重癥醫學科產KPC-2 肺炎克雷伯菌的耐藥情況分析及同源性研究

戚麗敏，陳建軍

1.睢寧縣人民醫院檢驗科，江蘇徐州 221200；2.徐州市第一人民醫院檢驗科，江蘇徐州 221002

肺炎克雷伯菌常存在人體呼吸道及腸道內，是正常腸道微生物群的一部分，而在免疫系統明顯削弱時可引發感染，特別是肺部感染，病情嚴重者可引發胸腔積液等并發癥[1]。對此類感染者常在早期實施抗生素治療，然而目前抗生素的濫用現象較為普遍，這導致病原菌較易產生超廣譜耐藥酶，進而對各抗生素產生耐藥作用[2]。因此近幾年臨床由肺炎克雷伯菌引發的感染率明顯上升，同時耐藥菌株數量顯著增加，這使得患者病情較易反復[3]。肺炎克雷伯菌產生對碳青霉烯類藥物的耐藥性主要歸因于它含有的碳青霉烯酶-2（Klebsiella Pneumoniae Carbapenemase, KPC-2），這種酶使其能夠抵抗碳青霉烯類抗生素的作用[4-5]。本研究回顧性選取2020年10 月—2022 年9 月睢寧縣人民醫院收治的46 例重癥醫學科患者的臨床資料，從中提取46 株耐青霉烯類肺炎克雷伯菌菌株實施耐藥性和同源性分析，旨在為臨床正確應用抗生素提供合理依據。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性選取本院收治的46 例產KPC-2 肺炎克雷伯菌感染患者的臨床資料，送檢標本中共分離出46 株耐青霉烯類肺炎克雷伯菌菌株。其中痰液37例，尿液4 例，血液4 例，分泌物1 例。

1.2 方法

①藥敏試驗。應用革蘭氏陰性菌卡片及藥敏分析系統對本次研究標本進行測試，以符合美國臨床與實驗室標準協會（Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI）相關準則做出最終判斷。②對46 株耐青霉烯類肺炎克雷伯菌菌株行青霉烯酶表型檢測，方式為改良碳青霉烯滅活試驗聯合EDTA 改良碳青霉烯滅活試驗。陽性、陰性菌株分別為肺炎克雷伯菌ATCC BAA1705、ATCC BAA1706。改良碳青霉烯滅活試驗如下：將于平板上過夜孵育的1 μL 滿環細菌接種至2 mL 的TSB 培養基管內，漩渦震蕩10～15 s，培養管內加入美羅培南紙片，設置溫度35℃，孵育4 h；用生理鹽水制備大腸埃希菌ATCC25922，并使用紙片擴散法將其涂抹在瓊脂培養基（Mueller Hinton Agar,MHA）培養基上，在平板上干燥3～10 min 后放置美羅培南紙片，在10 μl 接種環中取出部分TSB 培養基內的美羅培南紙片菌懸液，然后用相同接種環自培養基試管內取出美羅培南紙片，將該紙片黏附于已涂有敏感大腸埃希菌ATCC25922 的MHA瓊脂表面。倒置MHA 平板，35℃孵育18～24 h，最后用紙片擴散法測量抑菌圈直徑。EDTA 改良碳青霉烯滅活試驗如下：在第2 個2 mL 的TSB 管內進行標記以進行實驗，然后向管內加入20 μL 的0.5 mol/L 的EDTA，使之濃度為5 mmol/L，根據改良碳青霉烯滅活試驗步驟進行操作，且平行處理改良碳青霉烯滅活試驗管及EDTA 改良碳青霉烯滅活試驗管，取出管內美羅培南紙片貼于涂有美羅培南敏感大腸埃希菌ATCC25922 的相同MHA 平板上。③耐藥基因檢測。用水煮法取肺炎克雷伯菌的DNA，并用聚合酶鏈反應（Polymerase Chain Reaction, PCR）擴增肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶的耐藥基因。通過凝膠電泳技術以檢查擴增產物的結果。④DNA 測序。對肺炎克雷伯菌中的碳青霉烯酶陽性菌株進行PCR 擴增，然后純化所得的PCR產物，將DNA 樣本送至DNA 測序儀進行測序，測序結果與已知DNA 序列比對，確定菌株的基因型。⑤同源性分析。取17 株ICU 分離的耐碳青霉烯酶類肺炎克雷伯菌實施脈沖電泳凝膠電脈分析。分析后用溴化乙錠（Ethidium Bromide, EB）染色，凝膠成像，得到圖像，并以此實施聚類分析，根據脈沖場凝膠電泳（Pulsed Field Gel Electrophoresis, PFGE）解釋標準及Dice 系數以分析脈沖電泳凝膠電脈帶型間的相似度，將80%設為相似度的臨界值，從而評估不同菌株間的遺傳親緣性。

