兩色金雞菊降血脂活性部位篩選研究

★ 顏仁梁 李田 卓友銘（廣東食品藥品職業學院 廣州 510520）

兩色金雞菊來源于菊科金雞菊屬兩色金雞菊Coreopsis tinctoriaNutt.的干燥頭狀花序，在新疆南疆地區海拔3 000 m 左右的昆侖山區有大量種植，是常用的維吾爾族民族藥，始載于《新華本草綱要》。其味甘，性平，歸大腸經。現代藥理學實驗證明，兩色金雞菊在降血糖、降血脂和降血壓方面具有多樣而顯著的生物活性［1-3］，體現在清熱解毒、活血化瘀、和胃健脾、降血脂、軟化血管等方面［4-5］，對冠心病、高血脂、糖尿病等有特殊療效。為了明確兩色金雞菊的降血脂活性成分，本文以降血脂活性為導向，選定藥材活性部位，為后期成分分離及新藥開發提供基礎。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑與儀器

1.1.1 藥品 兩色金雞菊樣品采自新疆和田地區，由廣東食品藥品職業學院梁永樞副研究員鑒定為兩色金雞菊Coreopsis tinctoriaNutt.的干燥頭狀花序，藥材標本（編號20200701）存放于廣東食品藥品職業學院中藥學院標本室。

1.1.2 試劑與儀器 電加熱提取鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；HH-S 數顯恒溫水浴鍋（常州中捷實驗儀器制造有限公司）；Z0002 電子天平（上海衡平儀器儀表廠）；大孔吸附樹脂806021（滄州樹脂廠）；Anke TGL80-16B 高速離心機（上海安亭科學儀器廠）；日立7020 全自動生化分析儀（日本日立公司）；總膽固醇（TC）測定試劑盒（日本和光純藥工業株式會社，批號AH831）；低密度脂蛋白（LDL-C）測定試劑盒（日本和光純藥工業株式會社，批號KP748）；膽固醇（瑞士羅氏公司，批號163010-01）；膽酸鈉（美國sigma 公司，批號127K0122）；丙基硫氧嘧啶片（精華制藥集團股份有限公司，批號100703）；辛伐他丁（默沙東中國有限公司，批號110077）；乙醇（化學純，上海市振興化工一廠）。

1.2 實驗動物

健康雄性ICR 小鼠，體重（20±2）g，廣東省醫學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號SCXK（粵）2013-0002，實驗動物質量合格證號NO44007200014522。動物飼養于廣東省中醫藥工程技術研究院SPF 級動物實驗室，設施使用許可證號為SYXK（粵）2010-0059，自由進食。動物實驗得到廣東省中醫藥工程技術研究院動物委員會批準，所有操作均嚴格遵循實驗動物管理的相關規定。

1.3 研究方法

1.3.1 高血脂動物模型的建立

1.3.1.1 乳劑配制 豬油80 g，膽固醇40 g 加熱融化，加入膽酸鈉8 g 和丙硫氧嘧啶片4 g，充分攪拌均勻，再加入吐溫-80、丙二醇各80 mL 和蒸餾水至400 mL 并充分混勻，即成100 g/L 膽固醇、200 g/L豬油、20 g/L 膽酸鈉和10 g/L 丙硫氧嘧啶的脂肪乳劑。4 ℃保存，使用前加熱熔化［6］。

1.3.1.2 動物造模 雄性ICR 小鼠常規適應性1 周后進行實驗，除正常對照組外，其余各組每天灌服乳劑0.5 mL，1 h 后口服給藥，連續14 d，于第15 d 禁食12 h，眼底靜脈叢采血1 mL，靜置45 min，8 000 r/min離心5 min，取血清，測血清TC 和LDL-C。

1.3.2 兩色金雞菊不同溶劑的提取物對降血脂活性的影響 溶劑極性對中草藥成分的提取有很大的影響，不同極性的溶劑在提取過程中所得到的化學成分類型和得率存在較大的區別［7］。本研究采用水、75%乙醇和95%乙醇3 種不同極性溶劑分別對兩色金雞菊進行提取，以獲得不同類型化合物的提取物，并通過高脂飼料致小鼠高血脂模型評價各提取物的降血脂活性，確定最優的提取溶劑。

