精苓鶩棗固體飲料對COPD小鼠肺部炎癥因子的影響

何娜禎 田慧 許志 陳光宇 李亮 謝夢洲

本文引用： 何娜禎， 田? 慧， 許? 志， 陳光宇， 李? 亮， 謝夢洲. 精苓鶩棗固體飲料對COPD小鼠肺部炎癥因子的影響[J]. 湖南中醫藥大學學報， 2024， 44（4）： 580-586.

〔摘要〕 目的 觀察精苓鶩棗固體飲料對慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）模型小鼠肺組織中炎癥反應的影響，探討其可能的作用機制，為該方的臨床應用提供實驗依據，也為中醫藥膳防治COPD提供一定的思路借鑒。方法 將24只雄性C57BL/6小鼠隨機分為正常組、模型組、精苓鶩棗組（2.5 g/kg）、地塞米松組（1.0 mg/kg），每組6只。除正常組外，其他組均采用鼻滴脂多糖聯合香煙煙霧建立COPD小鼠模型。干預30 d后取材，采用HE染色觀察各組小鼠肺組織及脂肪組織iWAT、BAT的病理形態學變化; ELISA檢測小鼠血清和支氣管肺泡灌洗液（broncho alveolar lavage fluid，BALF）中腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-6（interleukin 6，IL-6）含量;qRT-PCR檢測小鼠肺組織中TNF-α、ICAM-1、SELE、 SP-A、SP-D mRNA相對表達水平。結果 與正常組比較，模型組小鼠可見大量炎性細胞浸潤，肺泡壁破壞融合出現肺大泡，脂肪細胞直徑較大，血清及BALF中的TNF-α和IL-6的濃度顯著升高（P<0.01），TNF-α、ICAM-1、SELE mRNA表達水平均顯著升高（P<0.01）;與模型組相比，精苓鶩棗組和地塞米松組小鼠肺組織損傷減輕，iWAT細胞變小緊致，具有棕色化趨勢，BAT細胞分布增多且排列緊密，血清中TNF-α和IL-6水平均降低（P<0.05），精苓鶩棗組和地塞米松組TNF-α、ICAM-1、SELE、SP-A mRNA水平降低（P<0.05）。結論 精苓鶩棗固體飲料能改善COPD模型小鼠肺組織形態，抑制炎性反應，促進肺組織修復。

〔關鍵詞〕 精苓鶩棗固體飲料;COPD;氣道炎癥;炎癥因子;小鼠模型;藥食同源

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2024.04.008

Effects of Jingling Wuzao Solid Beverage on pulmonary?inflammatory factors in mice with COPD

HE Nazhen1，2，4，5， TIAN Hui1，2，4，5， XU Zhi3， CHEN Guangyu1，2，4，5， LI Liang1，2，4，5， XIE Mengzhou1，2，4，5*

1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. Hunan Engineering Research Center of Medicine-Food Homologous Functional Food， Changsha， Hunan 410208， China; 3. Hunan Tianjin Pharmaceutical Co.， Ltd， Changsha， Hunan 410119， China; 4. Provincial Key Laboratory of TCM Diagnostics， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 5. Key Laboratory of TCM Heart and Lung Syndrome Differentiation， Medicated Diet and Dietotherapy， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China

〔Abstract〕 Objective To observe the effects of Jingling Wuzao Solid Beverage （JLWZSB） on the inflammatory response in the lung tissue of mouse models of chronic obstructive pulmonary disease （COPD）， to explore its possible mechanism of action， to provide an experimental evidence for the clinical application of this formula， and to offer some insights for the prevention and treatment of COPD with Chinese medicinal diet therapy. Methods Twenty-four male C57BL/6 mice were randomized into normal， model， JLWZSB （2.5 g/kg）， and dexamethasone （1.0 mg/kg） groups， with six mice in each group. All groups except the normal group were exposed to nasal drops of lipopolysaccharide combined with cigarette smoke to establish the COPD mouse models. Samples were collected after 30 days of intervention. HE staining was used to observe the pathological morphological changes in the lung tissue and adipose tissue iWAT and BAT of each group; ELISA was employed to measure the levels of tumor necrosis factor-α （TNF-α） and interleukin 6 （IL-6） in mouse serum and bronchoalveolar lavage fluid （BALF）; qRT-PCR was conducted to check the relative mRNA expression? levels of TNF-α， ICAM-1， SELE， SP-A， and SP-D in lung tissue of mice. Results Compared with the normal group， the model group mice showed a significant infiltration of inflammatory cells， destruction and fusion of alveolar walls resulting in pulmonary bullae， the diameter of adipocytes was larger in the model group of mice， and a significant increase in the concentrations of TNF-α and IL-6 in serum and BALF （P<0.01）. The mRNA expression levels of TNF-α， ICAM-1， and SELE were significantly elevated （P<0.01）. Compared with the model group， the JLWZSB and the dexamethasone groups showed reduced lung tissue damage， iWAT cells become smaller and tighter with a tendency to brown out， BAT cells become more numerous and tightly arranged in distribution， and decreased levels of TNF-α and IL-6 in serum （P<0.05）， as well as reduced mRNA levels of TNF-α， ICAM-1， SELE， and SP-A （P<0.05）. Conclusion JLWZSB can improve the lung tissue morphology， inhibit inflammatory responses， and promote lung tissue repair in COPD mouse models.