2 結果

2.1 藥敏試驗

待測菌對慶大霉素、阿米卡星、替加環素、復方新諾明存在敏感性。見表1。

表1 藥敏試驗結果[n(%)]

2.2 mCIM 及eCIM 試驗

46 株耐碳青霉烯酶類肺炎克雷伯菌的mCIM 陽性，eCIM 陰性，且均為產絲氨酸碳青霉烯酶菌株。

2.3 耐藥基因

經PCR 擴增，46 株待測菌株內有肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶型基因46 株，陽性率為100.00%。

2.4 DNA 測序

PCR 擴增產物測序結果證實為KPC-2 型基因。見圖1。

圖1 KPC-2 型基因

2.5 同源性分析

ICU 的17 株耐碳青霉烯酶類肺炎克雷伯菌同源性分析結果見圖2，且該菌株可分為3 個克隆型，分別含有11 個、5 個及1 個菌株。見圖2。

圖2 17 株耐碳青霉烯酶類肺炎克雷伯菌同源性分析結果

3 討論

近年來雖然耐碳青霉烯酶類肺炎克雷伯菌的檢出率逐年增加，但其臨床治療難度卻并未顯著降低[6-7]。了解肺炎克雷伯菌的耐藥機制及同源情況對于指導臨床合理用藥具有重要意義，并為應對耐藥性問題提供了關鍵信息。由于ICU 患者病情較為嚴重，患者機體免疫力較差，因此使用抗生素種類較多，易增加耐藥菌的出現。

本研究觀察到，僅慶大霉素、阿米卡星、替加環素、復方新諾明對細菌有敏感性，而碳青霉烯類、頭孢類及喹諾酮類藥物的耐藥性為100%。而在馬孝煜等[8]研究結果中表明，耐青霉烯類肺炎克雷伯菌對抗菌藥物的耐藥率可見，耐藥率最高的為氨芐西林，耐藥率為100%，其次為頭孢唑林，耐藥率為94.44%，與本研究結果不同，原因主要為本院由于存在喹諾酮類藥物的濫用現象，因此使細菌耐藥性上升。

亦有相關研究表明，含有碳青霉烯酶基因的肺炎克雷伯菌對一般的抗生素表現出較強的耐藥性，且感染此類耐碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌的患者更易造成致命性結果[9]。本研究觀察到，本院ICU的耐碳青霉烯酶類肺炎克雷伯菌均攜帶KPC-2 的編碼基因，其與宋國濱等[10]研究結果相似，在其研究中，4 個ICU 病房內的耐青霉烯類肺炎克雷伯菌均以產KPC-2 為主。美羅培蘭等抗菌藥物對革蘭氏陰性桿菌的多重感染具有較好臨床療效。碳青霉烯類抗菌藥的耐藥機制為產KPC-2，其可水解青霉素類、碳青霉烯類等抗菌藥，碳青霉烯酶是一種Bush-2f Ambler-A 類型的β-內酰胺酶，其可有效水解β-內酰胺結構，是造成肺炎克雷伯菌耐藥的重要因素[10]。本研究觀察到，46 株耐碳青霉烯酶類肺炎克雷伯菌的mCIM 聯合eCIM 試驗結果與碳青霉烯酶基因檢測結果符合率為100%。說明mCIM 聯合eCIM 試驗對篩選菌株產生碳青霉烯酶具有顯著作用，其對于臨床用藥具有重要意義[11]。本研究觀察到，經同源性分析結果可見，本院ICU 分離的耐碳青霉烯酶類肺炎克雷伯菌中相同克隆型內菌株之間具有極高相似性，表明此類菌株由兩個主要克隆型的克隆播散造成。分析原因主要為，醫院ICU治療環境相較于其他科室較為封閉，且醫院人力資源有限，若在對患者進行治療時若未能夠根據無菌操作嚴格執行，則細菌在溫和、封閉環境下極易出現增殖傳染情況[12-13]。此外ICU 轉入其他科室的患者也會攜帶細菌造成細菌傳播情況。

綜上所述，產絲氨酸碳青霉烯酶是造成ICU 分離耐青霉烯類肺炎克雷伯菌的耐藥機制，酶基因為KPC-2 型，且本院重癥醫學科存在耐碳青霉烯肺炎克雷伯的克隆傳播。因此醫院醫護人員應及時隔離感染患者，強化相關無菌操作及無菌意識，盡可能預防醫院感染的發生。但本研究不足之處在于，由于研究時間及研究經費等原因，46 株耐青霉烯類肺炎克雷伯菌菌株中僅17 株實施了同源分析。