基于響應(yīng)面法優(yōu)化白背牛尾菜中薯蕷皂苷元的提取工藝研究

★ 郭強 趙灼濱 陳荷瑩 劉毅 金晨 黃慧蓮（江西中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥制劑教育部重點實驗室 南昌 330004）

白背牛尾菜Smilax nipponicaMiq.來自于百合科菝葜屬，作為牛尾菜的變種植物，又名金剛豆藤、草菝葜等，藥性平，味甘、苦，具有祛痰、止咳等功效［1］。經(jīng)國內(nèi)外文獻研究發(fā)現(xiàn)，牛尾菜中含有豐富的皂苷類成分，其中以薯蕷皂苷為主，其具有抗炎、抗痛風(fēng)、抗高尿酸血癥、利尿等作用［2-7］。作為白背牛尾菜中主成分薯蕷皂苷的苷元，薯蕷皂苷元廣泛應(yīng)用于臨床藥理中，具有明顯的抗高血脂、抗腫瘤、抗氧化以及抗炎等作用，對于結(jié)腸癌［8］、肝癌［9-10］等均具有顯著的治療效果。文獻表明，薯蕷皂苷元通過調(diào)節(jié)功能蛋白，可以抑制腫瘤細胞的增殖等行為誘導(dǎo)細胞凋亡，進而發(fā)揮抗腫瘤作用［11］。有研究通過正交設(shè)計的方法對牛尾菜的提取工藝進行考察［12］，本實驗在單因素考察的基礎(chǔ)上運用了響應(yīng)面的設(shè)計和分析方法考察薯蕷皂苷元提取以及酸水解相關(guān)工藝參數(shù)，優(yōu)化后使薯蕷皂苷元的得率提高，可以為白背牛尾菜中薯蕷皂苷元的制備提供參考。

1 材料與儀器

白背牛尾菜的根部采于南昌市灣里區(qū)梅嶺，由江西中醫(yī)藥大學(xué)胡生福老師鑒定為百合科菝葜屬白背牛尾菜Smilax nipponicaMiq.。白背牛尾菜標本保存于江西中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代制劑教育部重點實驗室，編號為20200301。乙醇、石油醚等所有試劑均為分析純，購于西隴化工股份有限公司；薯蕷皂苷元（批號YJ-111539，購于中國食品藥品檢定研究院）；1260 型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 白背牛尾菜中薯蕷皂苷元含量測定

2.1.1 色譜檢測條件 色譜柱：Agilent Zorbax-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；進樣量：10 μL；柱溫：35 ℃；流速：1.0 mL/min；檢測波長：203 nm；流動相為乙腈∶水（9∶1）。上述色譜條件下薯蕷皂苷元對照品和樣品色譜圖見圖1。

圖1 薯蕷皂苷元對照品和供試品HPLC色譜圖

2.1.2 標準曲線的繪制 精密稱定薯蕷皂苷元20 mg，置于10 mL 容量瓶中，甲醇溶解并定容。分別用甲醇精密稀釋至濃度為2.0、1.0、0.5、0.25、0.125、0.062 5 mg/mL 的對照品溶液。以X表示薯蕷皂苷元濃度，Y表示峰面積，甲醇作為空白溶液，計算得回歸方程為：Y=69 917X-196.34（R2=0.999 8）。

2.1.3 供試品溶液的制備 精密稱取干燥至恒重過3 號篩的白背牛尾菜粉末2.0 g，置于250 mL 圓底燒瓶中。按照相應(yīng)提取條件回流提取，提取液冷卻后抽濾，取濾液，加入1.5 mol/L 濃硫酸與60 mL石油醚（60～90℃）于95 ℃條件下加熱回流4.5 h，水解，取石油醚層，蒸干，用5 mL 甲醇定容，得到薯蕷皂苷元粗取液。

2.1.4 精密度試驗 取0.5 mg/mL 的對照品溶液，用上述 “2.1.1” 色譜條件連續(xù)進樣6 次，得峰面積的RSD值，檢查儀器的精密度是否良好。峰面積分別為3 295、3 298、3 314、3 288、3 286、3 293，RSD為0.3%，結(jié)果顯示該實驗使用儀器的精密度良好。

