固本平喘方對慢性阻塞性肺疾病模型大鼠氣道MUC5AC水平的影響

吳陽洋 歐陽桂蘭 陳新海 游柏穩

本文引用： 吳陽洋， 歐陽桂蘭， 陳新海， 游柏穩. 固本平喘方對慢性阻塞性肺疾病模型大鼠氣道MUC5AC水平的影響[J]. 湖南中醫藥大學學報， 2024， 44（4）： 565-571.

〔摘要〕 目的 使用固本平喘方對香煙煙霧暴露聯合氣管滴注脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、豬胰彈性蛋白酶（porcine pancreatic elastase，PPE）造模大鼠進行干預，以主要分泌性黏蛋白5AC（mucin5AC，MUC5AC）作為評價指標，測定肺組織MUC5AC含量、蛋白表達、mRNA表達，評價各組氣道黏液分泌強度。方法 將64只SPF級SD大鼠適應性飼養1周后，隨機取52只進行造模，造模成功后取50只隨機分為模型組（蒸餾水）、地塞米松組（0.15 mg·kg-1）及固本平喘方高（28 g·kg-1）、中（14 g·kg-1）、低（7 g·kg-1）劑量組，每組10只，另取10只大鼠為對照組（蒸餾水）。15 d后處死大鼠并收集標本。HE染色觀察大鼠肺組織病理學變化;ELISA法檢測肺組織MUC5AC水平;RT-PCR檢測肺組織MUC5AC mRNA表達水平;Western blot檢測肺組織MUC5AC蛋白表達;免疫熒光檢測肺組織MUC5AC表達分布態勢。結果 模型組大鼠肺組織結構顯著破壞，肺泡腔內及肺間質見大量炎性浸潤;地塞米松組及固本平喘方各劑量組可見肺泡腔受損程度及組織炎性浸潤程度減輕。與對照組比較，其余各組MUC5AC含量均升高（P<0.05）;與模型組比較，地塞米松組及固本平喘方各劑量組MUC5AC含量及MUC5AC mRNA表達均下降（P<0.05），地塞米松組及固本平喘方高、中劑量組MUC5AC蛋白表達降低（P<0.05）。肺組織免疫熒光可見，MUC5AC在模型組中呈現強表達，在地塞米松組中呈現較弱表達，在固本平喘方低、中、高劑量組中，表達強度依次減弱。結論 固本平喘方可改善慢性阻塞性肺疾病模型大鼠的肺組織病理損傷，有效減少MUC5AC含量、下調MUC5AC mRNA表達、降低MUC5AC蛋白表達，改善大鼠氣道黏液高分泌狀態。

〔關鍵詞〕 慢性阻塞性肺疾病;固本平喘方;黏蛋白5AC;氣道黏液狀態

〔中圖分類號〕R256.1? ? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2024.04.006

Effects of Guben Pingchuan Formula on MUC5AC level in the airway of chronic obstructive pulmonary disease model rats

