精油對脂溢性脫發相關病菌的研究卻寥寥無幾。艾葉精油、肉桂精油、生姜精油、薄荷精油等已被發現對多種致病菌有抑制作用。

本研究選用艾葉精油、肉桂精油、薄荷精油、生姜精油制成艾葉復方精油乳，測定艾葉復方精油乳對金黃色葡萄球菌、糠秕馬拉色菌和痤瘡丙酸桿菌的抑制效果及MIC 值。研究結果表明金黃色葡萄球菌、糠秕馬拉色菌和痤瘡丙酸桿菌對艾葉復方精油乳表現為中敏感度，抑菌圈直徑分別為13.0、16.3、11.0 mm，最小抑菌濃度分別為0.101、0.101、0.203 mg/mL。結果表明艾葉復方精油乳對3 種脂溢性脫發相關細菌都有抑制作用，通過抑制脂溢性脫發致病菌的生長與繁殖，減少炎癥發生，治療脂溢性脫發。目前課題組正進行動物防脫育發實驗，初步結果表明其對毛發生長長度的促進率為15%，以上研究為艾葉復方精油乳防脫育發的新藥和特殊化妝品的開發提供了實驗依據和研究基礎。