1.3.2.1 不同溶劑提取方法 取兩色金雞菊1 kg，各3 份，分別加入8 倍量水、75%乙醇和95%乙醇回流提取2 h，共提取2 次，提取液合并，減壓回收溶劑，得水提物400 g、75%醇提物320 g 和95%醇提物285 g。4 ℃避光保存，備用。

1.3.2.2 不同溶劑提取物的降血脂活性考察 雄性ICR 小鼠90 只，根據血脂水平及體質量，隨機均衡分為9 組，每組10 只：正常組，模型組，陽性藥辛伐他丁組（10 mg/kg），兩色金雞菊各洗脫部位給藥分為高劑量組（相當于生藥10 g/kg）、低劑量（相當于生藥5 g/kg），具體給藥劑量分組為：兩色金雞菊水提物高劑量組（4 000 mg/kg）和低劑量組（2 000 mg/kg）；兩色金雞菊75%乙醇提取物高劑量組（3 200 mg/kg）和低劑量組（1 600 mg/kg）；兩色金雞菊95%乙醇提取物高劑量組（2 850 mg/kg）和低劑量組（1 425 mg/kg）。每天給藥1 次，連續7 d，給藥體積均為0.2 mL/10 g。

1.3.3 兩色金雞菊水提物各部位對降血脂活性的影響 通過以降血脂活性為指導對兩色金雞菊不同溶劑提取考察，確定了以水提取。但由于給藥量劑量較大，不利于進一步應用開發。為了去除雜質，保留有效成分，減少給藥劑量，提高其生物利用度，本實驗對兩色金雞菊水提物進行了以大孔吸附樹脂進行富集純化。

1.3.3.1 兩色金雞菊水提物精制 兩色金雞菊水提物分離流程圖見圖1。取兩色金雞菊2.5 kg 按 “1.3.2.1” 方法得水提物1.06 kg，加水1 L 溶解，終濃度70%乙醇濃度醇沉過夜，上清減壓濃縮得到浸膏（組分1）650.24 g，沉淀充分干燥得醇沉部位（組分2）364.02 g。組分1 加水1 L 溶解，經860021 大孔吸附樹脂處理，柱體積4 L，12 BV 水洗脫，減壓濃縮得水洗脫部位（組分3）376 g；10 BV 30%乙醇洗脫，減壓濃縮得30%乙醇洗脫部位（組分4）123.33 g；8 BV 50%乙醇洗脫，減壓濃縮得50%乙醇洗脫部位（組分5）28.84 g；4 BV 70%乙醇洗脫，減壓濃縮得70%乙醇洗脫部位（組分6）4.98 g；4 BV 90%乙醇洗脫，減壓濃縮得90%乙醇洗脫部位（組分7）2.39 g，4 ℃避光保存，備用。各分離部位得率見表1。

表1 兩色金雞菊水提物及各組分得率 %

圖1 兩色金雞菊水提物純化流程圖

1.3.3.2 兩色金雞菊水提物精制部位的降血脂活性考察 雄性ICR 小鼠190 只，根據血脂水平及體質量，隨機均衡分為19 組，每組10 只：正常組、模型組、陽性藥辛伐他丁組（10 mg/kg）及兩色金雞菊各洗脫部位給藥組，給藥組又分為高劑量組（相當于生藥10 g/kg）、低劑量組（相當于生藥5 g/kg）。具體給藥劑量分組為：水提物高劑量組（4 200 mg/kg）和低劑量組（2 100 mg/kg）；組分1 高劑量組（2 600 mg/kg）和低劑量組（1 300 mg/kg）；組分2高劑量組（1 500 mg/kg）和低劑量組（750 mg/kg）；組分3 高劑量組（1 500 mg/kg）和低劑量組（750 mg/kg）；組分4 高劑量組（540 mg/kg）和低劑量組（270 mg/kg）；組分5 高劑量組（150 mg/kg）和低劑量組（75 mg/kg）；組分6 高劑量組（20 mg/kg）和低劑量組（10 mg/kg）；組分7 高劑量組（10 mg/kg）和低劑量組（5 mg/kg）。每天給藥1 次，連續7 d，給藥體積均為0.2 mL/10 g。