WU Yangyang， OUYANG Guilan， CHEN Xinhai， YOU Bowen*

The Second Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410000， China

〔Abstract〕 Objective Using Guben Pingchuan Formula （GBPCF） to intervene the rat model established by cigarette smoke exposure combined with tracheal instillation of lipopolysaccharide （LPS） and porcine pancreatic elastase （PPE）， taking mucin 5AC （MUC5AC） as the evaluation indicator， so as to measure its content， protein expression， and mRNA expression in the rat lung tissue and evaluate the airway mucus secretion intensity in each group. Methods After one week of adaptive feeding of 64 SPF-level SD rats， 52 of them were randomly taken for modeling. After successful modeling， 50 model rats were randomized into model group （distilled water）， dexamethasone group （0.15 mg·kg-1）， and GBPCF high- （28 g·kg-1）， medium- （14 g·kg-1）， and low-dose groups （7 g·kg-1）， with ten rats in each group. Another ten rats were selected as control group （distilled water）. After 15 days， the rats were euthanized and specimens were collected. HE staining was used to observe the pathological changes in the lung tissue of rats， ELISA to determine the level of MUC5AC in the lung tissue， RT-PCR to measure MUC5AC mRNA expression level， Western blot to examine MUC5AC protein expression， and immunofluorescence to check the distribution pattern of MUC5AC expression. Results The pulmonary tissue structure of the model group was notably damaged， with a large amount of inflammatory infiltration in the alveolar cavity and pulmonary interstitium. The degree of alveolar damage and tissue inflammatory infiltration was reduced in the dexamethasone group and GBPCF groups of various doses. Compared with the control group， the content of MUC5AC in all other groups increased （P<0.05）. Compared with the model group， the content and mRNA expression of MUC5AC in the dexamethasone group and GBPCF groups of various doses decreased （P<0.05）， and the MUC5AC protein expression in the dexamethasone group， the high-and medium-dose groups of GBPCF decreased （P<0.05）. Immunofluorescence of the lung tissue revealed strong MUC5AC expression in the model group， weaker expression in the dexamethasone group， and successively decreased expressions in the low-， medium-， and high-dose groups of GBPCF. Conclusion GBPCF can alleviate the pathological damage of lung tissue in model rats of chronic obstructive pulmonary disease （COPD）， effectively reduce MUC5AC content， downregulate MUC5AC mRNA expression， decrease MUC5AC protein expression， and improve the high secretion state of airway mucus in rats.

〔Keywords〕 chronic obstructive pulmonary disease; Guben Pingchuan Formula; mucin 5AC; airway mucus

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一組慢性支氣管炎和（或）肺氣腫合并氣流受限，并可進一步發展為呼吸衰竭和肺心病的慢性疾病，常與煙霧及其他毒性顆粒的長期刺激密切相關[1]。目前，因COPD死亡的人群已占據全球死亡原因的第三位[2]，已成為全球范圍內的嚴重公眾安全問題。目前認為，氣道黏液高分泌是COPD的重要病理特點[3]，最新的COPD全球倡議指南亦將慢性黏液高分泌作為COPD急性加重的一項重要依據[4]。黏蛋白5AC（mucin5AC，MUC5AC）作為主要的分泌性氣道黏蛋白，在肺組織中的含量及蛋白、mRNA表達量可作為判斷氣道黏液高分泌的重要評估手段[5]。本實驗選擇固本平喘方作為干預措施，以研究其對COPD模型大鼠氣道MUC5AC水平的影響。

1 材料

1.1? 實驗動物

選取健康7周齡SPF級SD大鼠64只（皆為雄性），體質量（200±20） g。大鼠由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，實驗動物生產許可證號為SCXK（湘）2019-0004。飼養設施由湖南中醫藥大學第一附屬醫院醫學創新實驗中心提供，使用許可證號為SYXK（湘）2020-0010。飼養環境溫度為（22±2） ℃，適應性飼養7 d后進行實驗。本實驗所涉及的動物實驗操作經湖南中醫藥大學第一附屬醫院醫學創新實驗中心實驗動物倫理委員會批準，倫理編號為ZYFY20211220。

1.2? 藥物

（1）固本平喘方組成：黨參10 g，黃芪30 g，白術10 g，茯苓15 g，法夏10 g，陳皮6 g，補骨脂10 g，菟絲子10 g，苦杏仁10 g，紫蘇子10 g，紅景天10 g，炙甘草6 g。購于湖南中醫藥大學第二附屬醫院中藥房。中藥煎煮2次，分別加入10、8倍量水，各煎煮1 h，合并2次藥液，過濾去沉淀，合并濾液，蒸發濃縮至每毫升藥液含生藥1 g，冷卻后置于4 ℃冰箱備用，臨用前用蒸餾水配成所需濃度。

