華西廣醫1號急性毒性、鼻黏膜刺激性和增強免疫功能的研究

楊寧, 李軼, 彭成, 張明, 謝曉芳*

(1.廣安市人民醫院, 廣安 638001; 2.成都中醫藥大學/西南特色中藥資源國家重點實驗室, 成都 611137;3.南充市中醫醫院制劑中心, 南充 637000)

呼吸道感染(respiratory tract infection, RTI)是人類最常見、發病率最高的一大類疾病, 2018年的研究報道,在美國癥狀性流感的年發病率在3%～11%,兒童發病率最高[1];而針對中國2015—2020年的法定傳染病的一項疫情分析顯示,流感以年發病率77.178 5/10萬排在年均發病率第4位,僅次于手足口病、病毒性肝炎和其他感染性腹瀉[2]。當前,疫苗接種是預防呼吸道感染,尤其是傳染性病毒感染的最有效辦法之一,然而由于致病病毒種類多、變異快等原因,還有許多RTI暫無疫苗可用,此時可增強機體免疫功能的藥物成為防治RTI研究方向。霧化給藥是防治呼吸道感染的局部用藥方式,霧化的藥物通過口腔、鼻腔黏膜血管的吸收,或藥物直接到達咽、喉、支氣管等靶器官,作用迅速,且能避免肝臟的首過效應[3-4],尤其是近年來有關霧化裝置的研究與發展很迅速[5],及近三年在新型冠狀病毒感染性肺炎疫情的全球防治發展下,使霧化制劑研發成為新熱點。傳統中藥湯劑存在煎煮不便和胃腸道刺激等不良反應,而中藥霧化給藥方便,不良反應少,尤其是可避免口服給藥的胃腸道刺激,避免患者對傳統中藥湯劑味苦的不適,臨床使用廣泛[6-7]。本文研究基于此優點對院內常用于治療RTI相關處方進行數據挖掘,擬定華西廣醫1號處方并進行制劑開發。該品種的功效解毒祛濕,益氣固表,擬用于防治上呼吸道感染,如預防感冒、流行性感冒、新冠肺炎病毒感染等,以滿足臨床需求。若能開發成功且有較好的預防作用,將對保障全球公共衛生安全和人類健康有重要意義。

中醫認為疾病的發生是正氣虛損、邪氣侵襲所致,故早在《黃帝內經·素問》就有“正氣存內,邪不可干”的認識,即人體正氣充足,衛外有固,則外邪不得侵襲。玉屏風散首載于南宋張松《究原方》,由防風、黃芪、白術三味中藥組成,功效為益氣固表止汗,因其功效似御風屏障,珍貴如玉,故名玉屏風[8]。現代研究證實,玉屏風散含有黃酮、皂苷、揮發油、多糖等成分,具有調節免疫、抗炎、抗疲勞、抗呼吸系統疾病等作用[9-10]。在臨床上玉屏風散用于小兒反復性呼吸道感染可縮短病程、降低復發率并增強免疫功能,相對而言,匹多莫德、轉移因子口服液等化學藥品對反復上呼吸道感染無降低復發率的作用[11-12],可能是因為玉屏風散是通過多成分、多靶點發揮作用使然,有開發為預防上呼吸道感染的可能。

鑒于目前暫無定位為預防上呼吸道感染的霧化中成藥,廣安市人民醫院以霧化劑為擬開發制劑,完成了廣醫1號的藥學研究。按照中藥新藥的開發要求,需進行系統的臨床前有效性和安全性評價。為后續研發是否開展及開發方向提供參考,按照國家新藥開發的相關要求[13-14],并結合其防治感染的臨床定位,現對華西廣醫1號開展急性毒性試驗、鼻黏膜刺激性試驗和增強免疫功能的活性評價,以期為該院內制劑的進一步開發和臨床預試驗提供科學依據。