〔Keywords〕 Jingling Wuzao Solid Beverage; chronic obstructive pulmonary disease; airway inflammation; inflammatory factor; mouse model; homology of medicine and food

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是由炎癥和氣道重塑引起的持續氣流阻塞，以慢性咳嗽、咳痰、氣短、喘息等為主要臨床表現的慢性呼吸道疾病，嚴重者可發展為肺心病、肺性腦病等[1]。COPD發病機制復雜，普遍認為和炎癥細胞活化導致肺實質的慢性炎癥有關[2]。近年來，由于環境污染加重及吸煙因素的影響，COPD的患病率和死亡率逐年上升，嚴重影響患者的健康和生活質量[3]。

中醫學認為，COPD屬于“肺脹”“喘證”等范疇。近年來，中醫藥在COPD病防治方面有理論基礎和較好的臨床療效，并獲得了一些成果，日益受到臨床的重視[4-7]。隨著中醫藥事業不斷發展，針對COPD的營養治療研究不斷深入，中醫藥膳在提高營養狀況下可控制臨床癥狀，對疾病預防與康復具有重要作用。

精苓鶩棗固體飲料是由湖南省藥食同源工程中心研發的一款防治COPD的藥膳產品，以養陰潤肺為組方原則，由黃精、茯苓、陳皮、金銀花、魚腥草、大棗、白鴨肉等組成。全方養陰益氣、潤肺健脾、補虛扶正，能夠提升機體正氣。本研究采用鼻滴脂多糖聯合香煙煙霧的方法制備COPD小鼠模型，通過觀察精苓鶩棗固體飲料對模型小鼠一般狀態、體質量的改變情況，以及對小鼠病理形態學的影響，從而為精苓鶩棗固體飲料對COPD患者的防治提供可靠的實驗依據。

1 材料與方法

1.1? 實驗動物

SPF級雄性C57BL/6小鼠24只，由湖南中醫藥大學實驗動物中心訂購，動物實驗許可證號為SCXK（湘）2019-0004，質量合格證號為No.430727221101566954，體質量18～22 g，8周齡。于湖南中醫藥大學實驗動物中心SPF級動物房，室溫（22±2） ℃、相對濕度65%～75%環境下飼養，實驗期間自由飲水、攝食，適應性飼養3 d后用于模型制備。本實驗經湖南中醫藥大學實驗動物倫理委員會審查通過，倫理審批編號：LLBH-202204150004。

1.2? 主要試劑

脂多糖（批號：12352201，廣州碩譜生物科技有限公司）;精苓鶩棗固體飲料（批號：Q/AYTJ0009S，湖南天勁制藥有限責任公司）;醋酸地塞米松（批號：LB2185，浙江仙據制藥股份有限公司）;反轉錄試劑盒（批號：05238502，蘇州近岸蛋白質科技股份有限公司）;超純總RNA提取試劑盒（批號：20220613，杭州新景生物試劑開發有限公司提供）;腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-6（interleukin 6，IL-6）ELISA檢測試劑盒（批號：202211、202210，北京普利萊基因技術有限公司）。

1.3? 主要儀器

自制煙熏箱（80 cm×70 cm×60 cm）;Galileo 38355切片機（意大利DIAPATH公司）;BIOBASE BT-1/B攤片（山東博科醫療器械有限公司）;LightCycler 480實時熒光定量PCR系統（上海羅氏診斷產品有限公司）;iMaik酶標儀（伯樂生命醫學產品上海有限公司）;ZWL-PAI-10超純水機（湖南中沃水務環保科技）;HTP-312型300 g-0.01 g電子天平（上海花潮電器）;TGL18W高速冷凍離心機（長沙英泰儀器有限公司）。