（2）地塞米松片：生產廠商為浙江仙琚制藥，國藥準字為H33020822，生產批號為210330，規格為0.75 mg/片。

1.3? 主要試劑

2%戊巴比妥鈉（山東西亞化學工業有限公司，批號：57-33-0）;4%多聚甲醛溶液（中國Biosharp公司，批號：30525-89-4）;MUC5AC ELISA試劑盒（江蘇菲亞生物科技有限公司，批號：2206M09）;逆轉錄試劑盒（北京康為世紀生物科技有限公司，批號：CW2569）;核酸染料（北京普利萊基因科技有限公司，批號：PB11141）;蛋白上樣緩沖液、Tris-HCl緩沖液、山羊抗兔免疫球蛋白IgG（中國Abiowell公司，批號：AWB0055、AWB0073、AWS0002）;MUC5AC兔抗（美國ThermoFisher公司，批號：PA5-79705）;HRP-山羊抗兔、CY3山羊抗兔IgG（湖南艾方生物科技有限公司，批號：AFIHC003、AFSA006）;豬胰彈性蛋白酶（porcine pancreatic elastase，PPE）（上海Acmec公司，批號：39445-21-1）;脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）（美國Sigma-Aldrich公司，批號：L2880-100MG）;白沙牌香煙（湖南中煙工業有限責任公司，焦油量：10 mg，煙氣煙堿量：0.8 mg，煙氣一氧化碳量：12 mg，序列號：6901028191135）。

1.4? 主要儀器

自制煙熏箱;移液器（德國艾本德股份公司，型號：Finnpipette-4641080N）;離心機（長沙湘智離心機儀器有限公司，型號：TG16W）;臺式冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司，型號：H1650R）;熒光定量RCP儀、熒光PCR板（美國Thermo公司，型號：PIKOREAL96、SPL0960）;電泳儀、水平瓊脂糖電泳槽（北京六一生物科技有限公司，型號：DYY-6C、DYCZ-24DN）;旋渦混合器（江蘇其林貝爾儀器制造有限公司，型號：GL-88B）;磁力攪拌器（上海儀電科學儀器股份有限公司，型號：81-2）;生物樣品均質儀（杭州奧盛儀器有限公司，型號：BioPrep-24）;化學發光成像系統（上海勤翔科學儀器有限公司，型號：ChemiScope6100）。

2 方法

2.1? 動物模型的制備

將64只SPF級SD大鼠適應性飼養1周后，采用隨機數字表法選取其中52只，采用香煙煙霧暴露聯合氣管滴注LPS、PPE的方法[6-7]制備COPD大鼠模型。大鼠每日兩次被動吸煙，每次時長60 min，每次被動吸煙間隔時間≥5 h，共煙熏4周。除此之外，日常飼養保證與對照組一致，并在煙熏首日及第14日行氣管內滴注LPS、PPE。

氣管內滴注LPS、PPE操作方法：首先使用1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，固定大鼠，剃去頸部毛發，消毒后縱形切開并向下剝離組織，暴露氣管后使用1 mL注射器先抽取0.3 mL空氣，再分別抽取LPS（0.1 mg/0.1 mL）及PPE（10 U/0.1 mL）快速注入氣管，旋轉固定大鼠，使LPS、PPE均勻分布雙肺，隨后消毒傷口并縫合，放入籠盒待蘇醒。術后7 d每日用青霉素沖洗傷口預防感染;對照組于第1日及第14日氣管內滴注等量生理鹽水。

造模完成后，立即從對照組和COPD造模組中分別隨機抽取2只進行檢測。分別稱重記錄，麻醉后處死，取肺組織，立即用組織溶液固定后，送湖南中醫藥大學第二附屬醫院病理科進行病理檢驗，行HE染色，觀察肺組織情況。大鼠肺組織出現支氣管管壁增厚、炎性細胞浸潤、肺泡間隔增寬、肺泡腔擴張融合，形成肺大皰即提示造模成功[8]。

2.2? 分組及給藥

從64只雄性大鼠中隨機抽取12只作為對照組，52只作為COPD造模組。待造模完成后，從兩個組中隨機抽取2只大鼠取肺組織送病檢，觀察造模情況。對照組剩余10只大鼠，將造模完成后的50只大鼠按隨機數字表法分為5組：模型組、地塞米松組及固本平喘方高、中、低劑量組，每組10只，總計6組。