1 實驗材料與設備

1.1 實驗材料

華西廣醫1號為深褐色液體,由南充市中醫醫院制劑中心提供,批號20220301,藥物含量:每1 mL相當于原生藥 0.68 g;臨床上用生理鹽水稀釋10倍后使用。留樣標本存放于西南特色中藥資源國家重點實驗室。玉屏風口服液,湖北東信藥業有限公司,批號211102。生脈飲口服液,北京同仁堂生產,批號20260425。貞芪扶正膠囊,甘肅扶正藥業科技股份有限公司,批號J20210605,每12粒膠囊相當于生藥25 g,實驗前用純水配置成0.5 g/mL溶液備用。環磷酰胺,SIGMA-ALORICH公司,批號LRAC0295,用生理鹽水配成5 mg/mL使用。

1.2 受試動物

昆明種小鼠,SPF級,雌雄各半,3周齡;昆明種小鼠,SPF級,雌雄各半,18～22 g;SD大鼠,SPF級,雌雄各半,180～200 g,均由成都中醫藥大學實驗動物中心提供,生產許可證號:SCXK(川)2019-11;豚鼠,普通級,雌性,280～300 g,由壁山區騰鑫養殖場生產,生產許可證號:SCXK(渝)2017-0010。實驗動物飼養于成都中醫藥大學藥學院實驗動物房,使用許可證號:SCXK(川)2020-124。

1.3 實驗試劑

印度墨汁,Scientific Phygene公司生產,批號180625。5%雞紅細胞,南京森貝伽生物科技有限公司,批號20220528。血清溶血素補體的制備:取2只健康、成年雌性豚鼠,麻醉后經腹主動脈取血,3 500 r/min離心15 min,取血清混合,即得血清溶血素補體,于-80 ℃分裝保存。試驗前用無菌生理鹽水稀釋成10%使用。

1.4 實驗儀器

403壓縮空氣式霧化器(江蘇魚躍醫療設備股份有限公司);YLS-8A小動物霧化箱(濟南益延科技發展有限公司);移液器(德國eppendorf股份公司);Cytation 5細胞成像微孔板檢測系統(美國伯滕儀器有限公司);AL104電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司);Allegra X-30R高速冷凍離心機(德國貝克曼);BC-5120全自動血液細胞分析儀(邁瑞); Eclipse Ci-L正置顯微鏡(日本Nikon)。

2 實驗方法

2.1 華西廣醫1號對小鼠急性毒性的影響

取昆明小鼠40只,雌雄各半,按體重隨機分為空白組和給藥組,每組20只。禁食不禁水14 h后,將小鼠置于霧化箱內霧化吸入0.34 g/mL藥液30 min,24 h內共4次(相當于34生藥g/kg),每次間隔6 h。空白組給予霧化吸入生理鹽水。每次霧化給藥后,立即取出小鼠,置于正常飼養環境,觀察其一般狀態及死亡情況,記錄異常變化的表現和時間,給藥后連續觀察14 d。于第1、3、7、14天稱體重,并測量第2、3、7、14天攝食量。在第14天小鼠禁食12 h后脫頸處死,大體解剖觀察內臟情況,并剖取心、肝、脾、肺、腎,稱質量計算臟器系數。

2.2 大鼠鼻黏膜刺激性試驗

取SD大鼠24只,雌雄各半,按體重隨機分為正常對照組和 廣醫1號高、低劑量組,每組8只大鼠。禁食不禁水12 h后開始給藥。正常對照組每日經右側鼻孔以移液器連接PE軟管定量滴入30 μL生理鹽水, 廣醫1號高、低劑量組大鼠以相同給藥方式分別給予0.34、0.068 g/mL藥液30 μL,每日1次,連續7 d。每次給藥后,觀察大鼠是否出現噴嚏、撓鼻、甩頭等行為。第7天給藥1 h后,每組隨機取4只大鼠,雌雄各半,脫頸處死,剪開鼻腔取鼻中隔黏膜,用生理鹽水洗凈血塊及黏液,放置于多聚甲醛溶液中4 ℃保存,HE染色,光學顯微鏡下觀察。剩余大鼠正常喂飼,不再給藥,于第10天同上處死,剖取鼻中隔觀察并進行病理組織學檢查。