2.1.5 重復(fù)性試驗 按 “2.1.1” 與 “2.1.3” 項下供試品溶液分析條件和制備方法分別進樣測定，記錄峰面積，，以6 次峰面積的RSD評價方法的重復(fù)性。含量分別為0.50、0.50、0.51、0.52、0.51、0.50 mg/g，經(jīng)計算，RSD為1.6%，顯示該方法的重復(fù)性較好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗 按 “2.1.3” 項下供試品溶液制備方法，制備后，分別室溫下靜置0、2、4、6、12、24、48 h 后再按照 “2.1.1” 項下分析條件進樣測定，記錄峰面積，并計算RSD。峰面積分別為2 630、2 540、2 576、2 572、2 652、2 660、2 658，RSD為1.9%，表明該制備方法的穩(wěn)定性良好。

2.1.7 加樣回收率實驗 精密稱取6 份干燥至恒重的過3 號篩的白背牛尾菜粉末2 g，分別精密加入相當(dāng)于樣品80%、100%、120%對照品的含量，每類做3 份，按 “2.1.3” 項下供試品溶液制備方法制備，按上述 “2.1.1” 項下分析條件進樣，計算加樣回收率。其平均回收率為98.61%，RSD為1.4%。見表1。

表1 加樣回收率

2.2 白背牛尾菜中薯蕷皂苷元酸水解工藝參數(shù)優(yōu)化

以白背牛尾菜中的薯蕷皂苷元得率為考察指標，分別進行單因素考察，分析酸濃度、酸水解時間及酸水解溫度對薯蕷皂苷元得率的影響。

2.2.1 酸濃度的考察 精密稱取2.0 g 過3 號篩的同一批白背牛尾菜粉末6 份，分別置于250 mL 圓底燒瓶中，料液比1∶23，乙醇濃度70 %，提取30 min，提取溫度為90℃，分別用0.7、0.9 、1.1、1.5、2.0 mol/L 濃硫酸水解提取物。得率隨著酸濃度的升高而升高，在1.5 mol/L 時達到峰值，而后隨濃度的升高而降低，由此可得酸濃度為1.5 mol/L 時得率最高。見圖2。

圖2 各因素對于薯蕷皂苷元得率的影響

2.2.2 酸水解時間的考察 精密稱取2.0 g 過3 號篩的同一批白背牛尾菜粉末6 份，分別置于250 mL圓底燒瓶中，料液比1∶23，乙醇濃度70 %，提取30 min，提取溫度為90℃，用1.5 mol/L 濃硫酸水解提取物。水解時間分別為1.5、2.5、3.5、4.5、5.5 h。得率隨著水解時間的增加而逐漸增加，在4.5 h 時達到峰值，在4.5 h 后得率隨時間的增加而逐漸降低，由此可知水解時間為4.5 h 時薯蕷皂苷元的得率最高。見圖2。

2.2.3 酸水解溫度的考察 精密稱取2.0 g 過3 號篩的同一批白背牛尾菜粉末6 份，分別置于250 mL圓底燒瓶中，料液比1∶23，乙醇濃度70%，提取30 min，提取溫度為90 ℃，用1.5 mol/L 濃硫酸水解提取物。設(shè)定薯蕷皂苷的水解時間為2 h，水解溫度分別設(shè)置為50、70、90、110、130 ℃。薯蕷皂苷元的得率隨著酸水解時水解溫度的升高而逐漸升高，在90 ℃時達到峰值，90 ℃后隨酸水解溫度的升高而逐漸降低，由此可得酸水解薯蕷皂苷時水解溫度為90 ℃時得率最高。見圖2。

2.2.4 薯蕷皂苷元酸水解工藝響應(yīng)面實驗 采用軟件Design Expert 8.0 中的Box-Behnken 中心組合試驗設(shè)計原理及響應(yīng)面分析法運用此前得到的最佳酸水解參數(shù)對薯蕷皂苷元的酸水解工藝進行優(yōu)選。以酸濃度（A）、水解溫度（B）、水解時間（C）作為自變量，以皂苷元的得率作為響應(yīng)值，設(shè)計3 因素3 水平試驗表，用代碼值-1、0、1 表示。實驗方案設(shè)計見表2。

表2 響應(yīng)面的因素水平設(shè)計

2.2.5 模型的建立及其顯著性檢驗 應(yīng)用Designer Expert 8.0 軟件進行響應(yīng)面分析，將薯蕷皂苷元的得率設(shè)置為響應(yīng)值，設(shè)計實驗及結(jié)果見表3，通過二階多項式進行回歸，所得回歸模擬方程如下：甾體皂苷元得率=1.63-0.22A+0.18B- 3.436×10-3C+0.049AB-0.14AC+0.039BC-0.21A2- 0.12B2-0.15C2，模型方差分析見表4。根據(jù)F值可知3 種因素影響次序為：A＞B＞C，實驗?zāi)Ｐ偷腜和F的值均小于0.001，說明實驗?zāi)Ｐ椭械亩検椒蠈嶋H提取情況，較好地反映了料液比的作用達到極顯著水平，酸濃度、水解溫度、水解時間、酸濃度和水解時間的交互作用具有高顯著水平。