將制備好的固本平喘方參照《藥理實驗方法學》[9]，根據人和大鼠劑量換算系數進行換算，結合固本平喘方臨床成人每日給藥量為137 g生藥/60 kg，計算可得人每日所需藥量為2.28 g/kg，按照高、中、低劑量以臨床劑量的2倍、1倍、1/2倍計算，得出固本平喘方高、中、低劑量組劑量分別為28、14、7 g/kg。將固本平喘方用蒸餾水溶解至相應濃度進行灌胃處理;對照組和模型組大鼠用同等劑量蒸餾水灌胃，連續灌胃14 d。地塞米松組按人與大鼠體表面積折算，以0.15 mg/kg兌溫水灌胃，持續14 d。第15日處死所有大鼠。

2.3? 標本收集

將處死大鼠的左肺葉取下，沖洗完成后，以3 000 r/min離心10 min（離心半徑8 cm），將上清液分裝于EP管中，置于-80 ℃冰箱中以備MUC5AC定量檢測。將各組大鼠右肺前葉、中葉用4%多聚甲醛溶液浸泡固定，用作病理切片操作。將各組大鼠的右肺后葉、副葉放入EP管中，經過液氮冷凍處理，然后將其放入-80 ℃冰箱中冷凍保存，以進行RT-PCR、Western blot和免疫熒光檢測。

2.4? 觀察指標

2.4.1? HE染色觀察大鼠肺組織病理學變化? 將固定后的大鼠右肺前葉組織流水沖洗30 min，梯度乙醇脫水，二甲苯替換出乙醇透明，浸蠟包埋后切片并染色封片，使用光鏡觀察肺組織病理變化。

2.4.2? ELISA法檢測肺組織MUC5AC水平? 采用ELISA試劑盒檢測肺組織MUC5AC水平，嚴格按試劑盒說明書進行操作。

2.4.3? Western blot檢測肺組織MUC5AC蛋白表達

取冷凍肺組織25 mg，用冰預冷PBS洗組織，加入300 μL RIPA裂解液裂解10 min;4 ℃、12 000 r/min離心15 min（離心半徑9 cm）。制膠后取200 μL蛋白上清液電泳，電泳結束后轉膜。轉膜完畢后將膜取出，放入1×PBST中洗1次。并用1×PBST配制5%脫脂奶粉，浸膜，室溫放置90 min;一抗（稀釋比例為1∶1 000）孵育，4 ℃過夜，次日室溫放置30 min;孵育結束，1×PBST洗3次，每次15 min。二抗（稀釋比例為1∶5 000）孵育90 min，孵育結束，1×PBST洗3次，每次10 min。最后ECL顯色曝光，凝膠成像系統成像。

2.4.4? 免疫熒光檢測肺組織MUC5AC表達分布態勢? 冰凍切片室溫晾干15 min后用組化筆將待染組織畫圈，將切片放入PBS溶液晃動洗滌3次，每次5 min;甩干PBS，滴加10%驢血清封閉30 min。甩掉封閉液，滴加一抗（即用型），濕盒4 ℃孵育過夜。吸去抗體后室溫下PBS洗滌3次，每次5 min。切片稍甩干后在圈內滴加與一抗相應種屬的 HRP 標記的二抗（稀釋比例為1∶200），室溫孵育50 min。PBS洗滌3次，每次5 min。加入4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）（1∶400）室溫孵育10 min，PBS清洗3次，每次5 min。切片甩干后在圈內滴加自發熒光淬滅劑，孵育5 min，最后流水沖洗10 min后封片、熒光顯微鏡觀察并拍照。

2.4.5? RT-PCR檢測肺組織MUC5AC mRNA表達

取肺組織20 mg，加入1 mL Trizol于勻漿器中充分研磨勻漿，混勻后室溫裂解5 min，提取總RNA后以組織總mRNA為模板，逆轉錄cDNA，最后進行熒光定量PCR反應。反應條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，共計40個循環。用2-Ct法計算表達水平，MUC5AC引物序列如下：正向CAACTT?CAGCCACATCGTCT;反向CTGCCATCTATCCAAT?CAGTCC。

2.5? 統計方法

采用SPSS 23.0軟件進行數據處理，所有數據以“x±s”表示，多組計量資料組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用LSD法，以P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1? 各組大鼠肺組織病理改變比較

