子癇前期患者胎盤組織中缺氧誘導因子-1α表達及其與血管生成的關系

李靜亞,蔡素霞,張廣裕

(洛陽市婦幼保健院 a.病理科;b.產房,河南 洛陽 471099)

子癇前期為妊娠期特發(fā)的高血壓疾病,以妊娠20周后新發(fā)高血壓及蛋白尿為主要特點,病情可持續(xù)進展,甚至引起凝血功能障礙和終末器官功能障礙[1]。研究表明,血管內皮細胞受損、子宮-胎盤血管結構異常及炎癥免疫的過度激活均可能與子癇前期的發(fā)生有關[2-3]。胎盤組織中的血管可給予胎兒足夠的營養(yǎng)物質和氧氣,若血管生成存在異常,會導致胎兒無法正常發(fā)育。因此,需要分析與胎盤組織血管生成有關的指標,根據(jù)相關指標對子癇前期患者作出治療的指導干預,從而促進良性妊娠結局。缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)為介導細胞參與缺氧反應的重要轉錄調控因子,通過對下游多種靶基因調控可參與細胞增殖和遷移、機體血管生成及細胞凋亡等過程[4]。因此,推測胎盤組織中HIF-1α的表達可能與子癇前期血管生成有關。

1 資料與方法

1.1 一般資料

前瞻性選取2019年1月至2023年1月于洛陽市婦幼保健院接受治療并成功分娩的80例子癇前期患者,另外選取50例同期健康孕婦為對照組。所有孕婦及其家屬均簽署知情同意書,本研究經醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核批準。

參照第9版《婦產科學》[5]中重度子癇前期的相關內容:(1)血小板減少,血小板<100×109·L-1;(2)收縮壓≥160 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)或舒張壓≥110 mmHg;(3)腎功能損害;(4)出現(xiàn)持續(xù)性上腹或右上腹嚴重疼痛,肝功能損害,無法用其他疾病解釋或二者均存在;(5)新發(fā)生的視覺障礙或中樞神經系統(tǒng)異常;(6)肺水腫。將符合上述任何一種表現(xiàn)的患者納入重癥組,其余患者納入輕癥組。

輕癥組共納入48例患者,年齡25～35歲,平均(30.15±2.36)歲;體重51～73 kg,平均(62.43±5.74)kg;確診孕周24～32周,平均(28.47±1.95)周。重癥組共納入32例患者,年齡23～34歲,平均(29.05±2.17)歲;體重50～72 kg,平均(62.51±4.84)kg;確診孕周25～33周,平均(29.36±2.04)周。對照組年齡26～33歲,平均(29.54±2.44)歲;體重52～74 kg,平均(63.54±5.83)kg;確診孕周 25～31周,平均(28.37±2.13)周。3組一般資料比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

納入標準:子癇前期孕婦符合子癇前期診斷標準[6];單胎妊娠;交流能力正常;依從性良好,可配合完成此次研究。排除標準:患有其他妊娠并發(fā)癥,如異位妊娠、妊娠急性脂肪肝等;患有傳染性疾病;患有精神病或交流障礙;患有心臟病。

1.2 胎盤組織標本準備

于孕婦分娩后,避開梗死和鈣化區(qū),在胎盤中心母體面取約2 cm×2 cm×2 cm全層胎盤組織為標本,標本獲取后用生理鹽水沖洗分為2份,其中一份使用體積分數(shù)為4%的甲醛水溶液固定,用免疫組化檢測,并通過CD34雙標法檢測胎盤組織的微血管密度。另一份置于RNA酶滅活凍存管中,使用液氮速凍,隨后保存在-80 ℃的密閉環(huán)境。

1.3 免疫組化檢測

用石蠟將體積分數(shù)為4%的甲醛水溶液固定的胎盤組織標本脫水后包埋并切片,行免疫組化染色,檢測HIF-1α水平(鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法),試劑盒由上海酶聯(lián)生物科技公司提供。應用不同高倍視野分別觀察組織切片,陽性標準為細胞中出現(xiàn)較清晰的棕黃色顆粒。判定染色強度分值:3分為細胞中出現(xiàn)大量棕黃色顆粒,2分為細胞中出現(xiàn)較多棕黃色顆粒,1分為細胞中出現(xiàn)少量棕黃色顆粒,0分為細胞中未出現(xiàn)棕黃色顆粒。判定觀察到的陽性細胞占比分值:4分為占比>80%,3分為占比60%～80%,2分為占比40%～60%,1分為占比20%～40%,0分為占比<20%。將染色強度分值與陽性細胞占比分值相乘,陰性記0分,弱陽性記1～4分,陽性記5～8分,強陽性記9～12分。強陽性和一般陽性為HIF-1α高表達,弱陽性和陰性為HIF-1α低表達。

1.4 RT-PCR檢測

將RNA酶滅活凍存管中的胎盤組織標本取出,采用逆轉錄-聚合酶鏈反應擴增引物,使用總RNA抽提試劑TRIZOL提取胎盤組織總RNA,將β-actin作為參照物,取5 μL PCR產物在瓊脂糖凝膠中電游,檢測胎盤組織中的HIF-1αmRNA,HIF-1α基因引物序列見表1。