2.3 幼齡小鼠免疫調節試驗

取三周齡的昆明種小鼠50只,雌雄各半,按體重隨機分為正常對照組、玉屏風散組和 廣醫1號高、中、低劑量組,每組10只。正常對照組霧化生理鹽水30 min/次,玉屏風散組給予灌胃玉屏風口服液10 mL/kg每日1次, 廣醫1號高、中、低劑量組均給予0.068 g/mL的廣醫1號藥液霧化分別為60、30、15 min/次,相當于5.10 g生藥/kg、2.55 g生藥/kg、1.275 g生藥/kg;每天霧化3次,每次間隔6 h,連續給藥7 d;玉屏風散組每日灌胃1次,10 mL/kg。末次給藥后24 h,將小鼠處死,剖取脾臟和胸腺稱重,計算臟器指數。

2.4 環磷酰胺致免疫抑制小鼠巨噬細胞吞噬功能試驗

取昆明小鼠48只,雌雄各半,按體重隨機分為正常對照組、模型對照組、生脈飲組和 廣醫1號高、中、低劑量組,每組8只。正常對照組腹腔注射生理鹽水10 mL/kg,其余各組均腹腔注射環磷酰胺50 mg/kg,連續2 d,從第3天起隔日注射1次,連續至第10天。從造模第1天開始,正常對照組和模型對照組給予生理鹽水霧化吸入,30 min/次,每天3次;生脈飲組灌胃生脈飲口服液10 mL/kg,每天1次,廣醫1號高、中、低劑量組均給予0.068 g/mL的廣醫1號藥液霧化吸入,分別為60、30、15 min/次;霧化給藥每天3次,每次間隔6 h,給藥劑量分別為5.10 g生藥/kg、2.55 g生藥/kg、1.275 g生藥/kg連續給藥10 d。第11天上午,各組小鼠眼眶后靜脈叢取血,采用血細胞分析儀測定外周血中WBC、RBC和HGB水平;當日下午進行巨噬細胞吞噬碳粒廓清測試:每只小鼠尾靜脈注射墨汁(印度墨汁1∶3生理鹽水稀釋)0.1 mL/10 g,于注射墨汁后第2分鐘(t1)、第10分鐘(t2)時,眼眶取血20 μL,置入2 mL 1% Na2CO3溶液試管,搖勻,在680 nm波長處測OD值分別為OD1、OD2。10 min時處死小鼠,剖取肝、脾、胸腺稱重,計算吞噬指數α及臟器指數。

臟器指數=臟器重量/體重

(1)

(2)

2.5 環磷酰胺致免疫抑制小鼠血清溶血素試驗

取昆明小鼠60只,雌雄各半,按體重隨機分為正常對照組、模型對照組、貞芪扶正組和廣醫1號高、中、低劑量組,每組10只小鼠。環磷酰胺免疫抑制小鼠模型制備方法及廣醫1號高、中、低劑量組給藥劑量、方式均同2.4節,貞芪扶正組灌胃貞芪扶正膠囊5 g/kg,每日1次。于實驗第5天,各組小鼠腹腔注射5%雞紅細胞0.2 mL/只致敏;實驗第10天末次給藥1 h后,各組小鼠均眼眶取血,離心取血清,用生理鹽水稀釋100倍。取稀釋血清1 mL、5%雞紅細胞0.5 mL、10%補體0.5 mL混勻,37 ℃保溫30 min后置冰上終止反應,再離心取上清,540 nm波長測OD值,作為溶血素生成值。