對照組大鼠鏡下肺組織黏膜上皮和肺泡結構未見明顯異常，支氣管管壁無增厚，管腔內纖毛排列整齊，肺間質內未見炎性細胞浸潤，肺泡未見擴張;模型組大鼠肺組織可見肺泡腔明顯擴張，伴大量肺泡壁變薄甚至斷裂，部分融合成肺大泡，支氣管管腔纖毛倒伏，排列紊亂，肺泡腔內及肺間質可見大量炎性浸潤;與模型組比較，固本平喘方各劑量組可見肺泡腔擴張程度顯著減輕，支氣管管腔變形較少，管腔纖毛排列相對整齊，組織炎性浸潤程度較輕。詳見圖1。

3.2? 各組大鼠肺組織MUC5AC含量比較

與對照組比較，模型組、地塞米松組及固本平喘方各劑量組中MUC5AC含量均升高（P<0.05）;與模型組比較，地塞米松組、固本平喘方各劑量組中MUC5AC含量均降低（P<0.05）;與地塞米松組比較，固本平喘方低劑量組MUC5AC含量升高（P<0.05），固本平喘方高劑量組MUC5AC含量降低（P<0.05）;與固本平喘方低、中劑量組比較，固本平喘方高劑量組MUC5AC含量降低（P<0.05）。詳見表1。

3.3? 各組大鼠肺組織MUC5AC mRNA表達比較

與對照組比較，模型組、地塞米松組及固本平喘方低、中劑量組MUC5AC mRNA表達升高（P<0.05）;與模型組比較，地塞米松組及固本平喘方各劑量組MUC5AC mRNA表達降低（P<0.05）;與地塞米松組及固本平喘方低、中劑量組比較，固本平喘方高劑量組MUC5AC mRNA表達降低（P<0.05）。詳見表2。

3.4? 各組大鼠氣道MUC5AC蛋白表達比較

與對照組比較，模型組、地塞米松組及固本平喘方各劑量組MUC5AC蛋白表達均升高（P<0.05）;與模型組比較，地塞米松組及固本平喘方中、高劑量組MUC5AC蛋白表達降低（P<0.05）;與地塞米松組比較，固本平喘方低劑量組MUC5AC蛋白表達升高（P<0.05），固本平喘方高劑量組MUC5AC蛋白表達降低（P<0.05）;與固本平喘方低劑量組比較，固本平喘方中、高劑量組MUC5AC蛋白表達降低（P<0.05）;與固本平喘方中劑量組比較，固本平喘方高劑量組中MUC5AC蛋白表達降低（P<0.05）。詳見表3、圖2。

3.5? 各組大鼠肺組織免疫熒光結果比較

MUC5AC在對照組大鼠肺組織內呈弱表達，表現為細胞胞漿和細胞間隙中的暗淡熒光;在模型組大鼠肺組織中呈現強表達，為明亮熒光;在地塞米松組中，表現為較暗的熒光;在固本平喘方低、中、高劑量組中，熒光強度依次減弱。詳見圖3。

4 討論

由于煙霧等毒性氣體的長期刺激，COPD患者的氣道炎性反應十分活躍，鏡下可見細支氣管以漿細胞、淋巴細胞為主的各類炎性浸潤，基底部肉芽組織和機化纖維組織增生導致管腔狹窄，管壁黏液腺及杯狀細胞增生、肥大，分泌亢進，腔內分泌物潴留[10]。氣道黏液高分泌是COPD患者的重要病理特征，這種情況同樣存在于無咳嗽和咯痰癥狀的COPD患者中[11]。長期的黏液潴留可導致氣道纖毛功能障礙，引發局部防御功能下降，進一步加重氣道阻塞。反復的黏液潴留促使細菌定植，使感染反復加重，又刺激氣道進一步分泌黏液[10]。感染和黏液高分泌是COPD的獨立危險因素[12-13]。而MUC5AC則是氣道的主要分泌性黏蛋白，位于氣道表面的上皮細胞層，其蛋白表達量及mRNA轉錄水平是衡量氣道黏液分泌程度的重要指標[14]。