1.4 統計學方法

用SPSS 20.0 統計軟件進行分析。計量資料以（±s）表示，均首先用levene 法進行方差齊性檢驗，若方差齊，則多組間用單因素方差分析，2 組間用兩樣本t檢驗。若參數檢驗的假設不合理，則多組間用Kruskal-Wallis 檢驗，2 組間用Wilcoxon 檢驗。以P＜0.05 為差異具有統計學意義。數據統計后用Prism 6.0 作圖軟件進行圖標制作。

2 結果

2.1 不同溶劑的提取物對降血脂活性的影響

通過給予高脂飼料14 d，模型組與正常組比較，TC 和LDL-C 均顯著提高，表明造模成功。當給予兩色金雞菊各溶劑提取物后，與模型組比較，兩色金雞菊水提物和95%乙醇提取物在低劑量下均能顯著性降低高血脂小鼠血清中TC 和LDL-C 含量；且兩色金雞菊水提物在高劑量下能顯著降低高血脂小鼠血清中TC 和LDL-C 含量，但95%乙醇提取物無顯著改善效果。兩色金雞菊的民間使用習慣也有每天喝2 杯兩色金雞菊茶用于控制糖尿病的傳統［8-9］。根據藥效結果結合民間使用習慣，確定兩色金雞菊的提取溶劑為水。見圖2。

圖2 兩色金雞菊不同溶劑提取物對高脂飼料致小鼠高血脂模型的影響

2.2 水提物精制部位的降血脂活性考察結果

通過給予高脂飼料14 d，模型組與正常組比較，TC 和LDL-C 均顯著提高，表明造模成功。當給予兩色金雞菊水提物及各純化部位后，與模型組比較，在低劑量下水提物，醇沉沉淀部位和30%洗脫部位，可顯著降低血清TC 含量；水提物可顯著降低LDL-C 含量。在高劑量下水提物和組分4均可顯著降低血清TC 和LDL-C 含量，其他部位均無顯著改善，且組分2 在高劑量給藥下該組動物全部因腹瀉死亡，無法獲得相關血脂指標。根據給藥劑量以及動物存活率綜合分析，確定兩色金雞菊大孔30%洗脫部位為活性部位（組分4）。見圖3。

圖3 兩色金雞菊水提物各部位對小鼠高脂模型TC和LDL-C的影響

3 結論

高脂血癥是機體脂質代謝紊亂的臨床表現之一，同時也是冠心病、動脈粥樣硬化等疾病的病理基礎，我國有數目龐大的高血脂人群［10-12］。臨床上主要以TG，TC，LDL-C 和HDL-C 為代表性成分。研究表明，TG 在脂蛋白調控以及相關脂質代謝中扮演著關鍵角色，血液中TG 和TC 濃度的升高會增加冠狀動脈疾病的發病機率［13］。同時血液中LDL-C 濃度的升高使血液變稠并導致動脈粥樣硬化的風險增加［14］。大量研究表明HDL-C 具有抵抗冠狀動脈粥樣硬化，HDL-C 濃度每升高0.025 mmol/L，可以將患病風險降低2%～4%［15-17］。

本研究運用相似相溶原理，對兩色金雞菊分別以水、75%乙醇、95%乙醇進行提取，并將各提取物作用于高脂飼料致小鼠高血脂模型考察其降血脂活性。結果表明兩色金雞菊水提物在低、高劑量對小鼠高血脂模型均表現出良好的改善作用。綜合藥效結果及民間用藥習慣，確定優選提取溶劑為水。同時，結合降血脂藥效活性篩選活性部位。結果表明當給予兩色金雞菊及各純化部位后，與模型組比較，醇沉沉淀部位和大孔吸附樹脂30%乙醇洗脫部位均表現出顯著的降血脂活性。但醇沉部位高劑量下動物全部死亡，表明其有較大毒性。根據給藥劑量以及動物存活率綜合分析，確定兩色金雞菊大孔吸附樹脂30%乙醇洗脫部位為活性部位。