表3 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

表4 回歸方程各項方差分析

2.2.6 響應(yīng)面分析因素之間的相互作用 薯蕷皂苷在酸水解時，硫酸濃度和酸水解溫度的交互作用對薯蕷皂苷元提取率的影響。經(jīng)三維圖分析可得，當(dāng)酸濃度固定不變時，薯蕷皂苷元的得率隨著酸水解薯蕷皂苷時水解溫度的升高先增加后逐漸降低，在水解溫度和酸濃度處于中間水平時得率達到最大值。當(dāng)水解時間固定不變時，在薯蕷皂苷元的得率隨水解時間的增加而先升后降，在水解時間和水解溫度處于中間水平時薯蕷皂苷元的得率達到最高值。當(dāng)水解時間固定不變時，薯蕷皂苷元的得率隨著酸濃度的增大先升高后逐漸降低，當(dāng)酸濃度固定不變時，得率隨著水解時間的增加先升后降，得率在酸濃度和水解時間處于中間水平時達到最高值。見圖3。

圖3 各因素交互作用對得率的影響

2.2.7 最佳工藝的確定 結(jié)合Designer Expert 8.0，綜合分析與薯蕷皂苷元得率有關(guān)的各種因素，分析認為最優(yōu)的回流提取工藝為酸濃度為1.27 mol/L，水解溫度為95 ℃，水解時間為4.5 h，采用上述最優(yōu)工藝條件進行驗證，重復(fù)實驗6 次，薯蕷皂苷元平均得率為1.64 mg/g，RSD為0.25%，說明響應(yīng)面優(yōu)化所得工藝可靠。見表5。

表5 驗證參數(shù)

2.3 白背牛尾菜甾體皂苷元提取工藝的優(yōu)化

以酸水解白背牛尾菜中薯蕷皂苷后得到的薯蕷皂苷元的得率為考察指標，進行單因素考察，分別研究提取溫度、提取時間、料液比、乙醇濃度對薯蕷皂苷元類成分得率的影響。

2.3.1 提取溫度的考察 精密稱取2.0 g 過3 號篩的同一批白背牛尾菜粉末6 份，分別置于250 mL圓底燒瓶中，料液比1∶20，乙醇濃度70 % ，提取30 min，提取溫度分別為35、50、65、80、95、110 ℃。平行試驗3 份，經(jīng)水解后，取平均值。薯蕷皂苷元的得率隨著乙醇提取時的溫度升高而增大，在90 ℃時達到最高值隨后趨于平穩(wěn)。由此可得，提取溫度為90 ℃時得率最高。見圖4。

圖4 各因素對于薯蕷皂苷元得率的影響

2.3.2 提取時間的考察 精密稱取2.0 g 過3 號篩的同一批白背牛尾菜粉末6 份，分別置于250 mL圓底燒瓶中，料液比設(shè)置為1∶20，70 %濃度的乙醇溶液作為提取溶劑，提取溫度為恒溫90 ℃提取，提取時間分別為30、60、90、120、150、180 min。平行試驗3 份，經(jīng)水解后，取平均值。結(jié)果表明得率隨時間的增長而增大，于90 min 達到最大值而后得率降低。說明時間為90 min 時得率最高。

2.3.3 料液比的選取 精密稱取2.0 g 過3 號篩的同一批白背牛尾菜粉末6 份，分別置于 250 mL 圓底燒瓶中，固定提取時間30 min，提取溫度90 ℃，乙醇濃度70%，料液比依次1∶8、1∶10、1∶15、1∶20、1∶30、1∶40 恒溫提取。平行試驗3 份，經(jīng)水解后，取平均值。結(jié)果表明得率隨著料液比的增加而增加，在1∶20 之后的薯蕷皂苷元得率趨于相對平穩(wěn)，說明料液比參數(shù)為1∶20 時得率最高。見圖4。

2.3.4 乙醇濃度的考察 精密稱取2.0 g 過3 號篩的同一批白背牛尾菜粉末6 份，分別置于250 mL圓底燒瓶中，料液比為1∶20，在提取溫度在90 ℃的條件下恒溫提取，提取時間為30 min，乙醇濃度設(shè)置為40%、50%、60%、70%、80%、90%。平行3 份，經(jīng)水解后，取平均值。結(jié)果表明隨著乙醇濃度增大，皂苷元的含量增多，在乙醇濃度為80%的時候得率最高，隨之降低。說明乙醇濃度為80%時，提取皂苷元最合適。見圖4。