氣道黏液高分泌的調節機制較為復雜，而黏液高分泌通常是指黏蛋白基因調節、生物合成、分泌釋放全過程。其中，表皮生長因子受體（epidermal growthfactor receptor，EGFR）信號通路是諸多刺激因子[包括中性粒細胞彈性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）、香煙煙霧、細菌感染、細胞因子及炎癥介質等]誘導MUC5AC基因表達的共同通路，是黏液高分泌的最普遍途徑。多種刺激物可通過MAPK信號途徑，上調MUC5AC基因轉錄和黏蛋白生成[15-16]。既往已有多項研究表明，多種細胞因子和炎性介質對黏液分泌有促進作用，且不同因子和介質之間存在協同效應[17-19]。另外，NE是目前已知的最強有力的促黏液分泌因子[20]，可通過釋放轉化生長因子-α活化EGFR，延長MUC5AC mRNA半衰期[21];同時，NE還能通過杯狀細胞脫顆粒促進黏液高分泌[22]。此外，吸煙、感染均可活化EGFR而增加MUC5AC mRNA表達，促進黏液高分泌[23]。

COPD屬于中醫學“肺脹”“喘證”范疇，肺體用俱損，呼吸機能紊亂，氣機滯留于肺，痰瘀阻于氣道而致肺體脹滿。在疾病的發展過程中，本虛逐漸加重，而痰濁、血瘀貫穿始終[24]。疾病晚期，本虛、標實相合為患，肺痿廢不用。故治當補肺益氣、健脾化痰、活血化瘀，標本兼顧，祛邪補正。固本平喘方中黨參、黃芪為君，白術、茯苓為臣。黨參味甘，性平，可健脾補肺益氣;黃芪味甘，性微溫，可大補肺脾之氣。白術苦、甘而溫，與黃芪相配更得補氣健脾之功;茯苓甘淡，性平，與白術共用健脾滲濕，更助化痰。法半夏、陳皮、補骨脂、菟絲子共為佐藥。法半夏、陳皮共伍，健脾化濕、止咳化痰之效益甚;補骨脂、菟絲子溫脾補腎、納氣平喘。紫蘇子、苦杏仁、紅景天為使。其中，紫蘇子、杏仁可降氣消痰、止咳平喘;紅景天可益氣活血、通脈平喘。全方共奏補肺、健脾、固腎、化痰、活血、平喘之功效。

本研究使用固本平喘方對香煙煙霧暴露聯合氣管滴注LPS、PPE造模大鼠進行干預，造模成功后，模型組大鼠可見肺組織結構明顯破壞，符合COPD病理改變。固本平喘方干預后，大鼠肺泡腔擴張程度較對照組顯著減輕，支氣管管腔變形較少，管腔纖毛排列相對整齊，組織炎性浸潤程度較輕，提示固本平喘方對改善COPD模型大鼠的肺組織病理損害具有良好的效果。同時，以MUC5AC作為評價指標，測定肺組織MUC5AC含量、mRNA表達、蛋白表達及蛋白熒光強度，評價各組氣道黏液分泌強度。結果顯示，模型組肺組織中MUC5AC含量及MUC5AC mRNA表達、蛋白表達、蛋白熒光強度相較于對照組均顯著升高，而地塞米松及固本平喘方能顯著降低肺組織中MUC5AC含量、下調MUC5AC mRNA表達、減少MUC5AC蛋白表達、減弱MUC5AC蛋白熒光強度。

綜上所述，固本平喘方可改善COPD模型大鼠的肺組織病理損傷，有效減少MUC5AC含量、下調MUC5AC mRNA表達、降低MUC5AC蛋白表達，改善大鼠氣道黏液高分泌狀態。固本平喘方有望成為COPD新的治療藥物，但其具體作用機制有待進一步研究。

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〔基金項目〕湖南省中醫藥管理局重點項目（2021003）。

〔通信作者〕*游柏穩，男，博士，教授，碩士研究生導師，E-mail：13974955546@163.com。