1.4? 分組與造模

隨機將24只雄性C57BL/6小鼠分為4組：正常組、模型組、精苓鶩棗組及地塞米松組，每組6只。其中精苓鶩棗固體飲料是由湖南省藥食同源功能性食品研究中心所研發的針對COPD的功能性食品，成分含有黃精、茯苓、白鴨肉、大棗、陳皮、金銀花、魚腥草等;陽性藥物為地塞米松[8-9]。參考徐叔云教授主編的《藥理實驗方法學》[10]，精苓鶩棗固體飲料用量按每天成人20 g換算成小鼠的用量為2.5 g/kg，造模第31天開始進行灌胃給藥，每天灌胃1次，連續灌胃30 d。本實驗參照文獻[11]采用鼻滴脂多糖聯合香煙煙霧建立COPD小鼠模型，將點燃的8根香煙放入自制煙熏箱中，將造模小鼠放入煙箱，持續暴露于煙霧中，15 min中重新點燃8支香煙放入煙箱，約15 min后待煙霧散盡，休息30 min，重復上述操作。造模第1天和第15天將模型小鼠經鼻滴入脂多糖（50 μL/只，1 mg/mL），正常組小鼠滴入無菌生理鹽水，當日不再進行熏煙操作。造模持續時間為60 d。COPD小鼠模型評價：對小鼠行為學改變、肺組織病理學改變及炎癥因子表達水平等進行評價。（1）小鼠行為學改變：造模成功后的小鼠體質量下降，觀察發現小鼠毛發干枯、發黃、容易掉落，神情倦怠無力，活動減少等，煙熏之后出現點頭呼吸、腹肌抽搐等癥狀;（2）肺組織病理變化：與正常組相比，模型組各級支氣管周圍可見炎性細胞浸潤、管腔狹小、肺泡間隔增寬等;（3）炎癥因子表達水平變化：炎癥因子TNF-α、ICAM-1、SELE作為主要炎癥介質參與COPD的發生發展，在用藥組中表達水平升高。

1.5? 指標檢測

1.5.1? 樣本采集? 各組小鼠摘眼球取血，室溫靜置2 h待血液分層后，4 ℃、2 000 r/min離心10 min，離心半徑為8 cm，吸取上層血清于離心管中，-80 ℃保存。收集支氣管肺泡灌洗液（broncho alveolar lavage fluid，BALF）：對頸部皮膚消毒并脫毛，沿頸部行縱切口，暴露小鼠氣管將無菌留置針插入氣管，無菌縫合線打結固定，由注射器向內注入1 mL生理鹽水，緩慢回抽灌洗液，重復3次（1 mL生理鹽水約回收0.6 mL BALF）后注入無菌EP管于冰上保存。后于離心機中1 500 r/min離心15 min，取上清于-80 ℃保存待測。

1.5.2? 一般狀態評價? 在造模及藥物干預前后對小鼠的體質量、活躍程度、精神狀態、毛發光澤等變化進行觀察記錄。

1.5.3? 體質量觀察? 體質量可在某種程度上反映COPD患者的營養狀態，國內外文獻表明10%～15%的輕中度COPD和50%伴有慢性呼吸衰竭的重度COPD患者都有體質量和營養不良等狀況存在[12]。本實驗通過比較各組小鼠的體質量變化量考察精苓鶩棗固體飲料對小鼠營養狀態的影響。熏煙造模操作持續60 d，對各組小鼠造模后第1天、造模第30天（第31天開始邊熏煙邊給藥）、造模第45天（給藥第15天）、造模第60天（造模結束及給藥結束）的體質量進行觀察。

1.5.4? 病理組織學觀察? 收集完BALF后，取右肺組織。肺組織剝離完成后取小鼠腹股溝白色脂肪組織（inguinal white adipose tissue， iWAT）和小鼠肩胛骨部位的棕色脂肪組織（brown adipose tissue， BAT），精確稱質量后，將右肺組織和脂肪組織置于4%多聚甲醛中固定，取出后依次梯度脫水，進行石蠟包埋，切片，采用HE染色試劑盒對切片進行染色，隨后經脫水、透明、封片后，置于顯微鏡下觀察肺組織和脂肪組織的病理變化。