2.3.5 白背牛尾菜中薯蕷皂苷元提取工藝Box-Behnken 響應(yīng)面曲面實驗 通過單因素實驗，采用軟件 Design Expert 8.0 中的 Box-Behnken 中心組合試驗設(shè)計原理及響應(yīng)面分析法對薯蕷皂苷元的提取工藝進行優(yōu)選。乙醇濃度（A）、提取時間（B）、料液比（C）作為自變量，以總皂苷元的得率作為響應(yīng)值，設(shè)計3 因素3 水平試驗表，用代碼值-1、0、1 表示。響應(yīng)面的因素水平設(shè)計見表6。

表6 響應(yīng)面的因素水平設(shè)計

2.3.6 模型的建立及其顯著性檢驗 應(yīng)用Designer Expert 8.0 軟件進行響應(yīng)面分析，以薯蕷皂苷元的得率為響應(yīng)值，響應(yīng)面實驗結(jié)果見表7。通過二階多項式進行回歸，所得回歸模擬方程如下：甾體皂苷元得率=1.53+0.081A-0.016B+ 0.071C-0.058AB-5.957×10-3AC-0.063BC+0.030A2-0.13B2-0.058C2。根據(jù)F值可知3 種因素影響次序為：C＞A＞B，實驗?zāi)Ｐ偷腜和F的值均小于0.001，說明實驗?zāi)Ｐ椭械亩検椒蠈嶋H提取情況，較清晰地反映了料液比的作用達到極顯著水平，乙醇濃度與提取時間、提取時間與料液比、乙醇濃度和提取時間的交互作用具有高顯著水平。

表7 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

表8 回歸方程各項方差分析

2.3.7 響應(yīng)面分析因素之間的相互作用 當(dāng)乙醇濃度為任一固定值時，薯蕷皂苷元的得率隨著白背牛尾菜的提取時間的增加先增加后緩慢降低。在提取時的乙醇濃度和時間均處于較低水平時薯蕷皂苷元的得率達到最低值。在提取時間處于中等水平，乙醇濃度處于中間水平時得率達到最高值。藥材粉末進行提取時，相應(yīng)的料液比和不同的乙醇濃度的交互作用對薯蕷皂苷元最終得率有影響。當(dāng)乙醇濃度為定值時，水解后得到的薯蕷皂苷元的得率隨料液比的增大而升高后逐漸降低，在乙醇濃度和料液比的參數(shù)處于中間水平時薯蕷皂苷元的得率達到最高值，在乙醇濃度和料液比的參數(shù)均處于較低水平時薯蕷皂苷元的得率達到最低值。當(dāng)料液比固定不變時，得率隨著提取時間的增加先升高后降低，當(dāng)提取時間固定不變時，得率隨著料液比的增大先升高后降低，得率在料液比和提取時間處于中間水平時達到最高值，在料液比和提取時間處于較低水平時達到最低值。見圖5。

圖5 各因素交互作用對得率的影響

2.3.8 最佳提取工藝的確定 結(jié)合Designer Expert 8.0，綜合分析與薯蕷皂苷得率有關(guān)的各種因素，認為最優(yōu)的回流提取工藝參數(shù)為提取時間為80 min，料液比的參數(shù)為1∶23，提取溶劑為81 %乙醇溶液，薯蕷皂苷元得率的預(yù)測值為1.70 mg/g。采用上述最優(yōu)工藝條件進行驗證，重復(fù)實驗6 次，得到薯蕷皂苷元平均得率為1.71 mg/g，與理論值相差不大，說明響應(yīng)面優(yōu)化所得提取工藝可靠。見表9。

表9 驗證實驗

3 討論

本實驗首次采用響應(yīng)面法對于白背牛尾菜中薯蕷皂苷元的提取以及酸水解進行較為全面的考察，通過對提取時間、料液比、乙醇濃度、酸濃度、水解溫度、水解時間這6 種因素分別進行單因素實驗。運用響應(yīng)面法研究對于酸水解和提取薯蕷皂苷元的最佳工藝條件：以81%乙醇水溶液為提取溶劑，料液比為1∶23，提取80 min，酸濃度為1.27 mol/L，于95 ℃下水解4.5 h 的相應(yīng)條件下，從白背牛尾菜中提取的薯蕷皂苷元的得率為1.71 mg/g。目前，國內(nèi)外對于白背牛尾菜的研究較少，可為其中薯蕷皂苷元的制備提供參考。