2.6 數據統計分析

采用SPSS 26.0統計軟件進行數據分析;計量資料以均數±標準差表示;數據符合正態分布且方差齊,多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),組間的兩兩比較采用LSD-t檢驗;以P<0.05為差異具有統計學意義。不符合正態分布且方差不齊時,采用非參數Kruskal-WallisH檢驗進行比較。

3 實驗結果

3.1 小鼠急性毒性試驗

第一次給藥后,給藥組小鼠有豎毛,10 min后消失;第二次、第三次給藥時可見部分小鼠鼻尖略紅,但無其余不適,鼻尖紅在1 h內緩解;繼續觀察14 d,無明顯不適反應。對兩組小鼠的體重進行統計結果如表1所示,試驗期間雌性小鼠或雄性小鼠的空白組和給藥組間無顯著性差異;雌雄合并統計表2顯示,給藥后第2天,給藥組雄性小鼠的攝食量較空白組有降低,至第2天開始,空白組與給藥組的平均攝食量相近。大體解剖觀察無明顯異常,由表3可知,給藥組肝、心、脾、肺、腎指數與空白組比較無異常。

表1 廣醫1號急性毒性試驗對小鼠體重的影響Table 1 Effect of Guangyi No. 1 on body weight of mice in acute toxicity test

表2 廣醫1號急性毒性試驗對小鼠攝食量的影響Table 2 Effect of Guangyi No. 1 on food intake of mice in acute toxicity test

表3 廣醫1號急性毒性試驗對小鼠重要臟器的臟器指數影響Table 3 Effect of Guangyi No.1 on key organ indexes of in mice in acute toxicity test

綜上可見,廣醫1號以0.34 g/mL濃度在24 h內霧化給藥4次,每次0.5 mL/只給藥,給藥劑量為34 g生藥/kg,無明顯急性毒性。

3.2 華西廣醫1號對大鼠鼻黏膜刺激性的影響

每日給藥后,兩組大鼠均在給藥時有短暫的噴嚏、撓鼻反應,但均在5 min內緩解,與正常對照組比較,廣醫1號高、低劑量組的反應稍強,無其他不適反應。

于給藥第7天后各組取部分大鼠解剖鼻黏膜,正常對照組無分泌物和充血反應,廣醫1號高劑量組個別大鼠鼻腔中有分泌物,鼻中隔黏膜稍有充血;停藥3 d后剩余大鼠解剖無異常。病理組織學檢查顯示,無論給藥7 d末還是停藥3 d末,正常對照組大鼠鼻黏膜上皮細胞排列規則緊密,固有層結締組織膠原纖維排列規則;給藥7 d末,廣醫1號低劑量組大鼠在給藥7 d末和停藥3 d末,鼻中隔黏膜亦均無明顯異常;廣醫1號高劑量組大鼠在給藥7 d末時,鼻黏膜偶見炎性細胞浸潤,至停藥3 d末無異常,結果如圖1所示。參考文獻的評分標準[15]進行評分:無改變或無明顯改變為0分;輕度充血,少量分泌物為1分;中度充血,分泌物較多為2分;重度瘀血,水腫,分泌物很多,黏膜變性為3分。結果如表4所示,兩個給藥組與正常對照組間無顯著性差異。

HE染色,Bar=100 μm,200×,紅色箭頭:炎性細胞圖1 廣醫1號對大鼠鼻中隔黏膜形態學的影響Fig.1 Effect of Guangyi No.1 on histomorphology of nasal mucosa in rats

表4 廣醫1號對大鼠鼻中隔黏膜形態學評分的影響Table 4 Effect of Guangyi No.1 on histomorphological scores of nasal mucosa in rats

3.3 華西廣醫1號對幼齡小鼠免疫功能的影響

由表5可知,與正常對照組比較,玉屏風散組和廣醫1號高劑量組的胸腺指數有升高趨勢,各組對脾臟指數無明顯升高作用。

表5 廣醫1號對幼齡小鼠胸腺和脾臟指數的影響Table 5 Effects of Guangyi No.1 on organ indexes of thymus and spleen in immature mice