表1 HIF-1α基因引物序列

1.5 凝血指標檢測

3組孕婦入組后,采集空腹靜脈血5 mL放置在抗凝管內,使用鴻恩H1203全自動凝血分析儀檢測血漿凝血酶原時間(prothrombin time,PT)、活化部分凝血活酶時間(activated partial thromboplastin time,APTT)、纖維蛋白原(fibrinogen,Fib)指標水平。

1.6 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 微血管密度

對照組孕婦胎盤組織的微血管密度最高,輕癥組次之,重癥組最低,組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 3組孕婦胎盤組織微血管密度對比

2.2 HIF-1α mRNA和凝血指標

重癥組HIF-1αmRNA、Fib水平高于輕癥組和對照組,且輕癥組高于對照組;重癥組APTT、PT低于輕癥組和對照組,且輕癥組低于對照組,組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 3組胎盤組織HIF-1α mRNA和凝血指標對比

2.3 HIF-1α蛋白免疫組化表達

3組胎盤組織中均有HIF-1α陽性表達,重癥組HIF-1α總陽性表達率高于輕癥組與對照組,輕癥組高于對照組,組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 3組胎盤組織中HIF-1α陽性檢出情況比較(n,%)

2.4 胎盤組織中HIF-1α表達與血管生成的相關性分析

經雙變量相關性分析檢驗結果顯示,子癇前期患者胎盤組織中HIF-1α相對表達量與血管生成(微血管密度)呈負相關(r=-0.938,P<0.001)。

3 討論

子癇前期屬于妊娠期高血壓疾病的一種,目前,疾病病因和具體發(fā)病機制尚未完全明確,通常認為是多因素、多機制及多通路導致的疾病[7]。妊娠期孕婦血壓升高導致血管阻力變大,胎盤血流變少,容易引起孕婦血管病變和內皮功能障礙,增加胎盤病變和發(fā)生子癇前期的風險[8]。子癇前期患者的胎盤組織中血管生成呈現(xiàn)異常狀態(tài),容易引起胎盤缺血、缺氧,并釋放多種誘發(fā)炎癥反應的胎盤因子[9-10]。

本研究結果顯示,重癥組孕婦胎盤組織中的微血管密度低于輕癥組和對照組,且輕癥組孕婦低于對照組,表明子癇前期患者病情越重,胎盤組織中血管生成情況越差。因胎盤的血管是為胎兒提供營養(yǎng)物質的關鍵介質,因此分析可能與血管生成有關的指標較為關鍵。APTT、PT、Fib 凝血指標是判斷機體凝血功能狀態(tài)和凝血酶活性的標準,可反映患者體內凝血因子和纖維蛋白原釋放量[11]。子癇前期患者的凝血功能障礙,會增加胎盤組織中血管被堵塞的分險,不利于血管生成[12]。本研究結果顯示,重癥組孕婦APTT、PT水平低于輕癥組和對照組,輕癥組低于對照組,而重癥組孕婦Fib水平高于輕癥組和對照組,輕癥組高于對照組,表明子癇前期患者體內凝血-抗凝血系統(tǒng)存在紊亂現(xiàn)象,血液處于高凝狀態(tài)。但由于患者體內凝血因子的水平還受到飲食、藥物、自身免疫力等多種因素的影響,若單純將其用于子癇前期患者胎盤組織中血管生成的評價可能準確性不高,所以本研究未將其作為主要的指標進行研究。

HIF-1α參與了體內細胞代謝、血管功能調節(jié)的過程,是機體適應缺氧環(huán)境的主要調節(jié)因子[13]。HIF-1α異常過表達時,會控制組織內的細胞增殖,抑制胎盤滋養(yǎng)細胞的發(fā)育[14]。因此,推測HIF-1α表達可能與胎盤組織中的血管生成有關。本次研究發(fā)現(xiàn),重癥組HIF-1αmRNA表達水平高于輕癥組和對照組,輕癥組孕婦高于對照組,同時重癥組孕婦HIF-1α總陽性表達率高于輕癥組和對照組,輕癥組孕婦高于對照組。這表明在子癇前期患者中,HIF-1α呈現(xiàn)異常過表達,且隨著患者病情加重,這種過表達的情況更為明顯。分析原因,HIF-1α作為介導細胞參與缺氧反應的重要轉錄調控因子,能夠和細胞中穩(wěn)定表達的HIF-1β結合成具有高度活性的二聚體,參與胎盤組織中缺氧反應的表達,穩(wěn)定缺氧環(huán)境,造成胎盤缺血情況更加嚴重[15]。HIF-1α還能夠控制細胞因子分泌,對胎盤滋養(yǎng)細胞功能產生影響,子癇前期患者體內的胎盤因子有可能是受到HIF-1α刺激而釋放出來,導致血管內皮損傷加劇,從而嚴重影響胎盤組織中的血管生成,加重了子癇前期患者的病情[16]。為進一步明確HIF-1α相對表達量與胎盤組織中微血管密度的關系,本研究進行了雙變量相關性分析檢驗,結果顯示,子癇前期患者胎盤組織中HIF-1α相對表達量與微血管密度呈負相關,證明在胎盤組織中高表達水平的HIF-1α與血管生成有關,或可通過導致胎盤組織缺氧缺血,引起胎盤缺血和血管損傷,繼而誘發(fā)血管生成異常。

4 結論

HIF-1α在子癇前期患者的胎盤組織中高表達,且表達水平和血管生成呈負相關,與患者子癇前期病情嚴重程度有關。