1.5.5? ELISA檢測? 按照ELISA試劑盒說明書，采用ELISA法測定血清及BALF中IL-6、TNF-α含量。

1.5.6? qRT-PCR檢測? 按照試劑盒說明書，對肺組織進行 RNA 提取、去除基因組DNA 反應、反轉錄反應、終止反應。RT-PCR結果分析采用QuantStudioTM Design&Analysis Software vl.3.0軟件自動生成擴增曲線。TNF-α正向：5'-CCCTCACACTCAGATCATCTTCT-3'，反向：5'-GCTACGACGTGGGCTACAG-3';ICAM-1正向：5'-GTGATGCTCAGGT?ATCCATCCA-3'，反向：5'-CACAGTTCTCAAAGCA?CAGCG-3';SELE正向：5'-ATGCCTCGCGCTTTCT?CTC-3'，反向：5'-GTAGTCCCGCTGACAGTATGC-3';SP-A正向：5'-GAGGAGCTTCAGACTGCACTC-3'，反向：5'-AGACTTTATCCCCCACTGACAG-3';SP-D正向：5'-AAGGTCCACGGGGTGAGAA-3'，反向：5'-TTTGCCTTGAGGTCCTATGTTC-3'。采用2-ΔΔCt法計算mRNA的相對表達水平。

1.6? 統計學方法

采用SPSS 25.0 統計學軟件分析實驗數據，以“x±s”表示各組數據實驗結果。采用單因素方差分析進行組間比較，P<0.05表示差異有統計學意義，統計圖采用GraphPad Prism 8.0.2 繪制。

2 結果

2.1? 各組小鼠一般情況

實驗期間，正常組小鼠毛發光亮柔順，飲食正常，進行稱重、灌胃等處理時四肢掙扎力度較大;與正常組小鼠相比，其他熏煙組小鼠可見毛發干枯發黃，易于脫落，弓背蜷縮，活動減弱，體質量相比正常組增長明顯緩慢或下降;與模型組小鼠相比，各給藥組小鼠用藥后毛發干枯掉落現象有所好轉，體質量略有穩定或上升，神情倦怠情況有所好轉。

2.2? 各組小鼠體質量變化

造模第30天正常組體質量有明顯增長，其余各組體質量增長緩慢。造模后第30、45、60天，與正常組比較，模型組體質量顯著降低（P<0.001）;與模型組比較，造模后第30、45天，精苓鶩棗組體質量顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，造模后第45、60天，地塞米松組體質量顯著升高（P<0.05，P<0.01）。造模第60天時模型組體質量呈負增長。詳見表1和圖1。

2.3? 精苓鶩棗對COPD小鼠肺組織的病理學形態影響

正常組小鼠肺泡組織結構完整，未見明顯炎性細胞浸潤及出血情況;模型組小鼠可見大量炎性細胞浸潤，肺泡壁破壞融合出現大量肺大泡，符合慢阻肺小鼠肺組織病理學改變;經用藥干預后，精苓鶩棗組小鼠肺組織病理學損傷、炎性細胞浸潤程度有不同程度減輕，肺大泡數量減少，大小較為均勻。詳見圖2。

2.4? 精苓鶩棗對COPD小鼠脂肪組織的病理學形態影響

通過HE染色觀察iWAT和BAT的脂肪細胞大小的變化，相對于正常組，模型組小鼠皮下iWAT較為松散，脂肪細胞直徑較大，細胞中脂滴為單室且直徑較大;BAT數量減少，細胞直徑較大，細胞中脂滴數量少。與模型組相比，精苓鶩棗組和地塞米松組小鼠iWAT細胞變小緊致，具有棕色化趨勢;BAT細胞分布增多排列緊密，細胞中含有大量脂滴，脂滴為多室且脂滴直徑比較小。詳見圖3。

2.5? 精苓鶩棗對COPD小鼠炎癥因子表達的影響

與正常組比較，其余組小鼠血清及BALF中的TNF-α和IL-6的濃度均有明顯升高（P<0.01）。與模型組比較，精苓鶩棗組和地塞米松組血清和BALF中TNF-α和IL-6水平均降低（P<0.05）。與地塞米松組相比，精苓鶩棗組血清及BALF中TNF-α、IL-6水平較高，但差異無統計學意義（P>0.05）。詳見圖4。