3.4 華西廣醫1號對免疫抑制小鼠巨噬細胞吞噬功能的影響

由表6和表7可知,與正常對照組比較,模型對照組吞噬指數K和校正指數α均有降低趨勢,但無統計學意義,胸腺指數和外周血WBC數量顯著下降(P<0.01)。與模型對照組比較,生脈飲組的吞噬指數K和校正指數α均無升高,但胸腺指數顯著升高(P<0.001), 廣醫1號高、中劑量組的噬指數K和校正指數α有升高趨勢,三個劑量組的胸腺指數有升高趨勢,但均無統計學意義。與模型對照組比較,廣醫1號高、中劑量組的WBC、HGB均有升高趨勢,高劑量組的RBC也有升高趨勢;生脈飲對WBC、RBC、HGB均有升高趨勢,但均無統計學意義。

表6 廣醫1號對免疫抑制小鼠吞噬指數和胸腺指數的影響Table 6 Effects of Guangyi No.1 on phagocytic index and thymus index in immunosuppressed mice

表7 廣醫1號對免疫抑制小鼠外周血WBC、RBC和HGB的影響Table 7 Effect of Guangyi No.1 on WBC, RBC, and HGB contents of peripheral blood in immunosuppressed mice

3.5 華西廣醫1號對免疫抑制小鼠血清溶血素生成的影響

由表8可知,與正常對照組比較,模型對照組吸光度顯著降低(P<0.05)。與模型對照組比較,廣醫1號中劑量組吸光度顯著升高(P<0.05),提示廣醫1號可增強免疫抑制小鼠免疫力;貞芪扶正組和廣醫1號高、低劑量組有也升高趨勢。

表8 廣醫1號對免疫抑制小鼠血清溶血素生成的影響Table 8 Effect of Guangyi No.1 on serum hemolysin production in immunosuppressed mice

4 討論與結論

藥物安全性與有效性是藥物的基本屬性,也是藥物開發時必須進行的重要研究內容。廣醫1號是由中藥經典名方“玉屏風散”化裁處方制備的制劑,擬臨床霧化給藥,用于預防上呼吸道感染,以提高群體,尤其是易感體質人群對病原微生物侵襲的防御能力。針對其擬臨床擬用劑型、劑量和適應癥,本研究對其進行急性毒性試驗、鼻黏膜刺激性試驗和增強免疫功能試驗,以初步評價其安全性和有效性。

急性毒性是指機體在24 h內一次或多次接觸外來藥物后所引起的中毒效應,被認為是藥物安全性評價的第一步[16]。參考《中藥、天然藥物急性毒性研究技術指導原則》《中藥、天然藥物刺激性和溶血性研究的技術指導原則》等的要求,本研究開展了廣醫1號的小鼠急性毒性試驗和大鼠鼻黏膜刺激性試驗。經預試,0.68 g/mL藥液太過濃稠,無法進行霧化,經無菌生理鹽水稀釋后的0.34 g/mL可進行霧化,故以此為最高濃度進行急性毒性試驗。結果顯示,24 h內三次霧化吸入,除有短暫的豎毛、鼻尖紅外,無其他不適反應。外來藥物的毒性可能會引起動物拒食造成體重停止增長,甚至減輕。本藥對體重、攝食量無明顯影響,經觀察14 d無明顯不良反應,亦無死亡,故對廣醫1號霧化給藥對小鼠的最大給藥量為34 g生藥/kg。藥物可對吸收部位具有刺激性,引起不良反應,故對本藥進行大鼠鼻黏膜刺激性試驗,0.34 g/mL廣醫1號滴鼻大鼠右側鼻腔,僅給藥時有短暫噴嚏、撓鼻反應,病理結果顯示個別大鼠鼻中隔黏膜有少量炎性細胞浸潤、輕度充血;停藥3 d后無明顯病理變化;0.068 g/mL組大鼠鼻黏膜無明顯變化,提示廣醫1號在高濃度時對鼻黏膜有輕度刺激性,但停藥后可恢復;擬用臨床濃度無明顯鼻黏膜刺激性。綜上,本藥霧化給藥,無明顯急性毒性和黏膜刺激性,可認為本藥臨床應用具有一定的安全性。

中藥 “益氣固表”功效常與免疫系統有關的特點,認為本藥可能具有增強免疫功能,是其防治上呼吸道感染的原理之一。據此,本文研究進行了幼齡小鼠免疫器官測定和免疫抑制小鼠試驗。免疫系統主要由免疫器官、免疫細胞、免疫活性物質組成,免疫器官的質量如胸腺、脾臟、肝臟是衡量機體免疫功能的指標之一[17]。巨噬細胞屬于免疫細胞,當外來抗原進入機體能迅速將其吞噬和清除,巨噬細胞的吞噬能力是衡量機體非特異性免疫功能的指標之一[18-19]。血清溶血素屬于免疫活性物質,由B淋巴細胞增殖分化為的漿細胞分泌的,其含量是衡量機體體液免疫功能的指標之一[20-21]。環磷酰胺是常用的免疫抑制劑,可對機體白細胞和淋巴細胞造成一定損害,用于誘導小鼠免疫抑制模型較成熟[22]。研究表明,環磷酰胺能夠抑制淋巴細胞增殖和免疫器官發育,還能殺傷細胞毒性T細胞分化所需的輔助細胞,進而減少免疫細胞數量、降低抗體水平[23-24]。 在本次實驗中小鼠經環磷酰胺注射后,從外部特征看小鼠毛發稀疏無光澤、手感體溫降低、行動遲緩,可能處于免疫抑制狀態;從內部特征看,小鼠免疫器官發育受到抑制,白細胞數目和抗體水平降低,可認為本次實驗成功利用環磷酰胺誘導創建小鼠免疫抑制模型通過增強機體免疫力而預防上呼吸道感染具有意義,同時也符合“正氣存內,邪不可干”的病機認識。現代研究發現玉屏風散能緩解地塞米松致小鼠自然殺傷細胞、巨噬細胞活性降低以及胸腺指數、脾指數降低,并升高白細胞和淋巴細胞含量,降低中性粒細胞含量,升高CD4+/CD8+比值,提示玉屏風散能增強免疫低下小鼠的細胞免疫和非特異性免疫功能[25]。有效物質基礎可能與類黃酮、皂苷、香豆素等成分通過調節免疫系統發揮作用有關[26]。華西廣醫1號在玉屏風散基礎方上加味芳香化濕代表藥藿香發揮增效作用,現代研究發現廣藿香具有抗病毒和調節免疫作用而用于呼吸道疾病[27-28],支持本方的組方。本文研究顯示,廣醫1號在0.068 g/mL下霧化給藥,對正常幼齡小鼠免疫器官胸腺和肝臟指數無明顯影響,提示該藥對正常機體免疫系統可能無明顯作用,不會引起機體免疫系統亢進。相對而言,廣醫1號可顯著增強免疫低下小鼠的溶血素生成水平,并有增加其碳粒廓清吞噬指數K、校正指數α、胸腺指數及其外周血白細胞數目的作用趨勢,表明該藥能對抗環磷酰胺所致的免疫功能下降,增強體液免疫功能。

綜上,華西廣醫1號無明顯急性毒性和鼻黏膜刺激性,對正常小鼠免疫功能無明顯影響,對免疫抑制小鼠可升高溶血素水平、胸腺指數、增加白細胞數目的作用,表明其霧化給藥具有較好的安全性,并有溫和的提高免疫功能的作用,適用于預防上呼吸道感染。本文研究為華西廣醫1號的進一步開發和臨床預試驗提供了科學依據,后續還需要進行系統的安全性評價,尤其是體內體外抗病毒作用研究和機制研究,促進其開發和推廣。