2.6? COPD小鼠肺組織中TNF-α、ICAM-1、SELE、SP-A、SP-D mRNA表達

與正常組相比，其余各組小鼠肺組織中炎癥因子TNF-α、ICAM-1、SELE mRNA表達水平均顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，精苓鶩棗組和地塞米松組肺組織中TNF-α、ICAM-1、SELE、SP-A mRNA水平降低（P<0.05），其中精苓鶩棗組ICAM-1 mRNA相對表達量低于地塞米松組（P>0.05）。詳見圖5。

3 討論

COPD是一種全身性炎癥、氣流受阻為主要特征的疾病，COPD被認為是炎癥和細胞凋亡反應失調，主要表現為氣道及肺部炎癥和多器官損傷，大量細胞因子參與COPD的發生發展[13]。吸煙是導致COPD最重要的因素之一[14]，可導致肺部炎癥細胞活化，釋放出TNF-α、IL-6等炎性因子。研究表明，TNF-α、IL-6表達水平增加，會加劇COPD患者的病情[15-16]。本研究采用煙熏聯合鼻內滴入脂多糖方法構建COPD模型[17]，HE染色結果顯示，小鼠肺組織中氣管狹窄，炎性細胞浸潤，肺泡結構破壞，肺泡腔變大，以上改變符合COPD的病理特征，提示造模成功。ELISA結果顯示，與正常組比較，模型組血清和肺組織中TNF-α、IL-6的表達水平明顯升高;與模型組相比，精苓鶩棗組血清中TNF-α、IL-6表達降低，但在BALF中TNF-α、IL-6表達無顯著差異，表明精苓鶩棗固體飲料能改善部分COPD相關指標。營養不良的小鼠脂肪組織空泡脂滴會增多，用藥組的脂肪組織可見空泡脂滴減少，白色脂肪細胞棕色化與脂肪組織中炎癥因子的水平相關，可以減輕炎癥反應，WAT擴張過度使脂肪細胞肥大，會伴隨多種炎癥因子的產生和分泌增加[18]。通過觀察脂肪組織病理學，與正常組比較，模型組小鼠脂肪細胞直徑較大，可能產生炎癥反應，與模型組比較，精苓鶩棗組小鼠細胞變小緊致，具有棕色化趨勢，BAT細胞分布增多排列緊密，提示炎癥反應減輕。體質量結果顯示，與正常組比較，模型組小鼠體質量顯著降低，精苓鶩棗固體飲料干預后小鼠體質量顯著升高，表明精苓鶩棗固體飲料能改善COPD模型小鼠的營養狀態，提示TNF-α、IL-6等炎性因子介導的炎癥反應可能對COPD小鼠的營養狀態有影響。PCR結果顯示，與正常組相比，模型組小鼠肺組織中炎癥因子TNF-α、ICAM-1、SELE mRNA表達水平顯著升高;精苓鶩棗組相對模型組TNF-α、ICAM-1、SELE mRNA水平降低，表明精苓鶩棗固體飲料可以有效改善機體炎癥水平。

精苓鶩棗固體飲料以養陰潤肺的原則立方，由黃精、茯苓、陳皮、金銀花、魚腥草、大棗組成，均為藥食同源類藥材。方中黃精滋陰補肺、補脾益氣，茯苓利水滲濕、健脾、寧心安神，二味共為君藥;大棗助黃精增強補中益氣之功，陳皮理氣健脾、燥濕化痰，二者共為臣藥;配以金銀花、魚腥草清熱解毒，以清解肺熱見長，諸藥配伍具益氣養陰、潤肺健脾之功效。本研究通過實驗觀察精苓鶩棗固體飲料對COPD小鼠炎癥反應的影響，結果顯示，精苓鶩棗固體飲料能減輕COPD模型小鼠肺組織的損傷，并且抑制炎性因子TNF-α和IL-6的表達水平，并影響炎癥指標ICAM-1、SELE水平，改善機體炎癥水平，改善肺組織的功能。

目前，對于COPD治療的中藥研究是研究的熱點[19-20]，基于藥食同源的理論，中醫藥膳以其“寓醫于食”的優勢用于COPD在臨床上已得到了一定的應用。本研究初步證實了精苓鶩棗固體飲料對COPD炎癥的作用機制，在抗炎、調節免疫及改善營養不良方面有一定作用，為產品的功能性提供了科學合理的證據，也為臨床研究及工業化生產、推廣提供了實驗依據。

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〔基金項目〕湖南省重點研發計劃（2021-2022年）項目（第二批）（2022SK2018）。

〔通信作者〕*謝夢洲，女，博士，教授，博士研究生導師，E-mail：xiemz64@163.com。